Modulo appunti di Fisiopatologia e fondamenti di terapia biotecnologica

Malattie neurodegenerative

Demenze

- Malattia di Alzheimer

- Demenze fronto-temporali (FTD)

Malattie del motoneurone

- Sclerosi laterale amiotrofica (SLA), che è una malattia del motoneurone piuttosto rara

- Malattia di Kennedy o atrofia spino-bulbare muscolare (SBMA), che è una malattia da triplette

- Atrofia spinale muscolare (SMA), che è una malattia infantile

Le malattie sono caratterizzate da specificità di degenerazione di un’area o di un tipo di neurone. Per esempio vediamo che:

• Nel Parkinson sono i neuroni dopaminergici presenti nella sostanza nigra ad andare incontro a degenerazione
• Nella SLA degenerano i motoneuroni e quindi sono interessati la corteccia motoria e il midollo spinale
• La demenza fronto-temporale, come dice il termine stesso, interessa soprattutto le aree fronto-temporali
• L’Alzheimer, che è sempre un tipo di demenza, interessa più i lobi temporo-parietali
• Nell’Huntington i neuroni interessati dalla degenerazione sono quelli presenti nei gangli della base

Variabilità di insorgenza

• Infanzia: SMA, alcune forme di paraparesi spastica
• Età adulta: SLA, demenza fronto temporale, alcune forme di paraparesi spastica
• Vecchiaia: Alzheimer e Parkinson

Incidenza delle patologie

• Comuni (incidenza 1:1000/1:10.000): Alzheimer, Parkinson e SMA
• Rare (incidenza 1:100.000): SLA, alcune forme di paraparesi spastica

Eziologia

• Sporadiche: Alzheimer, Parkinson, SLA → nel 90% dei casi sono malattie sporadiche, nel 10% dei casi invece sono forme familiari.
• Ereditarie: malattia di Kennedy, SMA e paraparesi spastica

Nella malattia di Kennedy e nella SMA c’è un gene responsabile della patologia, mentre nelle paraparesi spastiche sono tantissimi. La demenza fronto-temporale (FTD) si pone a ponte: il 40% è di tipo ereditario e il 60% è di tipo sporadico. Quindi ci sono dei geni causativi ma ci sono anche delle cause non ben definite che fanno sì che un individuo sviluppi questa patologia. I fattori ambientali hanno un peso nell’aumentare il rischio che una persona, soprattutto nelle forme sporadiche, possa sviluppare la patologia. L’esposoma è tutto ciò che può modificare la suscettibilità genetica individuale → tutto ciò a cui un individuo è esposto che potrebbe, attraverso meccanismi epigenetici, influenzare l'espressione dei geni e contribuire a proteggere o aiutare a sviluppare una patologia (es. cibo, esercizio fisico).

Genetica

Un gene con una mutazione con effetto biologico forte causa forme familiari delle tre patologie complesse → modello di soglia di danno: la patologia si manifesta se viene superata una certa soglia di danno che può essere dato o dalla presenza di mutazioni in singoli geni con mutazione forte (rare) oppure nelle forme complesse ho la somma di tanti geni con effetti biologici piccoli.

Ho bisogno di tante varianti che spieghino le forme sporadiche come gli SNP → sono potenziali fattori di rischio: posso superare la soglia di danno senza avere mutazione in un gene forte. Bisogna tenere conto dell’esposoma che può variare la penetranza della mutazione.

Meccanismi molecolari

Vediamo la degenerazione di aree e tipi di neuroni specifici, ma i geni sono espressi in modo ubiquitario → i neuroni sono cellule molto più sensibili ai danni. I neuroni possono accumulare nel tempo danni ossidativi: sono cellule con alto consumo di energia e sono altamente metaboliche, devono avere dei sistemi di eliminazione di ROS → questi sistemi con età e fattori di rischio diminuiscono. L’accumulo eccessivo di ROS può impattare su vari pathway cellulari → le proteine non riescono più ad essere smaltite e abbiamo accumuli proteici. Abbiamo anche attivazione della neuroinfiammazione e malfunzionamento dei trasporti assonali per disorganizzazione del citoscheletro.

Il neurone è circondato da cellule astrogliali: gli astrociti danno supporto neurotrofico e la microglia rappresenta i macrofagi cerebrali. Si è dimostrato che cambiando l’ambiente esterno del neurone in degenerazione e facendo esprimere astrociti e microglia sani il neurone degenera più lentamente → potenziali approcci terapeutici.

