Microbiologia generale

Microbiologia

Microrganismi: chi sono

Si tratta di organismi talmente piccoli da essere visibili solo al microscopio, e la loro semplicità cellulare consente di adattarsi a diversi habitat. Si dividono in 5 gruppi:

• Batteri: 1-5 μm di diametro
• Funghi: lieviti (5-8 μm di diametro e muffe 5 - macro)
• Protozoi: 40-200 μm di diametro
• Alghe: 50 - macro
• Virus: 0.01-0.3 nm (sono parassiti)

Riuniti nel regno dei protisti (organismi primitivi).

Ruolo

Positivo:

• Produzione di alimenti: formaggi, vino, pane
• Produzione di metaboliti: vitamine, antibiotici, enzimi, polisaccaridi, solventi
• Nel campo agrario: fertilità del suolo, resa di raccolta e depurazione

Negativo:

• Intossicazioni alimentari (botulismo)
• Infezioni alimentari (salmonellosi)
• Agenti eziologici di malattie (pertosse, tetano, colera, tubercolosi)

Come sono: eucarioti e procarioti

La cellula eucariota possiede un nucleo contenente il DNA sotto forma di cromosomi omologhi (cellula diploide o 2n) e organelli. La cellula procariota è priva di organelli e di nucleo, infatti il materiale genetico è sparso nel citoplasma (contiene solo una molecola di cromosoma).

Cellula procariota

La parete cellulare è rigida e solida, protegge la cellula e ne mantiene la forma. È costituita da peptidoglicano, un polimero che circonda la cellula, composto da due strati: N-acetilglucosammina e N-acetilmuramico legati da un legame β-1,4. La catena più comune è composta da:

• L-alanina
• D-glutammico
• m-diaminopimelino
• D-alanina

Queste catene fungono da legame, e per conferire maggiore protezione formano legami diretti tra due amminoacidi, o indiretti formando un ponte di glicina. Tutti i batteri con pareti hanno peptidoglicano, ma cambia lo spessore di altri componenti, detti:

Gram positivi e negativi

Gram positivi: formata da un multistrato di peptidoglicano con acidi teicoici che possono fuoriuscire (antigeni di superficie). Alcuni possiedono anche acidi micolici che riducono la permeabilità proteggendo ulteriormente la cellula (tipicamente micobatteri). Sono più resistenti rispetto ai Gram negativi.

Gram negativi: pochi strati parietali (5-10% del peso secco della parete) al di sopra c'è una membrana esterna ancorata a proteine, al cui interno si trovano componenti a base lipidica, tra cui il lipopolisaccaride, da cui la catena laterale può fuoriuscire dallo spessore della membrana, conosciuti anche come antigeni di superficie o antigeni somatici.

Parete eumiceti

• Muffe e funghi: chitina e β-glucani
• Lieviti: pareti con mannoproteine e β-glucani

Capsula batterica

La capsula batterica viene prodotta da alcuni batteri sintetizzando polimeri che si depositano intorno alla parete. Se è resistente prende il nome di capsula, se è più lassa si tratta di strato mucoso. Viene prodotta per avere un’ulteriore protezione.

Ha una funzione di protezione da componenti o enzimi che hanno come bersaglio la parete cellulare. Se il lisozima incontra una parete diversa rispetto a quella che è in grado di attaccare, fa fatica a lisarla. I batteri capsulati sono virulenti per l’uomo, perché sono mascherati e il sistema immunitario non riesce a riconoscerli, e aderisce molto bene ai tessuti.

Membrana citoplasmatica

La membrana citoplasmatica è presente in ogni cellula, ed è formata da un doppio strato fosfolipidico. Contiene diversi componenti di natura proteica con specifiche funzioni. È un modello a mosaico fluido, infatti permette di adattarsi ai cambiamenti ambientali.

Le sue principali funzioni sono:

• Regolare il passaggio tra interno ed esterno, legandosi a proteine di trasporto
• Idrolizza le macromolecole (polimeri come amido, caseina) grazie a proteine enzimatiche (amilasi, proteasi)
• Recettori (feromoni) per comunicare con le altre cellule

Nelle cellule procariote ha ulteriori funzioni perché sono prive di mitocondri, cloroplasti e apparato mitotico, quindi:

• Compie la respirazione dove si trovano tutti gli elettroni
• Possiede l’apparato fotosintetico
• Aiuta il processo di divisione cellulare e la replicazione, grazie a delle introflessioni dette mesosomi

Altri componenti

• Nucleoide: contiene il genoma batterico
• RNA: mRNA e tRNA
• Ribosomi: liberi nel citoplasma ed essenziali per la sintesi proteica

Il DNA è formato da un solo cromosoma in forma circolare detto CCC (circolare covalentemente chiuso) e superavvolto. Inoltre contiene il plasmide (DNA extracromosomale) avente informazioni che possono aiutare la cellula a sopravvivere in un determinato ambiente.

