Modulo appunti di Fisiopatologia e fondamenti di terapia biotecnologica

Genetica

Ci sono numerosi geni coinvolti nella SLA familiare → varietà genetica, hanno differente età di esordio e di ereditarietà (AD). Il primo gene è stato identificato nel ‘93 → SOD1. Il secondo gene è stato scoperto nel 2001, a partire dal 2010 si sono scoperti numerosi geni → sequenziamento dell’esoma. E’ una patologia rara in cui fare studi di linkage è difficile → tante famiglie e tanti soggetti affetti nella stessa famiglia.

SOD1, TARDBP, FUS e C9ORF72 spiegano il 60% dei casi. Abbiamo il 30% dei casi familiari che non hanno geni causativi, ora si sta facendo whole-genome sequencing per cercare l’ereditarietà mancante → cerco varianti in geni non codificanti.

SOD1

Il gene SOD1 è stato il primo ad essere identificato, spiega il 20% dei casi familiari. Si trova sul cr 21; è AD, nel caso di una mutazione è AR. Spiega il 5% dei casi sporadici → mutazione a penetranza incompleta.

Pz con familiarità ma non si manifesta il carattere malattia; mutazione de novo. Questo gene codifica per la superossido dismutasi Cu-Zn dipendente, enzima espresso in modo ubiquitario, pp più abbondante nella cellula (97% pp del citosol), ha funzione antiox → converte gli anioni superossido (scarto metabolismo cellulare) in altre specie chimiche meno reattive come perossido diidrogeno (glutatione perossidasi catalasi converte perossido di idrogeno in acqua e ossigeno). L'enzima durante la reazione passa da forma ridotta a ossidata. Agisce come dimero, esiste anche SOD2 che è mitocondriale. Cu serve per l'attività di reduttasi, Zn aiuta a stabilire struttura secondaria ottimale.

Le mutazioni sono AD, sono missenso, sono state trovate lungo tutta la porzione della pp e fanno acquisire attività tossica alla pp SOD1. Alcune mutazioni favoriscono aggregazione di questa pp. L'evidenza che non è perdita di funzione viene da modelli

