Microbiologia degli alimenti

Microbiologia degli alimenti

Aspetti generali della microbiologia degli alimenti

Microbiologia — Disciplina che si occupa di microrganismi presenti negli alimenti o aggiunti. C'è una interazione tra il microbiota (insieme di microrganismi che si trovano in un particolare ambiente, può essere una pianta, suolo, corpo, aria, acqua) e alimenti/substrati (prodotti con diverse caratteristiche fisico-chimiche). Il microbiota corrisponde alla parola microflora, però ormai non si usa più come termine. L'ambiente che favorisce la moltiplicazione degli organismi viene chiamato habitat.

In base alle caratteristiche fisico-chimiche, l'alimento cerca di adattarsi. È molto importante anche l'ambiente dove si trova l'alimento e il microbiota. L’ecologia microbica degli alimenti può essere complessa o dinamica:

• Complessa — In un alimento troviamo diversi microrganismi e in varie quantità, possiamo vederla anche in tassonomia più bassa. Si possono trovare organismi in altissime concentrazioni o in bassissime, c'è una grande variabilità in termini di concentrazioni.
• Dinamica — Cambia con il passare del tempo, così come la conservazione dell'alimento e la concentrazione. In base al momento dell'analisi vedremo cariche diverse. È dinamica anche nello spazio, i microrganismi non sono diffusi in modo omogeneo in un alimento, alcuni sono in superficie altri all'interno. Si parla dello stesso alimento ma le parti analizzate sono diverse.

Bisogna definire il momento dell'analisi e avere conoscenza delle fasi di trasformazione.

Filiera alimentare

Tutte le operazioni che vanno dalla materia prima fino al prodotto finito, pronto per il consumo. Ci sono operazioni che influenzano i microrganismi presenti negli alimenti. I tre principali fattori che hanno un effetto sui microrganismi nella filiera sono:

• Tempo (crescita)
• Variazione dell'ambiente
• Contaminazione — Opportunità che i microrganismi hanno di contaminare l'alimento nella filiera alimentare

La sicurezza del prodotto finale ci interessa per la sicurezza alimentare (requisito della qualità, non causa effetti negativi al consumatore, in inglese Food Safety) e per la qualità.

Food Security — Garantire un'alimentazione che copre le esigenze nutrizionali dell'uomo.

Pericolo — Biologico, fisico o chimico, è un agente o condizione che può provocare danno all'uomo. In microbiologia ci occupiamo di pericoli biologici. La presenza di un microrganismo non per forza deve dare effetti nocivi.

Rischio — Probabilità che un evento con effetto dannoso per la salute accada. Non tutti i microrganismi patogeni hanno la stessa capacità di causare una malattia. Non esiste un rischio zero, c'è sempre il rischio che uno consumi un alimento e si ammali perché ognuno ha una sensibilità diversa a questi microrganismi. Si può lavorare per garantire un livello accettabile di sicurezza alimentare.

La microbiologia dovrebbe offrire le conoscenze necessarie per prevedere o controllare la crescita di microrganismi negli alimenti per:

• Garantire la qualità igienico-sanitaria (sicurezza)
• Assicurare e migliorare la qualità organolettica, sensoriale, nutrizionale
• Rispondere a nuove richieste da parte dei consumatori
• Tutelare prodotti alimentari artigianali

Si possono raggruppare i microrganismi in base al ruolo che hanno negli alimenti:

• Patogeni
• Tecnologici e probiotici
• Alteranti

Alcuni microrganismi possono svolgere più ruoli nello stesso alimento.

Microrganismi:

• Batteri
• Lieviti
• Virus
• Protozoi
• Prioni
• Funghi filamentosi

Tassonomia

Classificazione — Organizzazione degli esseri viventi in gruppi, chiamati taxa, in base alla loro similarità. È un sistema gerarchico nel quale ogni microrganismo appartiene a delle categorie tassonomiche. Per inserirli in queste categorie ci si basa sulle similarità. Le più importanti sono: famiglia, genere, specie, sottospecie e inferiori.

Nomenclatura — Dare un nome universalmente accettato, può essere binomiale: il primo nome rappresenta il genere, il secondo è specifico per la specie e vanno sempre scritti in latino. La prima volta che viene citato si scrive per esteso mentre le volte successive si mette il primo nome con una iniziale e il secondo nome completo, es: Lactobacillus plantarum (L. plantarum). Possono essere scritti anche i nomi in latino.