Ribosomi

Ogni ribosoma è costituito da due subunità: una maggiore e una minore, indicate con il loro coefficiente di sedimentazione S (unità Svedberg). Le due subunità hanno densità diverse, ma la loro somma non è uguale a quella del mitocondrio intero. Nei procarioti, ad esempio, ci sono le subunità 30S e 50S che corrispondono al mitocondrio 70S.

All’interno delle due subunità sono presenti RNA ribosomiale e proteine specifiche necessarie ad attivare i mitocondri. È nell’unità 30S del ribosoma batterico che si trova l’RNA ribosomiale 16S usato come orologio molecolare.

Carbossisomi

I carbossisomi fanno parte dei batteri che vivono in ambienti acquatici. Sono costituiti da proteine tra cui il ribulosio 1,5-difosfato carbossilasi, che serve per fissare la CO2 o come sito di deposito per l’enzima carbossilasi.

Magnetosomi

I magnetosomi hanno cristalli di magnetite e possono orientarsi verso uno dei due poli del campo magnetico.

Vacuolo gassoso

I vacuoli gassosi sono vescicole piene di gas, utili a stare a galla (o meno) cercando più luce o ossigeno.

Granuli di riserva

In un ambiente ricco, i microrganismi cercano di accumulare nutriliti in caso di assenza. I nutrienti vengono accumulati in granuli di riserva sotto forma di poli-β-idrossibutirrato.

Estensioni extracellulari

I batteri hanno escogitato delle modalità di spostamento, sintetizzando i flagelli che possono essere di diverso numero e dimensione, osservabili solo con microscopio elettronico. In base alle estensioni extracellulari, si distinguono:

• Monotrico: un flagello a un solo polo
• Anfitrico: un flagello a entrambi i poli
• Lofotrico: numerosi flagelli a entrambi i poli
• Peritrico: l’intera superficie è coperta da flagelli

Il flagello è composto da flagellina ed è ancorato alla membrana attraverso il corpo basale, muovendosi con un movimento ondulatorio in risposta a segnali esterni. I batteri attivano il movimento rotatorio avanzando in linea retta, cambiando direzione ogni tanto. Si parla di:

• Chemiotassi: se cercano nutriliti
• Fototassi: se cercano la luce

I pili sono simili ai flagelli, ma più sottili e numerosi, con funzione di adesione. Esiste un pilo particolare che prende il nome di pilo F, sufficientemente lungo da contrattare un'altra cellula creando un ponte coniugato utile a trasferire il materiale genetico. Anche negli eucarioti possiamo trovare delle estensioni dette ciglia e flagelli, che però hanno un movimento a frusta.

Morfologia dei batteri

Forma:

• Cocchi: forma sferica regolare
• Bacilli: forma allungata
• Spiraliformi: spire più o meno ampie
• Vibrione: ricordano la forma della virgola
• Irregolari: ricordano una Y
• Stellati
• Filamentosi: simili alle muffe

Disposizione

Nei cocchi si distinguono:

• Diplococchi: 2 cocchi
• Catena (Streptococcus)
• Tetrade
• Grappolo (Staphilococcus)

Nei bacilli si distinguono:

• Catene corte
• Catene lunghe
• A palizzata: tipica dei patogeni

Osservando delle forme a birillo, all’interno è possibile notare una sfera chiamata spora (forma di resistenza) utile in condizioni non ottimali. Viene duplicato il materiale genetico per la spora, dove vengono prodotti doppi o tripli strati parietali. A questo punto il bastoncino si lisa e muore, rilasciando la spora che può sopravvivere anche per anni. Una volta trovato l’ambiente adatto, la spora avvia il processo di germinazione producendo una progenie uguale a quella che l’ha prodotta. Come si può notare dalla figura, la spora può assumere diverse forme. In alcune è possibile trovare un cristallo proteico.