animali → topi KO non sviluppano SLA, seesprimo il gene umano con mutazioni in topi si vede che questo sviluppa patologia simile a SLA. Si arriva a dire che è gain of function tossica perchè normalmente gli anioni superossido vanno metabolizzati ad acqua ossigenata, ma cambia attività SOD che al posto di neutralizzare anioni superossido produce radicali idrossilici.le mutazioni più comuni hanno caratteristiche diverse tra loro: - A4V: penetranza completa con decorso veloce, frequente in USA - I113T: penetranza incompleta (10%) con decorso variabile→ servono altri fattori genetici o ambientali per lo sviluppo della patologia A livello biochimico entrambe le mutazioni determinano perdita di metalli. Il gene SOD è stato il primo ad essere identificato, il primo topo KO non andava bene, il transgenico sviluppa la patologia. I topini verso i 60 gg manifestano tremori, a 70-80 gg non contraggono le zampe, a 100 gg si misura la forza muscolare cheè scarsa, non camminano bene fino ad arrivare a una paralisi muscolare intorno ai 150 gg con morte nei giorni successivi. Quando un topo manifesta i primi segni debolezza muscolare (100gg), la perdita di motoneuroni è al 44% → all’esordio dei sintomi abbiamo già morte cellulare importante (importanza dei bm!). All’inizio i vari gruppi hanno iniziato a fare i propri topini, la difficoltà/ complessità di avere tanti modelli di topo è stato avere diversi background G93A genetici e diverse mutazioni → non posso fare confronti tra le varie ricerche. Si usa il topo TghSOD1 con lo stesso numero di copie di transgene e lo stesso background genetici → posso confrontare i risultati tra laboratori diversi. TDP-43 E FUS In FTD abbiamo aggregati di tau, TDP-43 e FUS → aggregati presenti anche in SLA: TDP 43 è accumulato in quasi tutti i pazienti con SLA (tranne in pazienti con mutazioni di SOD). I pazienti mutati SOD1, non hanno aggregati di.TDP43 ma hanno aggregati di SOD1. Chi ha mutazioni in FUS, ha aggregati di FUS e non di TDP43. TDP-43 aggrega in quasi tutti i pazienti SLA anche se non è mutato sia in pazienti familiari sia sporadici, ci si chiede se TDP 43 è causativo di casi familiari → genetica inversa: si vede se il gene è causativo di malattia in pazienti familiari. Nel 2006 si prendono famiglie senza mutazioni in SOD e si vede che il 5% dei casi familiari e l'1% dei casi sporadici ha mutazioni in TARDBP (codifica per TDP 43). Nel 2009 si fa analisi di linkage e si trova il gene FUS → spiega il 5% dei casi familiari e l'1% dei casi sporadici di SLA. Le mutazioni di FUS si trovano al C terminale interferiscono con NLS, mentre in TARDBP le mutazioni interferiscono con un dominio per l'interazione con altre proteine. Non sono geni causativi di FTD, ma solo di SLA, nonostante abbiamo accumuli di questo proteina anche in pazienti con FTD. Sono stati fatti modelli murini → KO per i geni porta a morte, sono.funzione dovuto alla perdita di TDP-43 dalla sua localizzazione nucleare. Alcuni studi suggeriscono che entrambi i meccanismi possano contribuire alla patogenesi della SLA sporadica. Inoltre, è stato dimostrato che TDP-43 interagisce con diverse proteine coinvolte nella regolazione dell'espressione genica e nella formazione di complessi ribonucleoproteici. Queste interazioni sono fondamentali per il corretto funzionamento delle cellule e possono essere alterate in condizioni patologiche. La formazione di aggregati di TDP-43 è una caratteristica comune nelle cellule dei pazienti affetti da SLA sporadica. Questi aggregati possono interferire con le normali funzioni cellulari e causare danni ai motoneuroni. Tuttavia, non è ancora chiaro se gli aggregati di TDP-43 siano la causa principale della malattia o se siano solo un effetto collaterale della disfunzione cellulare. In conclusione, i geni essenziali e ubiquitari che regolano lo splicing, come TDP-43, svolgono un ruolo cruciale nella patogenesi della SLA sporadica. La comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti nella disfunzione di questi geni potrebbe aprire nuove strade per lo sviluppo di terapie efficaci per questa grave malattia neurodegenerativa.della perdita della funzione di splicing.Probabilmente sono entrambi i meccanismi.La pp mutata si trova nel citoplasma, ma la mutazione non favorisce la localizzazione citoplasmatica → vari fattori influiscono nel posizionamentocitoplasmatico.Per avere modelli posso non far esprimere il gene e non avere aggregati, ma ottenere il loss of function oppure posso avere aggregati ma non avere lacomponente di loss of function→ non posso studiare i due aspetti in contemporanea.ALTRE MUTAZIONITutti i geni che sono stati identificati aiutano a comprendere meglio la degenerazione. Ci sono geni che hanno a che fare con il trasporto assonale →hanno assoni molto lunghi e il trasporto deve essere garantito e mantenuto. Ci sono geni che hanno a che fare il proteasoma → rimozione di organelli epp.TERAPIEConoscendo come il neurone degenera posso mettere in atto terapie che vadano a contrastare questi difetti. Le malattie neurodegenerative coinvolgonoanche l’ambiente

