Modulo appunti di Fisiopatologia e fondamenti di terapia biotecnologica

Ematologia

Medicina clinica

Aspetti clinici della pratica medica: Il campione fa parte del processo di diagnosi e terapia → obblighi di privacy. Il medico fa la raccolta anamnestica: quali malattie e sintomi etc. Si fa poi un esame obiettivo → si visita il pz in cerca di altri segni. Si eseguono poi esami di laboratorio. Si eseguono tecniche di immagine come radiografie, tomografia computerizzata, tomografia a emissione di positroni, risonanza magnetica nucleare, endoscopia e medicina nucleare. Si ottiene una diagnosi e si prosegue a risolvere i bisogni del pz.

Es. in tempi covid arriva pz con tosse → chiede esami di laboratorio tra cui esami del sangue di routine e molecolari, ci sono poi tamponi e tecniche di immagine. Il tampone risulta positivo al covid → si fa RX → possibile focolaio ma RX poco sensibile → TAC. Ora si ha diagnosi e si prescrive terapia → si cerca di risolvere bisogni pz: non morire e guarire.

Attività del medico

• Terapie con farmaci
• Assistenza (es. riabilitative)
• Malattie iatrogene → malattie dovute ad assistenza medica. Es. tumore trattato con chemio o chemio + radio che sono agenti genotossici → possibilità maggiore della popolazione normale di avere tumori. Radio per tumore al seno irradia anche coronarie → problemi. Es. artrite reumatoide con farmaci immunosoppressori possibili linfomi
• Consenso informato per esami
• Linee guida: protocollo standardizzato per effettuare un esame. Es. esame di diagnostica molecolare è stato standardizzato a livello mondiale per ottenere sempre lo stesso risultato → fondamentale perché se no i risultati non sono paragonabili tra paesi/università diverse. Durante il covid tamponi antigenici a basso costo risultano negativi, ma tamponi di III generazione risultano positivi → no accordo su sensibilità tamponi. Problema sociale ed economico → servono macchinari e personale adeguato per effettuare la standardizzazione
• Rapporto costo/beneficio, prevenzione, screening, ricoveri brevi. Es. costo/beneficio: Spinal muscular atrophy → bambini non riescono stare seduti, esiste una terapia genica commercializzata in USA da costo di 1 milione e mezzo di dollari, se il risultato è buono il bambino tiene su la testa, ha senso spendere tanto per un singolo individuo quando ci sono migliaia di individui che stanno peggio e hanno bisogno di terapie con costo inferiore.
• DNR e cessazione terapia: l’individuo ora può fare il testamento biologico, quando si viene ricoverati il rianimatore chiede se si vuole essere rianimati o meno → bisogna dare il consenso. Es. La Svizzera durante il covid ha deciso che a 80 anni non si poteva essere intubati.

Questioni etiche in medicina

• Rispetto della volontà del paziente:
  • Consenso informato
  • Limitare l'informazione se opportuno assistenza in emergenza
• Pazienti che non sono in grado di prendere decisioni:
  • Capacità intellettuali
  • Scelta del sostituto
  • Condizioni di salute
  • Volontà espresse in precedenza
• Conflitto fra beneficio medico e volontà del paziente
• Decisioni sulle procedure che prolungano la vita:
  • Terapie straordinarie
  • Consegna di non rianimare
  • Sospendere l'intervento medico
  • Paz. terminale ed eutanasia
• Conflitto di interesse in medicina:
  • Incentivi finanziari
  • False dichiarazioni es. invalidità
  • Errore medico
  • Comportamento scorretto di colleghi
• Ricerca biomedica e protocolli sperimentali
• Assicurare la segretezza
• Distribuzione equa delle risorse: es. letti nelle unità intensive (covid)

L'ospite e la malattia: influenza dei fattori demografici

• Età
• Sesso
• Patrimonio genetico:
  • Polimorfismi genetici
  • Malattie ereditarie
• Fattori geografici:
  • Carenza di iodio nella dieta
  • Lebbra, malaria
  • Radiazioni
• Origine etnica:
  • Talassemia
  • Anemia falciforme
  • Diabete mellito negli afroamericani
  • Morbo celiaco

Aspetti sociali e malattie

• Riduzione della mortalità infantile (8 su 1000) ed aspettativa di vita
• Morbilità e mortalità maggiori nella popolazione con minore tenore socioeconomico:
  • Livello di scolarità
  • Malattia reumatica
  • Fumo, etilismo
  • HIV
  • Tubercolosi
  • Suicidio
  • Uso di droghe
• Morbilità e mortalità in diversi gruppi etnici: di solito ascrivibili a differenze sociali ed economiche
• Ruolo dei fattori di rischio:
  • Fumo
  • Vaccinazioni
  • Obesità, attività fisica

Ci sono, nello sviluppo di malattie, sia fattori legati alla genetica (anche etnia) sia fattori socioeconomici.