Morfologia dei lieviti

Possono essere:

• Ellittici: la più comune, come il Saccaromyces cerevisiae
• Apiculati: tipica forma a limone che genera 2 gemme ai lati
• Cilindrici: riproduzione anche per schizogonia (setto che divide le due cellule figlie)

A microscopio la cellula appare molto più chiara rispetto ai batteri. La riproduzione asessuata prevede un ingrossamento (blastospora). Si può quindi osservare la cellula madre e una (o più) protuberanze con dimensione diversa in base allo stato di crescita. Si riproducono per meiosi, e si distinguono:

• Ascomiceti: formazione di un sacchetto detto asco, che contiene le spore (ascospore)
• Basidiomiceti: formazione di un basidio (struttura a clava) che formano 4 basidiospore

Morfologia delle muffe

Diversamente dai lieviti, le muffe hanno un’organizzazione pluricellulare: un insieme di filamenti intrecciati e ramificati detti ife. Le ife formano il micelio, e si distinguono:

• Micelio vegetativo immerso: serve per l’ancoraggio e l’assorbimento di sostanze nutritive
• Micelio aereo: assume una colorazione che dipende dal corpo fruttifero della spora, deputate al processo riproduttivo

Osservando le muffe al microscopio, è possibile distinguere due tipologie di ife:

• Settate: il setto presenta un canale aperto, attraverso cui il citoplasma può fluire dal centro verso l’esterno
• Asettate: prive di setti

Riproduzione delle muffe

Le muffe hanno una riproduzione asessuata, attraverso:

• Allungamento del micelio vegetativo
• Corpi fruttiferi contenenti spore sessuali: una volta liberate possono rigenerare la muffa che l’aveva generata

Le spore possono essere:

• Interne: Clamidiosporeo, Sporangiosporeo
• Esterne: Artrospore (frammentazione dell’ifa aerea), Canidiospore (spore esterne portate da strutture diverse. Il Penicillium ha un copro fruttifero che ricorda un pennello, l’Aspergillus produce un corpo fruttifero su un ingrossamento sferico detto vescicola, che ricorda l’aspersorio)

La riproduzione sessuata è poco frequente (quasi nulla in laboratorio), ma si distinguono:

• Ascomiceti
• Basidiomiceti
• Zigomiceti

Esistono inoltre i deuteromiceti: i cosiddetti “funghi imperfetti”. In questa categoria sono presenti lieviti e muffe di cui non si conosce la modalità di riproduzione.

Microscopio ottico

Il microscopio ottico è basato su un sistema di 3 lenti convesse e convergenti:

• Condensatore: sotto il piano di lavoro
• Per far passare i raggi luminosi al secondo sistema di lenti formati da: Obiettivi: sul sistema roteante, Oculari: terzo sistema di lenti

Dotato inoltre di:

• Illuminazione: fonte di energia
• Piano di lavoro: aperto per far passare i raggi luminosi
• Manopole: per mettere a fuoco il campione, possono essere macrometriche o micrometriche
• Viti: per spostare a destra o sinistra

Lenti convesse e convergenti

Questa tipologia di lente è in grado di riunire i raggi in un unico punto chiamato fuoco della lente. In base alla distanza, la grandezza dell’immagine sarà maggiore o minore. La fonte di energia è la luce nel visibile: la lunghezza d’onda della luce utilizzata per l’osservazione influisce direttamente sulla capacità di ingrandimento.

Secondo la teoria ondulatoria, la luce si propaga come onde sinusoidali di cui si riconosce:

• Ampiezza (intensità)
• Lunghezza d’onda (λ): distanza tra due onde nella massima intensità

Percorso della luce

La luce viene convogliata sull’oggetto dal sistema di lenti del condensatore. Le lenti dell’obiettivo e dell’oculare sono sistemate in modo tale da mettere a fuoco un’immagine ingrandita dell’oggetto illuminato, a livello dell’occhio dell’osservatore. I raggi diretti sono in fase, quindi lo sfondo sarà luminoso. I raggi che incontrano sono sfasati (contrasto), se sono sfasati solo di ½ λ l’oggetto risulterà scuro in campo chiaro.

Più raggi diretti e indiretti arrivano all’oculare, migliore sarà l’immagine, ma la luce attraversa mezzi con densità diverse e viene deviata: si assiste al fenomeno della rifrazione.

L’indice di rifrazione n di un materiale è il rapporto tra la velocità della luce nel vuoto e la velocità della luce in un materiale. Aria n = 1

• Acqua n = 1.33
• Vetro n = 1.53
• Olio di cedro n = 1.52

Più raggi vengono deviati e meno raggi giungono all’oculare: la nitidezza dell’immagine sarà inferiore.