Microbiota — Eucaria, procariota e archea.

Identificazione — Assegnazione di un individuo a un taxon in base a caratteri diagnostici (che permettono di distinguere le diverse specie). La specie è la categoria tassonomica più importante perché ci dà tante informazioni e in particolare si è notato che alcune caratteristiche di interesse per l'uomo variano in base alla specie. Una caratteristica di interesse per l'uomo può essere la patogenicità (se è patogeno o no), un'altra può essere la capacità di fermentare un substrato (es. un mosto d’uva) e ci sono specie che possono o non possono farlo.

Nei procarioti, che non hanno riproduzione sessuale, non si ha la stessa definizione di specie. Si basa su caratteri di tipo fenotipico che possono essere:

• Caratteri morfologici
• Caratteri fisiologici — Temperatura ottimale di crescita
• Caratteri metabolici o biochimici — Vie metaboliche attive, utilizzo di substrati, prodotti del metabolismo e presenza di enzimi. Possono essere valutati facendo crescere i microrganismi in laboratorio.

Questi possono essere utilizzati per definire il livello di specie. La morfologia può essere cellulare o delle spore che si possono vedere ad occhio nudo con il microscopio oppure morfologia macroscopica delle colonie formate su terreni di coltura solidi o liquidi.

Problematiche

• Solitamente l’identificazione non può essere basata solo su un carattere diagnostico (un solo test), ma è necessario allestire prove parallele (es. con la colorazione di Gram non si può identificare a livello di specie). Di solito si fanno 20-30 prove in parallelo.
• Il risultato della prova è influenzato dalla conoscenza ed esperienza dell'operatore che alle volte può essere sbagliata.
• Il risultato di una prova può essere influenzato dalle condizioni di crescita di un microrganismo (il fenotipo è condizionato dall’ambiente).

Adesso ci si basa più sul genotipo che sul fenotipo, il vantaggio è che il genotipo rimane invariato dalle condizioni di crescita del microrganismo mentre il fenotipo no. Molto spesso basta solo un test e non servono prove in parallelo, l'interpretazione è più chiara e non dipende dall'esperienza dell'operatore.

Identificazione a livello di specie

Accorgimenti:

• Lavorare con una coltura pura — Da le prove per l’identificazione, è molto importante che sia una coltura pura (popolazione clonare che deriva da una singola cellula, tutte le cellule sono identiche alla cellula madre). Trapianto e coltura pura — Striscio per isolamento con lo scopo di diluire la coltura ed ottenere colonie dei ceppi. Cominciare l’identificazione con prove generali, poi più specifiche. È importante perché quello che vedremo è la risposta di una miscela di microrganismi e si può non arrivare a un'identificazione o non è corretta.
• Integrare informazioni riguardo l'origine del microrganismo.

Saggi di ri-associazione del DNA — Considera tutto il genoma dei microrganismi, identificazione basata sul confronto con un microrganismo già identificato. È basata su un riferimento e sulla similarità a livello del DNA. Il risultato è espresso come percentuale di similarità, c'è una complementarità tra DNA derivanti da diversi microrganismi. I filamenti possono essere al 100% complementari o averne di meno (hanno complementarità più bassa se i filamenti sono distanti). L’energia richiesta è maggiore quando abbiamo più legami idrogeno, intesa come temperatura di denaturazione (temperatura di melting) del DNA. Per un ibrido con 100% di complementarità sarà più alta l’energia.

In base alla T.M si calcola la percentuale di similarità tra i due microrganismi che confrontiamo. Quando la similarità è maggiore del 70% vuol dire che i due microrganismi confrontati appartengono alla stessa specie. Se è minore del 70% possiamo solo dire che il microrganismo sconosciuto non appartiene alla specie che abbiamo utilizzato come riferimento. Tramite l'assorbanza di 260 nm, per capire se il DNA è denaturato o no (260 nm DNA denaturato) durante il riscaldamento, aumenta o diminuisce quando si dissociano i due filamenti del DNA. La T è più alta se i due filamenti sono 100% complementari. Metodo che non viene utilizzato in un laboratorio di routine.

Il sequenziamento dei geni che codificano per RNA ribosomiale — Sequenziamento — Determinare nucleotidi in un segmento di DNA, il DNA è quello che codifica per l'RNA ribosomiale che fa parte dei ribosomi. Non viene tradotta.

