Microbiologia con laboratorio - Lezione 14

Lezione 29/10/2020

Nella lezione precedente abbiamo visto una metodica, ibridazione DNA-DNA, non semplicissima quindi

quella descrizione fatta in chiusura dove vede l’utilizzo dell’intero genoma del microrganismo è fatta in

alcuni laboratori che sono attrezzati per fare questo. L’ibridazione DNA-DNA può essere utilizzata anche per

analisi specifiche molto significative, l’esempio che vediamo è un kit che può essere utilizzato per

individuare un microrganismo che si chiama “Legionella pneumophila”, si tratta di un microrganismo che

causa una malattia detta Legionellosi simile alla polmonite (venne individuata per la prima volta in Florida a

seguito di un convegno di soldati mercenari e si ammalarono in un numero abbastanza elevato, si vede che

questa era una malattia infettiva causata da un microrganismo), una via di diffusione è ad esempio attraverso

gli impianti di condizionamento perché il suo ambiente ideale di riproduzione è nelle torri di raffreddamento,

nelle acqua che vengono utilizzate. L’identificazione del microorganismo è molto importante anche perché al

genere Legionella appartengono anche altri microrganismi che non sono patogeni. Questo è un test che

sfrutta l’ibridazione DNA-DNA ma non l’ibridazione dell’intero genoma, sono state identificate due

sequenze all’interno del genoma:

- una sequenza che è presente in tutti i microrganismi del genere Legionella

- una sequenza che invece all’interno del genere Legionella è condivisa solo da microrganismi della

specie pneumophila. Qui abbiamo un supporto in nitrocellulosa,

su questo in corrispondenza dei vari simboli

o lettere è legato o non è legato del DNA

(simbolo – significa che non è legato

nessun DNA). Quello che si fa è prendere il

DNA del microrganismo che noi vogliamo

caratterizzare e vedere se il DNA del

microrganismo va ad ibridare, a formare

una doppia elica con i frammenti di DNA

legati su questo supporto. La formazione

della doppia elica viene messa poi in

evidenza mediante una metodica di colorazione per cui la presenza del pallino azzurro indica l’avvenuto

legame. Il simbolo + indica che in corrispondenza di questo simbolo deve sempre avvenire un’ibridazione

(deve sempre comparire il colore), il simbolo – è l’opposto. Un segnale in corrispondenza della “L” ci dice

che abbiamo un microrganismo del genere Legionella, mentre la presenza di un segnale in corrispondenza

della “p”, in contemporanea al segnale della lettera “L”, significa che è un microrganismo Legionella

pneumophila. Vediamo quindi come l’ibridazione DNA-DNA può essere adattata ad un test estremamente

rapido e selettivo di laboratorio per l’identificazione specifica di un microrganismo.

Ribotyping: è una tecnica basata sull’analisi dell’RNA ribosomale, ma non prevede sequenziamento. Questo

tipo di saggio non viene fatto andando ad identificare le sequenze nucleotidiche, ma bensì viene fatto usando

enzimi di restrizione facendo un’elettroforesi e andando a vedere un’ibridazione DNA-DNA. È una metodica

in gran parte un po’ superata, ma consente di discriminare tra 4 specie diverse di Lactococcus e Lactobacillus

che sono molto simili. I segnali elettroforetici sono molto diversi tra loro.

ANALISI DEGLI ESTERI METILICI DI ACIDI GRASSI (FAME)

L’ultimo metodo molecolare che descriviamo non utilizza gli acidi nucleici ma utilizza gli acidi grassi, qui

sotto troviamo un elenco di acidi grassi di diverso tipo che si trovano nei batteri. Questa è una metodica che

comporta l’estrazione degli acidi grassi, la formazione degli Esteri metilici di questi; la composizione in

acidi grassi in una cellula batterica dipende dalla specie, quindi è in definitiva sotto un controllo genetico, per

questo c’è una forte variabilità. La modifica degli esteri metilici degli acidi grassi consente di fare un’analisi

gas-cromatografica, che consente di separare e di aver uno schema, un gascromatogramma. Ci sono grandi

data base della composizione in acidi grassi delle varie specie batteriche per cui quando noi abbiamo questo

gas-cromatogramma possiamo paragonarlo con la banca dati e avere un’informazione abbastanza accurata di

quale microrganismo noi stiamo osservando in quel momento. Questo sistema è estremamente informativo, è

una valida alternativa all’uso delle sequenze di DNA, viene utilizzata in determinate situazioni poiché è una

metodica relativamente costosa, da un punto di vista pratico nella maggior parte dei casi vengono utilizzati o

i metodi classici o i metodi molecolari che si basano sull’analisi delle sequenze degli acidi nucleici.

Che cosa è una specie batterica?

- Due microrganismi appartengono a specie diverse se le sequenze dei loro rDNA 16S hanno meno del

97% di similarità, quindi un principio di esclusione. Somiglianze maggiori al 97% non ci dicono un

granché, possono appartenere alla stessa specie ma potrebbero appartenere anche a specie diverse.

Siamo quindi sicuri solo su un’esclusione.