Parametri di un buon microscopio ottico

I parametri che caratterizzano un microscopio sono 3.

1. Potere di definizione: Le lenti sono in grado di dare immagini nitide senza aberrazioni cromatiche.
2. Potere di ingrandimento: Obiettivi 10X 40X 100X. L’ingrandimento finale totale sarà pari alla moltiplicazione tra obiettivo e oculare → 100 x 10 = 1000X
3. Potere di risoluzione: Capacità di produrre una immagine separata di 2 punti vicinissimi. Il PR dipende da:
   • Lunghezza d’onda usata: minore sarà λ, maggiore sarà il PR
   • Densità del mezzo usato interposto tra oggetto e lente dell’obiettivo
   • Caratteristiche della lente, in particolare l’apertura numerica

Scelta dell’obiettivo

La dicitura OIL è presente solo in obiettivi 100X perché la distanza tra il vetrino e l’obiettivo viene riempita con una goccia di olio. Per questo vengono chiamati obiettivi a immersione.

Oggetti di fase

Un esempio di oggetti di fase sono le cellule microbiche, che disperse in un mezzo acquoso influenzano l’ampiezza delle onde luminose che le attraversano solo di ¼ λ. Questo impedisce di vedere le cellule scure su uno sfondo chiaro.

Il contrasto di fase dipende da 2 dispositivi che si trovano:

• Nell’obiettivo: la placca di fase, grazie ad anelli concentrici permette di riunire i raggi diretti e separarli dagli altri
• Nel condensatore: il diaframma anulare suddivide i raggi che vanno al vetrino e consente solo ad un anello della placca di fase di colpire l’oggetto; questa luce diretta si focalizza nella placca di fase dove viene variata di ¼ λ. I raggi che colpiscono la cellula non subiscono variazioni di λ.

Il diaframma anulare si deve ruotare in corrispondenza della sigla dell’obiettivo usato. La sigla PhCo X (phase contrast) presente sull’obiettivo è accompagnata da un numero o una lettera:

• X = J per 10X
• X = 2 per 40X
• X = 3 per 100X

Esami a fresco

Un esame a fresco delle cellule permette di valutare la forma reale (perché sono vive), dimensioni, rifrangenza e mobilità. È inoltre un esame rapido.

Allestimento del vetrino

Sul vetrino porta-oggetto viene posta una goccia di sospensione con il campione e coperta con un vetrino copri-oggetto.

Esami colorati

I coloranti possono essere:

• Basici: si legano ai gruppi fosforici degli acidi nucleici. Sono ad esempio: blu di metilene, violetto di genziana, cristalvioletto, fucsina basica
• Acidi: si legano ai componenti citoplasmatici. Sono ad esempio: eosina, rosso congo, fucsina acida
• Neutri: eosinato blu di metilene

In alternativa, o in aggiunta, si usano dei mordenzanti: formano dei complessi legandosi con il colorante utilizzato, rendendo migliore la successiva colorazione. Alcuni esempi: acido fenico, soluzione iodo-iodurata (liquido di Lugol).

Allestimento del vetrino per colorazione

1. Lavare il vetrino
2. Asciugare
3. Sgrassare alla fiamma per eliminare lo strato lipidico e far muovere le cellule
4. Stemperare la patina microbica sull’interno del vetrino con la spatola
5. Asciugare l’eccesso di acqua facendola evaporare
6. Fissare la patina facendo passare il vetrino alla fiamma

Colorazione di Gram

1. Violetto di Nicolle 3’
2. Liquido di Lugol
3. Lavaggio con alcool Gram (+) | Gram (-)
4. Lavaggio con acqua
5. Safranina 3’

Il colorante basico (idrofilo) violetto di Nicolle forma con il liquido di Lugol (una soluzione di iodio e ioduro di potassio) un composto liposolubile. Il lavaggio con etanolo è il passaggio differenziale:

• I batteri Gram+ trattengono il colorante basico (viola), poiché l'alcol non ha danneggiato a sufficienza la spessa parete cellulare (idrofila) che non permette al colorante (idrofobo) di uscire.
• Nei batteri Gram- l'alcool ha sciolto i lipidi della membrana esterna danneggiando la sottile parete cellulare che non è più in grado di trattenere il complesso violetto-ioduro (liposolubile-idrofobo).

La controcolorazione con safranina consente di visualizzare le cellule Gram- che hanno acquisito il secondo colorante.

Colorazione delle spore

Le spore sono impermeabili ai coloranti e possono essere colorate solo con tecniche specifiche.