Consapevolezza dei costi in medicina

• Costi dell'assistenza sanitaria: in Italia abbiamo sistema universalistico → tutti hanno diritto alle cure.
• Assicurazione sanitaria
• Rimborsi degli ospedali e dei medici
• Nuovi farmaci
• Rapporto costo/beneficio es: farmaci per ipertensione
• Conseguenze sociali dei costi: by-pass coronarico, emodialisi, test diagnostici
• Screening sanitario e prevenzione
• Nuovi costi legati a terapia genica (CAR-T, talassemia, immunodeficienza) Es. c’è una terapia genica per la talassemia → pz indipendenti da trasfusioni. EMA approva farmaco americano → costo esorbitante per il singolo pz

Disegno degli studi clinici

Si fa scoperta con cui si produce un nuovo farmaco → il farmaco va testato sull'uomo per poterlo rendere disponibile → studi clinici. Se si lavora in università e si brevetta si fa studio no profit o accademico per dimostrare che funziona → azienda paga royalties e si registra farmaco. Se si lavora in centro di ricerca di company farmaceutica il farmaco appartiene alla company. Lo studio clinico dell’università è fatto per studio puro, lo studio clinico della company serve per guadagnare.

Lo studio clinico è ristretto ai pz che sono rimasti nello studio. Lo studio va fatto secondo il principio dell’intenzione al trattamento → tutti i pz entrati nello studio verranno valutati. I pz devono avere determinati criteri per entrare nella sperimentazione, serve poi il suo consenso → se il pz muore viene comunque valutato → si deve vedere se funziona su tutti i pz.

Es. CAR T cells prodotte in 28 gg → pz possono morire nel mentre → vanno comunque valutati e si evidenziano limiti del prodotto in analisi.

Gruppo di controllo: in uno studio randomizzato sono i pz. Utilizzati come gruppo di confronto, sono la base per fare il paragone.

Incidenza: numero di nuovi casi di una patologia che si verifica in una popolazione durante un periodo di tempo specificato.

Prevalenza: proporzione di soggetti portatori di una malattia in una popolazione in un dato momento → la prevalenza cresce a mano mano che la medicina trova soluzioni a malattie croniche.

Placebo: trattamento biologicamente inerte.

Possono esserci diversi tipi di studio:

• Retrospettivo: casi trattati o diagnosticati con quella metodica → metodicamente molto debole, dati già ottenuti e non osservati in maniera prospettica
• Prospettico: da oggi tutti i pz che entrano in studio sono valutati in maniera oggettiva → viene valutato TUTTO

Studio di fase I: scopo primario è determinare la dose massima tollerata di un nuovo farmaco, studio dedicato a studiare la dose minima efficace in base agli effetti collaterali. Si fanno disegni scalari con le dosi che salgono → in base agli effetti ci si ferma o non si porta avanti il farmaco.

Studio di fase II: di solito valuta l’attività di un nuovo farmaco es. risposta del tumore. Endpoint secondario, la sopravvivenza.

Studio di fase III: paragone prospettico in doppio cieco tra due o più trattamenti. Il gruppo di controllo riceve la migliore terapia standard presente → studio di superiorità. Lo studio di fase tre serve per registrare un farmaco.

Medicina basata sulle evidenze

Da questi studi si possono scrivere linee guida, se si scrivono su più studi di fase tre sono le più robuste → livello I. Linee guida ottenute da sperimentazioni di fase due sono deboli. Se sono scritti in base a malattie o casi rari → linee guida di livello IV → evidenza ottenuta da un pannello di esperti o opinioni cliniche di autorità.

Le linee guida hanno uno specifico valore → in laboratorio bisogna rispettare le linee guida! La magistratura in caso di problemi fa caso alle linee guida.

Diagnostica ematologica

Malattie oncoematologiche: malattie oncologiche del sangue. Fino al ‘600 non si sapeva da cosa fosse costituito il sangue. La storia dell’ematologia nasce nel ‘600 → Malpighi identifica globuli rossi nei capillari. Alla fine ‘800 è iniziata la morfologia ematologica → colorare cellule del sangue: si identificano cellule diverse → striscio di sangue periferico + si colora il nucleo: cellule nucleate e non nucleate.

Emopoiesi

Da una cellula staminale pluripotente si originano precursori che si differenziano in linea mieloide e linfoide. A ogni fase maturativa delle cellule (morfologia diversa), a fronte di un corretta maturazione corrisponde una patologia → le cellule durante il loro stadio di sviluppo si arrestano e danno origine a una certa patologia.

