Membrane biologiche e microscopia

MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

Sono presenti dei piccoli cubi che si posizionano nel percorso ottico. Sono dei filtri che permettono il passaggio della luce di un'unica lunghezza d'onda. È possibile studiare separatamente la fluorescenza di un preparato in rosso, blu e verde e poi unirle in una micrografia unica tramite un software.

Il MICROSCOPIO CONFOCALE A FLUORESCENZA è sempre un tipo di microscopio ottico, ed ha quindi il medesimo potere di risoluzione. A differenza del microscopio a fluorescenza semplice, dove la luce illumina interamente il preparato, quello confocale focalizza un punto preciso e non il materiale circostante, rendendo quindi maggiore nitidezza e mantenimento del nero. La luce in entrata ed emessa vengono circoscritte da un piccolo foro.

Il microscopio confocale a scansione viene associato a uno schermo e a un software che funge anche da banca dati. Questo mi dà la possibilità di scansionare materiale non sezionato e quindi più grande.

Si usa per lo studio di cellule nel loro complesso (non sezionate). Inoltre, può essere invertito, cioè può avere l'oculare e la lente del condensatore anche in basso, cioè sotto al vetrino. Possiede una lampadina (è quindi a campo chiaro) e un'altra sorgente luminosa.

Per la fluorescenza vengono usate lampade che coprono tutto lo spettro luminoso, ad esempio quelle a mercurio. Non troviamo inoltre il vetrino porta oggetti, ma una piastra di coltura, solitamente di vetro poiché la plastica può creare interferenze, seppur lievi, con le onde luminose.

IMMUNOISTOCHIMICA DIRETTA

Nel metodo diretto (o primario), l'etichetta del fluoroforo viene coniugata direttamente all'anticorpo primario che reagirà con l'epitopo bersaglio. La tecnica di immunofluorescenza diretta è utilizzata principalmente per la ricerca di un antigene ignoto (ad esempio di un batterio) il quale, dopo essere stato fissato al vetrino o...

Pozzetto attraverso specifiche metodiche, viene messo a contatto con i presunti anticorpi specifici. A questo punto lasciamo a contatto, per il tempo necessario, l'antigene con l'anticorpo in modo tale da avere un'interazione tra le due molecole che porterà alla formazione di un immunocomplesso. Successivamente, è opportuno lavare accuratamente il vetrino in modo da eliminare gli eventuali antigeni che non si sono legati. Alla fine, analizzeremo il tessuto attraverso un microscopio a fluorescenza e se notiamo la presenza di corpuscoli brillanti significa che il siero contenente gli anticorpi fluorescenti è specifico per quell'antigene. In questo caso, quindi, siamo in presenza di un risultato positivo.

Il metodo diretto prevede che l'anticorpo primario sia legato covalentemente a un marcatore che lo renda facilmente rilevabile. La popolazione di anticorpi tirata fuori si dice policlonale. Uso l'anticorpo direttamente legato al suo

rilevatore.IMMUNOISTOCHIMICA INDIRETTA

Molto sensibile perché l'anticorpo primario è a sua volta riconosciuto da molte molecole dell'anticorpo secondario, il quale è accoppiato covalentemente ad un marcatore che lo rende facilmente visibile. In questo caso abbiamo un numero maggiore di marcatori. Quando la proteina da evidenziare è presente in piccole quantità è preferibile il metodo indiretto, poiché aumenta la probabilità di evidenziare una data sostanza. Il metodo indiretto prevede un processo di incubazione in due fasi:

1. Un anticorpo primario si lega all'epitopo target;
2. Un anticorpo secondario, marcato con fluoroforo, riconosce e si lega all'anticorpo primario;

Nell'immunofluorescenza indiretta il siero del paziente viene opportunamente diluito (passaggio fondamentale per ottenere la massima specificità del test senza diminuirne la sensibilità) e fatto reagire con il substrato specifico.

fissato nel pozzetto per ricercare gli autoanticorpi specifici. La scelta del substrato adeso al vetrino può essere rappresentata da cellule o sezioni di tessuto e determinerà la tipologia di anticorpo da rilevare. Se all'interno del siero sono presenti autoanticorpi, questi riconosceranno gli antigeni portando alla formazione di un immunocomplesso primario. Dopo questa prima fase di incubazione, in seguito ad opportuni lavaggi, si può procedere con una reazione secondaria tra il complesso ottenuto e un anticorpo marcato con fluorocromo (anticorpo secondario). A questo punto, se sarà possibile rilevare fluorescenza, vorrà dire che l'anticorpo cercato è specifico per l'antigene a noi noto. Vantaggi e svantaggi dell'immunofluorescenza La tecnica di immunofluorescenza presenta diversi vantaggi e svantaggi. Tra i vantaggi: - Buona sensibilità e specificità di reazione; - Tecnica semplice e facile identificazione di elementi.

Anche molto piccoli;

Il risultato è visualizzabile subito dopo la reazione immunologica;

Permette di indagare contemporaneamente la presenza di autoanticorpi rivolti contro diversi tipi di antigeni;

Ha un costo contenuto;

Tra gli svantaggi:

• La fluorescenza decade rapidamente;
• Strutture tissutali difficilmente identificabili;
• A seconda dell'utilizzo di microscopi confocali o a fluorescenza, devono essere selezionati fluorofori che possono essere effettivamente eccitati e rilevati dall'attrezzatura disponibile.