Per i procarioti, usiamo il gene che codifica per 16s rRNA (parte della 30s dei ribosomi), per lieviti e muffe/funghi utilizziamo invece il 26S rRNA come gene. Vengono usati gli operoni perché sono trascritti tutti insieme.

Perché sono utilizzati quei geni?

• Presenti in tutti i microrganismi, non esistono senza questo gene
• Presentano zone di sequenze conservate e variabili — Zone in cui le sequenze di basi sono tutte uguali ———— in questo gene contenente 1500 paia di basi ci saranno alcune variabili sequenze uguali. Per l'identificazione usiamo le zone (variano in base alla specie), conservate (sequenza identica in quelle zone tutti i micro) si usano dopo l'amplificazione tramite la PCR, servono per la fase prima della PCR. Si usano primers universali.

Per amplificare si usa la reazione a catena della polimerasi (PCR) e servono i primers, ovvero degli inneschi che vanno a riconoscere una zona che sarà amplificata. Ed è per questo che servono le zone conservate perché ci va il primer per riconoscere il filamento. Tramite la sequenza interna, ovvero le zone variabili si può vedere il filamento.

La sequenza che abbiamo preso deve essere confrontata con altre sequenze e in base alle loro similarità si arriva all'identificazione, quindi è fondamentale avere una banca dati che contiene tante sequenze di microrganismi già identificati a livello di specie. Se il risultato di questa comparazione è maggiore del 97% vuol dire che il nostro microrganismo è uguale al microrganismo della banca dati.

Oltre queste 3 caratteristiche che codificano per l'RNA ribosomiale c'è anche una quarta ovvero “l'orologio” dell'evoluzione della specie, classifica i microrganismi in base alle loro relazioni filogenetiche. Più vicine sono due specie più la sequenza è simile.

Identificazione — Famiglia, genere, specie. C'è diversità anche in individui che appartengono alla stessa specie (biodiversità intraspecie). Bisogna essere in grado di identificare quindi sotto la specie e si chiama caratterizzazione o tipizzazione della stessa specie ma con caratteristiche diverse.

Caratterizzazione — Necessaria per studiare e descrivere la biodiversità all'interno di una specie, è basata su caratteri genetici o attraverso metodi immunologici.

Crescita microbica

La crescita microbica ha quattro fasi: fase lag/latente, fase esponenziale, fase di transizione e fase stazionaria.

• Fase lag — Fase in cui viene preso il microrganismo e viene messo nel terreno per farlo adattare e crescere, non si possono rilevare cambiamenti nella carica microbica, il numero di cellule è invariato.
• Fase esponenziale — Le cellule iniziano a moltiplicarsi. Si può calcolare la fase di crescita del microrganismo in un particolare tipo di terreno, le cellule sono molto attive e sensibili alle condizioni ambientali. Passa alla fase successiva perché esauriscono i nutrienti o accumulano sostanze con effetto inibitorio.
• Fase stazionaria — La carica microbica rimane uguale, alcune cellule si moltiplicano altre muoiono ma in ugual numero. I microrganismi sono meno attivi ma più resistenti a condizioni avverse. Entrano in uno stato di competenza, sono in grado di assimilare DNA estraneo attraverso il processo di trasformazione. Comunicano tra loro tramite quorum sensing ed entrano nello stato VCN.

Quorum sensing — Comunicazione tra cellule.

VCN — Stato vitale non coltivabile.

Per microrganismi indesiderati cerchiamo di mantenerli nella fase Lag in modo da non farli sviluppare nell'alimento. I microrganismi tecnologici invece devono passare velocemente e crescere con la maggior velocità possibile per il processo fermentativo.

Misurazione della crescita microbica

• Biomassa (torbidità)
• Conta al microscopio (conta totale e diretta)
• Conto vitale (uso di terreni di crescita, conta indiretta)

Non tutti i metodi possono essere applicati a tutti gli alimenti.

Turbidimetria — Substrato liquido con luce, le cellule riflettono alla luce, noi misuriamo la luce che passa che non viene riflessa dalle cellule. Più cellule ci sono, meno luce passa. È un metodo facile e si utilizza uno spettrofotometro. Deve essere un alimento liquido trasparente che presenta pochi solidi, quindi è una tecnica limitata. Con questo metodo non distinguiamo tutti i diversi tipi di gruppi microbiologici ma vediamo il loro comportamento insieme. Non si distinguono anche le cellule vive e quelle morte. Metodo veloce al quale non serve conoscenza da parte dell'operatore. Per riuscire a misurare i microrganismi devono presentarsi in una carica molto alta se no non si riesce.