L’emopoiesi dell’adulto avviene prevalentemente nel midollo osseo e in maniera limitata in ossa lunghe distali. Nel feto avviene inizialmente nel sacco vitellino e poi in fegato e milza.

Elementi del sangue

• Eritrociti: popolazione prevalente, no nucleo, forma a lente biconcava → utile allo scambio gassoso. Sono 5 milioni per mm cubo in uomo e 4-5 in donne. Si sviluppano dalla staminale che subisce sviluppo in senso eritroide, ci sono proeritroblasti, eritroblasti e eritrociti che dal midollo migrano in circolo. Questa fase di sviluppo è caratterizzata da cellule con morfologia particolare → nel sangue midollare trovo tutte le fasi di maturazione, mentre nel sangue periferico trovo eritrociti maturi.
• Leucociti: comprendono diverse classi le cui percentuali costituiscono la formula leucocitaria → posso avere sbilanciamento delle popolazioni nelle varie patologie. Le diverse cellule hanno dimensioni e colorazioni diverse → facilmente distinguibili in uno striscio di sangue. I neutrofili sono 50-70%, eosinofili 2-5%, basofili 0-2%, linfociti 25-30%, monociti 3-7%. Il numero totale dei leucociti è 6.500 - 10.000 cellule per mm cubo → se ci si sposta dal range: patologia! La serie leucocitaria deriva dalla staminale che dà origine a un progenitore leucocitario che dà origine a mieloblasti → granulociti; a monoblasti → monociti; linfoblasti → linfociti.

I diversi tipi di leucociti sono:

• Granulociti:
  • Neutrofili: sono la maggior parte, difesa → distruggono batteri nel connettivo grazie alla loro capacità fagocitaria, polimorfonucleati, hanno corpo di Barr → addensamenti di cromatina → marcatore delle cellule.
  • Eosinofili: pochi, granulazioni nel nucleo che li rendono distinguibili (azzurri), aumentano durante allergie.
  • Basofili: granuli basofili mascherano il nucleo ad S, sono rari (meno dell’1%).
• Agranulociti:
  • Monociti: grossi con nucleo reniforme, sono le cellule più grandi nel sangue circolante, sono la prima linea di difesa, rimangono in circolo poco, diventano macrofagi nei tessuti → la loro funzione si esplica quando diventano macrofagi e fagocitano.
  • Linfociti: piccole dimensioni simili a globuli rossi; B, T e NK sono indistinguibili in strisci di sangue; i T sono 80%, B 15% ed NK 5%.
• Piastrine: Se ci sono patologie che spostano il numero di cellule posso avere citosi (+) e penia (-).

Diagnostica

Esame emocromocitometrico

Letteralmente significa "misurazione del colore del sangue e del numero delle sue cellule” → insieme di test per valutare la componente corpuscolata del sangue ed i suoi rapporti con la componente liquida. Studia la composizione cellulare del sangue periferico → è propedeutico a tutti gli altri esami di laboratorio.

Originariamente era effettuato al microscopio. Ora si usano macchine automatizzate che vanno a valutare parametri fisici delle cellule, le cellule si distribuiscono in un citogramma leucocitario in base alle loro dimensioni → ogni cellula ha diversa capacità di rispondere ai raggi luminosi con cui è illuminata → differenti capacità di diffrazione della luce in base a dimensione e granulosità. In ordine di dimensione si dispongono come:

• Rumore di fondo
• Monociti
• Eritroblasti
• Neutrofili
• Aggregati piastrinici
• Eosinofili
• Linfociti e basofili
• Cellule che non vengono riconosciute → sono di solito poche e sono fasi maturative di cellule

La macchina conta gli eventi che cadono nelle varie aree e li paragonano ai riferimenti su cui è stata tarata la macchina (specifica per la macchina).

L'emocromo permette di vedere deficienze di una o più componenti → citopenie: deficit di produzione o aumentata distruzione; citosi → aumento della componente: reattiva (incontra Ag) o incontrollata (malattia oncoematologica). Quando l'emocromo dà flag di citosi o citopenia, si prosegue nel percorso diagnostico → striscio.