in cui è inserito il neurone → microglia, astrociti e muscolo. 12La SLA è non cell autonomous → anche le altre cellule concorrono alla malattia, abbiamo queste evidenza con topi chimere → esprime SOD negli astrociti → degenerazione a livello dei neuroni → anche l’ambiente circostante è importante per rallentare la progressione della patologia e lo vedo sostituendo astrociti mutati con wt. Questo ha risvolti per le terapie con cellule staminali → si fanno queste terapie per dare supporto trofico di cellule staminali che possono secernere fattori neuropotteivi o protettivi che migliorano l’ambiente circostante. Ora abbiamo le iPSC → si vede se possono essere usate nell’ambito delle malattie neurodegenerative. Non si ha una cura efficace → terapie efficaci in topo SOD sono inefficaci nell’uomo, si usa riluzolo che allunga la sopravvivenza di pochi mesi nell’uomo. Ci sono varie molecole che sono state provate

Su pz che agiscono a diversi livelli del processo. Conoscendo il meccanismo di neurodegenerazione si prova ad intervenire con le molecole, dal 2017 è stato introdotto endaravone che agisce su stress ox. Si cerca una terapia che agisca sugli aggregati di TDP43. Si fa terapia genica in pz familiari in gene SOD e CORF72 → per SOD si usano ASO che abbassano i livelli di pp mutata: diminuisce i livelli di pp tossica, anche per C9ORF72 abbiamo ASO che bloccano la formazione di foci, ma è fallito in fase 2. 13SBMA è una malattia del secondo motoneurone → malattia di kennedy (SBMA). È caratterizzata da atrofia muscolare, è una patologia genetica familiare. Con SMA si intendono una serie di patologie. La SMA prossimale va a colpire i muscoli più vicini al tronco, distale va a colpire i muscoli più lontani. SBMA è X linked, il gene causativo è quello che codifica per il recettore degli androgeni, esordisce in età adulta.

E’ una malattia da espansione ditriplette, la sua incidenza è 1:40.000, insorge in età adulta (variabile), è X linked recessiva → femmine non sviluppano patologia.E’ dovuta ad espansione di triplette CAG che codificano per glutammina (poliQ) → si trova nell’esone 1 del gene AR. Le caratteristiche cliniche sono: - Ipostenia prossimale, facciale e bulbare in genere (disfagia, disfonia, disartria) - Amiotrofia simmetrica - Fascicolazioni facciali - Areflessia od iporeflessia - Assenza di segni di primo motoneurone - Lievi sintomi sensitivi in particolare agli arti inferiori e riduzione dei potenziali sensitivi - Tremore posturale alle mani - Ginecomastia (50%) - Ridotta fertilità e atrofia testicolare E’ una patologia che progredisce molto lentamente → sopravvivenza molto più lunga. Si hanno segni di resistenza agli ormoni sessuali maschili, si ha ridotta fertilità in questi pazienti, nel 50% dei pazienti mostrano segni di

ginecomastia (androgeni non efficaci). Femmine carrier asintomatiche.

In alcuni casi può essere confusa con SLA → bisogna vedere l'ereditarietà e la progressione e la resistenza agli androgeni. Ci sono errori diagnostici tra SBMA e SLA.

NEUROPATOLOGIA

Nelle corna anteriori del midollo spinale abbiamo degenerazione dei motoneuroni e presenza di inclusioni proteiche di AR mutato, queste stesse caratteristiche sono anche evidenziabili nell'epitelio scrotale → tessuto periferico di riferimento per misurare la deposizione di questa pp mutata.

AR E MUTAZIONI

LA SBMA fa parte delle malattie da espansione di triplette → poliglutaminopatie. L'espansione di triplette può cadere in sequenze non codificanti oppure in regioni codificanti → malattie da poliglutammina. Sono sequenze polimorfiche → l'intervallo di normalità delle sequenze ripetute è da 10 a 36 non abbiamo patologia, dopo 40 abbiamo patologia → sopra le 62

ripetizioni è incompatibile con la vita → espansione in regione codificante. Le espansioni in regioni non codificanti sono molto ampie perché non abbiamo limiti biologici, se le ripetizioni sono in sequenze codificanti sono più