Conta al microscopio-conta diretta — Servono vetrini particolari che si chiamano camera di Burker che sono vetrini che nel centro presentano una depressione che delimita un volume noto. Sul fondo della depressione sono incise delle righe che formano un fondo. Si preleva una aliquota e si mette in questo fondo, e si contano le cellule. C'è una formula per la conta che è cellule x ml. L'alimento deve essere liquido e trasparente e i microrganismi devono essere presenti in alte concentrazioni. Non si distingue tra cellule vive e morte ma esistono dei coloranti che ci permettono di distinguerle, ad esempio il blu di metilene, le cellule vive lo metabolizzano e lo rendono incolore mentre quelle morte rimangono blu perché non possono metabolizzarlo. Quindi le cellule blu sono morte e quelle trasparenti sono vive. Metodo veloce.

Conta vitale-conta su piastra-conta indiretta — È indiretta perché contiamo le progenie, (in quella diretta contiamo le cellule presenti nell'alimento). Seminiamo su un terreno di coltura un'aliquota del nostro alimento e i microrganismi presenti trovano condizioni ideali per lo sviluppo, si moltiplicano e formano colonie che saranno quelle che conteremo. Il risultato si esprime con ufc/ml o g (unità formanti colonie).

Questi metodi determinano le cinetiche di crescita con 3 parametri:

• Fase lag
• Velocità di crescita all'interno di un alimento
• Tempo medio di generazione

Dopo la fase stazionaria, le cellule diminuiscono perché inizia la morte cellulare. Accadono dei fenomeni che rendono i microrganismi resistenti al loro ambiente:

• Risposta generalizzata allo stress, per tutti gli stress non usa uno specifico.
• Aumento della resistenza agli stress chimici e fisici.
• Segue la fase di morte.
• Formazione di spore per alcuni organismi sporogeni.

Stress microbico

• Condizioni sfavorevoli durante la fase stazionaria come il mancato nutrimento.
• Variazione graduale dell'ambiente in cui si trova un microrganismo.
• Trattamenti per la conservazione degli alimenti come ad esempio un abbassamento di T, di pH ecc.
• Condizioni che si verificano durante la produzione di alimenti.

I microrganismi possono essere esposti a varie condizioni stressanti anche uno dopo l'altro.

Risposta allo stress

• Sviluppano meccanismi per percepire condizioni sfavorevoli e rispondere in modo da aumentare la resistenza al fattore di stress.
• Risposta generalizzata allo stress (fase stazionaria).
• Stress specifici (termici, acidi, ossidativi e osmotici).
• Risposta attraverso cambiamenti dell'espressione genica.
• Risultato: variazioni fisiologiche.
• Protezione o resistenza crociata, quindi una sovrapposizione delle risposte.
• Variazione del fenotipo = aumento della resistenza specifica.

Nella fase esponenziale i microrganismi rispondono con una risposta allo stress, nella fase stazionaria la risposta è generalizzata.

DNA — RNA — Proteine — Fenotipo

Il fattore sigma riconosce il promotore dei geni da trascrivere, esistono diversi fattori sigma che attivano geni per rispondere a condizioni di stress. Nei gram negativi si chiama sigma 70, nei gram positivi sigma B. Attivano geni di virulenza per gli organismi patogeni oltre che a geni per risposta allo stress.

Riassunto:

• Stress — Percezione dello stress — Segnalazione — Attivazione fattori sigma — Trascrizione del gruppo di geni regolati da fattori sigma — Protezione

Le cellule possono percepire una condizione di stress con variazione della struttura della membrana o per acidità. La segnalazione porta all'attivazione dei fattori sigma che trascrivono per geni che portano alla protezione.

Monitoraggio dei microrganismi negli alimenti

• Alimenti di natura liquida e solida.
• Negli alimenti non troviamo mai solo un microrganismo ma un insieme di microrganismi.
• Concentrazione variabile di microrganismi negli alimenti.

Determinare presenza e concentrazione degli organismi in un alimento, negli alimenti solidi non c'è una omogeneità nella distribuzione, quindi complica l'analisi. L'alimento non è più una coltura pura poiché è un ecosistema diversificato.