Malattia di Alzheimer

La malattia di Alzheimer deve il nome ad Alois Alzheimer, che nel 1906 descrisse una donna di 51 anni (giovane → forma ereditaria), che manifestava delirio paranoide, afasia e disturbi della memoria importanti. La malattia di Alzheimer è uno dei disturbi neurologici più frequenti dell’età avanzata: la prevalenza è del 5% a 75 anni e arriva a essere del 50% nella popolazione oltre gli 85 anni. È una patologia legata all’invecchiamento ed è la quarta causa di decesso nella popolazione con più di 65 anni.

La diagnosi è piuttosto accurata ma, soprattutto all’inizio, si ha manifestazione di sintomi non così specifici, come perdita di memoria, perdita di orientamento spaziale etc., perciò può andare in diagnosi differenziale con altri tipi di demenza, come la Vascular dementia o la MID (mild intellectual disability). Quest’ultima è una sorta di iniziale perdita di memoria che può fermarsi in questo stato o che può evolvere e diventare Alzheimer.

Nell’Alzheimer riconosciamo una quota di tipo sporadico multifattoriale (90%) e una quota (10%) con un esordio precoce ereditaria familiare → l’età d’esordio è tra i 30 e i 50 anni.

Caratteristiche cliniche

• Perdita progressiva della memoria, prima a breve e poi anche a lungo termine
• Disturbi del linguaggio e visuo-spaziali
• Disordini del comportamento:
  • Aggressività verbale-fisica
  • Vagabondaggio
  • Agitazione
  • Comportamento sessuale inappropriato
  • Iperfagia
  • Allucinazioni
  • Depressione
  • Autolesionismo in parallelo con la severità della demenza
• Deficit neuropsicologici: prima selettivi a coinvolgere la memoria, poi a comprendere altre capacità fino al mutismo, incontinenza, allettamento in stato non responsivo (stato simil-vegetativo persistente) fino all’exitus

La sopravvivenza media è di 8-10 anni dall’esordio di malattia → broncopolmonite è frequente causa di morte.

Neuroanatomopatologia

AD all’inizio colpisce prevalentemente le aree temporo-parietali del cervello. Si ha rimpicciolimento della corteccia, l’allargamento dei ventricoli, l’ippocampo si restringe → cervello va incontro a una degenerazione. Il rimpicciolimento della corteccia e l’allargamento dei ventricoli spiegano i disturbi clinici che manifesta il paziente. A livello microscopico abbiamo la presenza di lesioni neuropatologiche extracellulari e intracellulari:

• Extracellulari: placche senili di Amiloideβ
• Intracellulari: grovigli neurofibrillari (neurofibrillary tangles) di proteina Tau fosforilata, o NFT

Eziologia

Il 90% dei casi è sporadico e il 10% è familiare. Nelle forme familiari abbiamo 3 geni principali responsabili (eterogeneità genica) e alcuni geni candidati. Per le forme sporadiche abbiamo alcuni fattori predisponenti come la trisomia del 21 e alcune forme di ApoE.

Genetica delle FAD (Early Onset)

Sono forme autosomiche dominanti, hanno insorgenza precoce (anche se variabile). I geni appartengono allo stesso pathway → sono tra loro connessi e sono APP, PSEN1 e PSEN2.

APP

Il primo gene fu scoperto nell’87 osservando che tutti i pazienti hanno accumuli di amiloide → approccio del gene candidato: si va a vedere se il gene che codifica per amiloide è mutato → APP (cr 21). Questo gene codifica per una glicoproteina di membrana → precursore amiloide che deve essere processato secondo la via non amiloidogenica:

• Via non amiloidogenica: avviene un taglio della proteina da parte di α-secretasi nello spazio extracellulare (rilascio di un peptide solubile) e poi avviene un secondo taglio da parte delle γ-secretasi che taglia nello spazio lipidico intramembrana. Si ha produzione di un peptide solubile che viene liberato verso l’esterno, di piccolo peptide p3 e di un altro peptide citosolico.
• Via amiloidogenica: tagliano le β-secretasi, che non riconoscono lo stesso sito di taglio delle α ma un sito posto più superiormente, generando il peptide solubile che è un po’ più corto. Le β, γ-secretasi tagliano sempre nello stesso punto. Questa via prevale nella cellule neuronali e tagliano in punti diversi e vengono generati diversi peptidi, sia per quanto riguarda quelli extracellulari che quelli più piccolini, mentre quello più citoplasmatico è uguale.