- Due microrganismi appartengono alla stessa specie se i loro DNA ibridizzano per almeno il 70%. A

livello genomico basta che condividano almeno il 70% di omologia di sequenza per appartenere alla

stessa specie. Ad esempio: la somiglianza del nostro genoma con quello di uno scimpanzé è intorno

al 99%, uno 0,1 % porta una differenza enorme a livello degli organismi eucarioti, qui invece

abbiamo un 30% di differenza genomica non perdono l’appartenenza ad una specie.

Questo grafico mette insieme questi due dati:

sull’asse delle x abbiamo l’ibridazione DNA-

DNA quindi la somiglianza (da 0 a 100),

sull’asse delle y abbiamo l’omologia di

sequenza a livello delle sequenze dei geni

dell’rRNA 16S (andiamo dall’88 al 100

poiché i valori inferiori non ci interessano).

Prendiamo in considerazione i dati degli

rRNA 16S vediamo che quando superiamo il

97% ci sono microrganismi che hanno una

somiglianza enorme ma complessivamente a

livello del loro genoma totale un’omologia di sequenza molto bassa. Se noi superiamo il fatidico il 70% a

livello del DNA tutti questi microrganismi hanno omologia superiore al 97%.

Questi sono 3 ceppi diversi di Escherichia coli, quello al centro è il ceppo più comune, la variazione di

sequenza all’interno di questo gruppo è dell’1,5% quindi c’è già una forte variabilità: quello in viola che è

non patogeno, ha un aumento di dimensioni del genoma del 11% in più; quello in giallo che è un ceppo

patogeno addirittura ha il 26% di differenza. Sono tutti Escherichia coli ma con careggiasti che differenti.

Tutto ciò ci fa capire che i genomi batterici sono molto plastici, molto mutabili sotto diversi aspetti, tanto è

vero che si è istituito un concetto di “pan genoma” una definizione di genoma che non è più legato al singolo

individuo ma è legato ad una popolazione, una condivisione tenendo presente anche tutta l’informazione

aggiuntiva che può derivare dai DNA plasmidici che può

essere trasmessa a livello orizzontale in modo efficace.

Le informazioni sui vari microrganismi le troviamo anche sul

manuale di Bergey di Batteriologia Sistematica, è un

microbiologo degli inizi del Novecento che si stancò dei

metodi di classificazione, più del fatto che non ci fosse una

raccolta, quindi scrisse un libro intorno al 1928 in cui elencò i microrganismi conosciuti

all’epoca con la loro classificazione; questo testo è stato aggiornato ogni 10 anni circa e

poi aggiornato da vari autori. La storia di questo manuale è un po’ la storia della

classificazione di questi microrganismi e anche delle nostre conoscenze; la prima edizione

conteneva circa 100 pagine, l’ultima invece (uscita dopo gli anni 2000) conteneva 5/6

volumi ognuno di circa 1000 pagine ognuno questo ci fa capire quanti nuovi

microrganismi siano stati descritti. Non esiste una “Bibbia” dei microrganismi ma testi

come questo dove c’è una gran parte di informazioni, esiste invece un sito ufficiale per la denominazione dei

microrganismi. Solo una minima parte dei nostri microrganismi è coltivabile, questo ha creato molti

problemi nell’analisi degli ambienti perché noi vedevamo solo quello che cresceva nei terreni da noi sfruttati.

L’utilizzo delle sequenze genomiche ha rivoluzionato perché a questo punto noi non abbiamo più bisogno di

coltivare il nostro microrganismo ma prendiamo un campione dal quale si estrae il DNA e andiamo ad

amplificare le sequenze del DNA genomico batterico, quindi noi abbiamo un’informazione che riguarda le

sequenza del DNA genomico dei microrganismi presenti in quel campione, in alcuni casi questa

informazione è abbastanza concorde con quello che si vede in laboratorio su terreni di coltura altre invece

compaiono specie che non abbiamo mai visto ma che identifichiamo in base all’informazione genetica. Oltre

ad una dedizione classica di microrganismi possibile solo su colture pure abbiamo anche microrganismi

identificati solo per loro informazione genetica che molte volte non hanno nome e cognome ma delle sigle.

BACTERIA

- Magnetospirillum magnetotacticum: questo batterio ha due flagelli, ha all’interno questi corpuscoli

opachi agli elettroni del microscopio (per questo appaiono di colore scuro) sono dei magnetosomi,

quindi depositi minerali. Altro esempio di biomineralizzaizone perché non li prende dall’ambiente

ma ha un suo processo metabolico all’interno. Un megnetosoma è un minerale che ha la capacità di

identificare il campo magnetico terrestre. Questi batteri vivono nelle acque tropicali, quindi nelle

zone adiacenti all’equatore, loro utilizzano questi magnetosomi in base alla loro collocazione: chi è a

nord dell’equatore li utilizza per andare verso il polo nord, mentre chi è a sud dell’equatore li utilizza

per andare verso il polo sud. Per questi batteri spostarsi verso un polo vuol dire anche andare in

profondità perché rispetto all’equatore il polo nord e il polo sud sono spostati verso il basso, sono

microrganismi microaerofili cioè vivono a basse concentrazioni di ossigeno che le trovano ad una

determinata profondità, per loro &egr