Utilizzando l'immunofluorescenza è possibile evidenziare più proteine all'interno della stessa cellula. Ad esempio, nel citoscheletro posso vedere tutti i componenti.

A livello di microscopia elettronica posso evidenziare singole molecole.

Prendiamo come esempio la micrografia di una cellula beta secernente insulina in cui l'insulina è marcata con anticorpi anti-insulina legati a sfere di oro colloidale dense elettronicamente.

visibili come un puntone(immunoistochimica diretta).La falloidina non è un anticorpo, ma può essere usata ad esempio per legare i filamenti di actina del citoscheletro, in quanto risulta essere un suo marcatore specifico.Ricapitolando, il legame antigene-antigene può essere evidenziato in microscopia a fluorescenza, ma anche in microscopia in campo chiaro, con l'utilizzo di un enzima che trasforma un substrato in un prodotto colorato e anche in microscopia elettronica a trasmissione, con l'utilizzo di un anticorpo legato ad una sostanza densa agli elettroni o in presenza di un enzima che trasforma un substrato in una sostanza densa agli elettroni.

CITOMETRO A FLUSSO. La citometria a flusso è usata di routine nella diagnosi di patologie del sangue e oncologiche. È una tecnica che permette la misurazione e la caratterizzazione delle cellule sospese in un mezzo fluido in modo molto rapido e dettagliato. Si tratta sostanzialmente di un metodo di conteggio,

Selezione e isolamento di particelle, le quali dopo essere state marcate con un colorante fluorescente in modo specifico, vengono singolarmente passate attraverso un sistema rivelatore ottico a flusso laminare e quindi conteggiate. Attraverso questo conteggio è possibile analizzare altre caratteristiche delle particelle, selezionate dalla marcatura specifica.

Lo strumento utilizzato è il citometro a flusso. Il principio fondamentale su cui si basa la citometria a flusso è la dispersione della luce. Il citometro utilizza un flusso laminare di liquido di sheath per organizzare le cellule in un flusso ordinato, costante e continuo, in modo da portare ogni cellula nella camera di conta (questo processo è chiamato focalizzazione idrodinamica).

In strumenti con più di due fasci laser (per il forward e side scatter), chiamati citofluorimetri, sono presenti delle fonti luminose che emettono lunghezze d'onda prefissate per l'eccitazione di fluorocromi legati.

ad immunoglobuline; questi complessi vengono utilizzati per la ricerca di specifici marcatori cellulari come per esempio i cluster di differenziazione, utili per la definizione della linea cellulare di appartenenza del campione. Le modalità con cui la luce attraversando le cellule viene distribuita sia sulla stessa linea del fascio (forward scatter - dispersione frontale - FSC), sia lateralmente (side scatter - dispersione laterale - SSC), forniscono informazioni rispettivamente sulle dimensioni e sulla complessità interna della cellula. Nella citofluorimetria, vengono utilizzati degli anticorpi monoclonali legati a particolari molecole, chiamate fluorocromi, ovvero molecole in grado di emettere una fluorescenza se eccitate con radiazioni luminose aventi lunghezze d'onda specifiche. I citofluorimetri quindi, presentano sia fonti luminose specifiche (per emettere radiazioni monocromatiche) che rilevatori specifici. I moderni citometri a flusso sono in grado di analizzare intempo reale molte migliaia di cellule al secondo. È uno strumento simile al microscopio, ma non produce un'immagine della cellula. Il citometro si compone di cinque parti: una camera di flusso, una camera di conta, un rivelatore, un sistema di amplificazione e un computer per l'analisi. LE MEMBRANE BIOLOGICHE Iniziamo descrivendo le caratteristiche citologiche. Ogni cellula presenta uno strato lipidico e proteico, detto membrana plasmatica (o citoplasmatica, o cellulare), che ne definisce i confini e regola gli scambi molecolari con l'ambiente esterno. Questa struttura può essere chiamata anche membrana interna per distinguerla da quella esterna presente nei batteri gram-negativi. La membrana plasmatica racchiude al suo interno il citoplasma, la regione nucleare (nucleo per le cellule eucariote) e gli organuli che si trovano all'interno della cellula, necessari per le sue funzioni vitali. La sua struttura, prevalentemente lipidica e proteica, gli permette.di essere resistente ma flessibile, auto-sigillante, e permeabile a molecole selezionate dalla cellula stessa. Oltre a questa forma di trasporto passivo, proteine di membrana specializzate promuovono gli scambi attraverso un trasporto che richiede un dispendio di energia. A seconda della posizione della membrana nella cellula essa svolge funzioni differenti; la membrana ha struttura unitaria, fatta del doppio strato fosfolipidi, che assume caratteristiche locali arricchendosi o impoverendosi di dati elementi in dati comparti:

• Determina una compartimentazione e mantiene l'integrità strutturale
• Permette lo svolgersi dei processi enzimatici coordinati (fungendo da piattaforme di coordinazione)
• Controlla il flusso di sostanze
• Trasporta attivamente i soluti, attraverso canali o proteine trasportatrici, determinando un gradiente di concentrazione. Aperto un canale, la cellula non controlla più il flusso che continua fino all'equilibrio
• Riceve

Informazioni d