Dal taglio della β-secretasi si genera un peptide di 40 aa, nei pazienti con AD il segmento è di 42 aa. Fisiologicamente produciamo tanta Aβ40, che non è tossica, e in minima parte Aβ42, che ha tendenza ad aggregare. Nella AD viene sbilanciato questo processo o perché viene tagliato non in modo corretto sempre più APP e quindi si forma più Aβ42 che Aβ40, o perché il poco Aβ42 che viene comunque prodotto normalmente non viene smaltito, perché a causa del processo neurodegenerativo il neurone non riesce più a smaltire le proteine non corrette → esubero di Aβ42 che inizia ad aggregare. L’Aβ42 è un errore di processamento dell’APP fisiologico e tollerato ma che quando supera una certa soglia diventa patologico e inizia ad aggregare, formando queste placche.

Le mutazioni risiedono in hot spot mutazionali → vicino al sito di taglio della β-secretasi (esone 16) e dove c’è il sito di taglio delle γ-secretasi (esone 17, prevalenti). Mutazioni a carico del sito di taglio dell’α-secretasi determinano l’angiopatia amiloide cerebrale → l’amiloide viene depositata nei vasi sanguigni.

Preseniline 1 e 2

Fanno parte del complesso multimerico delle secretasi, sono due proteine transmembrana. Il gene presenilina 1 è quello più mutato, infatti spiega il 50% dei casi familiari.

Altri geni

I geni causativi concorrono a far sì che si produca più Amiloide 42, che è la lesione neuropatologica tipica della patologia. I tre geni partecipano allo stesso pathway → processamento del precursore della Amiloide. La via è difettiva e iniziano a prevalere i peptidi Aβ42, che iniziano ad aggregare, diventando tossici per il sistema nervoso centrale, vengono depositati all’esterno e vanno ad innescare neuro-infiammazione etc. In alcuni casi di FAD tardivo si hanno mutazioni in ADAM 10 che è una subunità della α-secretasi.

Forme sporadiche

Il 90% dei casi sono sporadici, hanno anch’essi depositi di amiloide → ci sono vari motivi per cui questa proteina inizia a depositarsi.

Fattori genetici predisponenti

• Trisomia 21: APP mappa sul cromosoma 21, quindi avere tre copie del cromosoma 21 e quindi del gene APP predispone alla produzione maggiore di peptidi Aβ42
• Polimorfismi presenti in ApoE, che è una lipoproteina presente nel sangue che è coinvolta nel trasporto dei lipidi, soprattutto del colesterolo. Mappa sul cromosoma 19 e ha degli SNP all’interno. Si riconoscono tre aplotipi: abbiamo uno SNP che cambia cys in 112 in arg, oppure in posizione 158 ci può essere una cys o un’arg → cys formano legami disolfuro, se mancano cambia la struttura della proteina. In base alla sequenza dei due SNP in posizione 112 o in posizione 158 si riconoscono tre aplotipi:
  • Cys112/Cys158 ε2
  • Cys112/Arg158 ε3
  • Arg112/Arg158 ε4

L’allele ε4 è osservato con maggior frequenza (40-50%) in tutti i casi di Alzheimer, sia familiari che sporadici. Chi ha un allele ε4 ha un rischio d 4 volte maggiore di sviluppare l’Alzheimer rispetto a un individuo che non porta quell’aplotipo. In un individuo che invece su entrambi gli alleli ha l’aplotipo ε4 il rischio aumenta 10 volte. Invece l’aplotipo ε2 è protettivo.

Identificazione di altri fattori di rischio con approccio del gene candidato

Ci sono altri fattori che predispongono allo sviluppo della patologia → si cercano varianti comuni che possano essere associati a una coorte di malati rispetto al controllo. Sono studi di associazione genica caso-controllo → devono essere varianti che non hanno effetto biologico grosso ma hanno effetto biologico tollerato. Gli SNP infatti non sono dannosi di per sé, ma SNP in particolari posizioni e soprattutto una combinazione di essi aumentano i fattori di rischio. Quindi si cercano associazioni tra SNP e rischio di malattia → studi di associazione caso controllo.

Si vanno a studiare i singoli geni candidati → gli studi pubblicati 15-20 anni fa davano risultati positivi, mentre altrettanti studi davano risultati negativi per lo stesso gene. Questo avveniva perché gli studi erano condotti su un campione ristretto.

Negli anni si sono formati consorzi per avere un numero di casi statisticamente rilevante. Fino al 2007 non c’è stata una chiara evidenza dei fattori di rischio con l’approccio del gene candidato. Il progresso tecnologico dà possibilità di analizzare tantissime sequenze (non il genoma) su dei chip miniaturizzati e quindi tantissimi SNP contemporaneamente (SNP array).