Esame morfologico su striscio periferico

In caso di anomalie nel citocromo si fa striscio: si deposita una goccia di sangue sul bordo del vetrino, si mette il vetrino coprioggetto e si spinge la goccia verso la fine del vetrino. Grazie ai vari ingrandimenti posso leggere lo striscio, l’osservazione comincia con l’ispezione di tutto il preparato con un obiettivo a bassa risoluzione (x10) per valutare gli aspetti di qualità della distribuzione delle cellule, come l'eventuale presenza di aggregati piastrinici, leucocitari o leuco-piastrinici, di agglutinati eritrocitari, la presenza di cellule patologiche a bassa frequenza che potrebbero sfuggire al conteggio differenziale. Con un ingrandimento piccolo si valuta la leggibilità del preparato; con un ingrandimento intermedio si valuta la morfologia delle cellule; con un ingrandimento maggiore si analizzano dettagli citologici come granulazioni, inclusi nel citoplasma e l’aspetto del nucleo.

I preparati sono colorati con metodica May-Grunwald-Giemsa → si possono vedere anche tutti i tipi di granulazione che si colorano in maniera differente.

Lo striscio si fa con:

• Pz con emopatie note
• Alterazione dell’emocromo
• Pz in CHT o RT
• Flag dello strumento
• Neonati
• Modificazioni significative rispetto ad esami precedenti

Esame morfologico del sangue midollare

Un esame più suggestivo di quello che sta succedendo è andare a fare uno striscio di sangue midollare → aspirato midollare. Va fatto nella cresta iliaca o sterno; il pz è supino, viene identificata la cresta iliaca (sede del prelievo), si anestetizza la cute e il periostio. Si usa un ago che fa una sorta di carotaggio.

Quando effettuo il prelievo del sangue midollare posso sia analizzare la componente liquida ed anche effettuare un’analisi della biopsia osteomidollare, ovvero della componente delle cellule che si posizionano sotto la corticale. Come per il sangue periferico, il sangue midollare viene apposto su un vetrino, strisciato, colorato e valutato mentre la biopsia ossea viene inclusa e tagliata per poi subire un processo simile a quello di tutte le biopsie.

L’esame citologico del sangue midollare è eseguito in caso di:

• Anemia e/o piastrinopenia
• Leucopenia o leucocitosi
• Anomalie morfologiche degli elementi leucocitari circolanti
• Sospetto di leucemie acute o croniche sindromi mielodisplastiche, mielomi
• Monitoraggio di pazienti in trattamento radio o chemioterapico

In un midollo normale ho cellule mature e cellule che rappresentano le fasi di maturazione delle varie cellule. In caso di:

• Mieloma multiplo: plasmacellule accumulate a discapito delle altre
• Leucemia linfatica cronica: accumulo di linfociti B che normalmente non dovrei avere nel midolla
• Leucemia mieloide cronica: numerosi blasti (cellule grosse ed indifferenziate)

L’esame istologico del frammento osseo e del tessuto midollare adiacente fornisce informazioni su:

• Cellularità midollare
• Proporzione relativa degli elementi della serie mieloide, eritroide linfoide e megacariocitaria
• Rapporti spaziali e numerici
• Presenza di tessuti fibrosi (mielofibrosi idiopatica)
• Infiltrazione focale di cells neoplastiche

La FAB, French-American-British classification delle leucemie acute della linea mieloide M e linfoide L, si basa sulla somiglianza alla cellula bloccata in una fase maturativa. La morfologia è quindi fondamentale per classificare le leucemie. Ad ogni tipo di leucemia corrisponde un trattamento diverso, per cui per fare classificazione, diagnosi e trattamento devo sapere qual è la cellula, come matura e capire da dove è collegata la patologia.

Immunoistochimica

LB e LT sono indistinguibili → nel corso degli anni sono state sviluppate tecniche che permettono di distinguerli grazie a specifici Ag. L’immunoistochimica è in grado di identificare e localizzare Ag (proteine o polisaccaridi) espressi dalle cellule tumorali sia al microscopio a fluorescenza che al microscopio elettronico. L’immunoistochimica utilizza Ab coniugati ad enzimi che mediante reazione istochimica rivelano la presenza di tali Ag su preparati istologici. L’immunoistochimica è tipicamente utilizzata nelle patologie linfoproliferative in cui l’esame istologico dei linfonodi è fondamentale per la diagnosi.

Ci sono specifici marcatori per i tipi cellulari di interesse:

• CD34: blasti, cellule endoteliali, cellule staminali emopoietiche
• CD3: LT
  • CD4: LT helper
  • CD8: LT citotossici
• CD20/CD19: LB
• CD15: granulociti
• CD14: monociti
• CD61: trombociti

La combinazione dei marcatori permette di evidenziare precisamente la presenza di determinati tipi cellulari. Nell’immunoistochimica per la diagnosi dei linfomi B, caratterizzati da proliferazione incontrollata di cellule B, identificabili da CD19 e CD20, posso utilizzare CD5 per riconoscere i vari tipi di linfomi:

• CD5+ → linfoma diffuso a grandi cellule B