Identificazione di nuovi geni candidati con GWA

Ora si fanno di Genome-wide Association studies → non abbiamo delle ipotesi a priori su quale potrebbe essere il gene e si fa uno scanner di tutte le varianti di SNP → si va a vedere se c’è un arricchimento di alcuni SNP nella popolazione di malati rispetto alla popolazione di controllo.

Con questi chip possiamo analizzare fino a 2 milioni di SNP, per ogni chip posso analizzare in contemporanea 12 campioni. HapMap ha permesso di mappare tutti gli SNP del nostro genoma. Si vanno a scegliere i TagSNPs, cioè gli SNP rappresentativi di alcune parti del genoma → se eredito un determinato SNP eredito anche la regione circostante. Prima si fa la prima analisi per identificare gli SNP più significativi e poi faccio l’analisi vera e propria. I controlli hanno bias → non esistono controlli sani perché tutti gli individui sono predisposti allo sviluppo di qualche patologia ma più sono vecchi e non hanno patologia più sono sicura che siano un controllo (all'inizio si usavano i giovani).

I problemi sono:

• Casistiche enormi → migliaia di campioni = migliaia di controlli e di pazienti
• Necessità di repliche su popolazioni diverse
• Analisi statistica → bisogna studiare anche degli approcci statistici adeguati per interpretare i dati che escono da questi studi
• Aspetto economico → molto costosi
• Non si sa se gli SNP possano davvero essere possibili fattori di rischio genetico

Negli anni sono stati analizzati con GWA 70.000 pazienti e 380.000 controlli, si è trovato che apoE è il fattore di rischio più importante → l’aplotipo ε4 è il fattore di rischio più forte. Insieme ad ApoE sono emersi 29 possibili geni candidati di rischio che sono coinvolti in tanti pathway, di cui tre principali:

• Hanno a che fare con il metabolismo dei lipidi/del colesterolo (simili ad ApoE)
• Sono implicati nella clearance, quindi nella degradazione della βAmiloide
• Sono implicati nella risposta immunitaria

Mancano però gli studi funzionali. I fattori di rischio principali sono quindi:

• Trisomia 21
• Mutazioni cromosomiche
• Invecchiamento

NGS

Dal 2010 l’NGS ha fornito la possibilità di analizzare in parallelo tantissimi frammenti di DNA e quindi la possibilità di sequenziare potenzialmente tutto il genoma. Inizialmente si è partiti con WES (1% codificante del genoma) per poi recentemente fare WGS → cerco anche tra le sequenze non codificanti. Bisogna analizzare ed interpretare i dati prodotti. Nell’Alzheimer sono trovati dei nuovi geni causativi:

• Notch 3
• SORL 1
• PLD3
• TREM2

Diagnosi

La diagnosi è:

• Clinica
• Neuropsicologica (test cognitivi e mnesici)
• Laboratoristica → marcatori biologici

Biomarcatori

Importanza dei marcatori biologici di malattia:

• Diagnosi precoce (discriminazione importante in pazienti con Mild Cognitive Impairment)
• Intervento terapeutico precoce → più efficace rispetto al trattamento a sintomi già conclamati
• Comprensione dei meccanismi patogenetici
• Sviluppo di nuove strategie terapeutiche → valutazione dell’efficacia del farmaco sulla progressione della malattia

Abbiamo finestra di intervento tra sintomi aspecifici e sintomi specifici della patologia → più la patologia progredisce più la compromissione diventa più forte e diminuisce la finestra di intervento. I biomarcatori devono essere così precoci da identificare la finestra di intervento in modo da permettere l’intervento quando la malattia non è ancora progredita e far diminuire la progressione.

Caratteristiche di un marcatore biologico:

• Riflettere lo stato neuropatologico in corso
• Essere sempre validato in casi certi
• Sensibilità e specificità >80%
• Affidabile e riproducibile
• Presente in materiale biologico facilmente reperibile
• Semplice da misurare
• Non costoso

Bm in AD sono:

• Genetici (Familiarità): casi di Alzheimer precoci sono generalmente forme ereditarie → possiamo indagare marcatori genetici
• Biochimici: proteine misurabili
• Neuroimaging: posso fare diagnosi differenziale con altri tipi di demenze e analisi precoci

Marcatori biochimici

Bisogna sapere come la malattia si manifesta, ci sono due marcatori neuropatologici sempre presenti: placche senili di amiloide (extracellulari) e grovigli neurofibrillari di proteina tau fosforilata (intracellulari) → la proteina tau serve a stabilizzare la struttura del citoscheletro neuronale.