Microbiologia

CARATTERIZZAZIONE GENOTIPICA

Nei batteri la SPECIE è definita come un insieme di individui che posseggono:

• Una elevata similarità fenotipica, con almeno una proprietà distintiva nei confronti delle altre specie

• Una elevata omologia genetica (riassociazione molecolare DNA/DNA>70%)

• Una elevata omologia filogenetica (omologia di sequenza del gene codificante per il 16S rRNA

maggiore del 98%)

 Ceppi appartenenti alla stessa specie devono quindi mostrare un fenotipo simile

 Un fenotipo simile implica un genotipo simile, ed in questo contesto i ceppi appartenenti ad una

stessa specie devono possedere un grado di omologia della sequenza nucleotidica del loro DNA

molto alto, che è stato calcolato essere maggiore o uguale al 70%.

 Ceppi appartenenti alla stessa specie devono possedere una origine evolutiva comune, di

conseguenza l'omologia di sequenza dei loro geni 16S rDNA deve essere superiore al 97-98%.

La riassociazione molecolare DNA/DNA (detta anche omologia DNA/DNAo ibridazione DNA/DNA) è una

prova di laboratorio che prevede i seguenti passaggi:

1- Isolamento del DNA totale del ceppo batterico allo studio;

2- - Isolamento del DNA totale estratto da un ceppo di riferimento (solitamente il ceppo type di una

specie);

3- Rottura meccanica dei due DNA

4- Miscela dei due DNA

5- Denaturazione termica del campione con misura della densità ottica (a 260 nm)

6- Lento raffreddamento del campione con misura della densità ottica (in questa fase avviene

l’ibridazione, cioè il DNA dei due campioni si riassociano fra di loro)

IL GENE 16S NELL’IDENTIFICAZIONE BATTERICA

Al fine di identificare un ceppo batterico a livello di specie si utilizzano geni conservati, il più noto di questi

geni è il:

gene codificante per la subunità ribosomale 16S (16S rRNA)

Gene appartenente all’operone ribosomale batterico

I geni 16S, 23S e 5S rRNA codificano per le subunità di RNA costituenti i ribosomi batterici; l’operone

ribosomale è posseduto da tutti gli organismi viventi

Il gene che 16s rRNA è una regione ALTAMENTE codifica per il CONSERVATA tra le differenti specie di

procarioti (cioè subisce mutazioni di sequenza molto lentamente nel corso dell’evoluzione, poiché è di

importanza primaria per la vita della cellula)

OROLOGIO MOLECOLARE

cioè è adatto per stabilire le distanze filogenetiche (evolutive) tra i diversi gruppi tassonomici batterici.

Regioni conservate: uguali nella totalità dei batteri

Regioni semiconservate: identiche - o molto simili - a livello dei batteri dello stesso phylum.

Regioni variabili: molto differenti anche tra batteri imparentati. Il sequenziamento e la verifica delle regioni

variabili di due o più ceppi può servire per determinare se i batteri sono appartenenti alla stessa specie

(regioni variabili con la stessa sequenza, oppure con un grado di somiglianza maggiore del 96%) oppure a

specie differenti.

L’analisi della sequenza del gene 16S rRNA, quindi, può fornire informazioni livello di specie, per diversi livelli

tassonomici, fino al e permette di tracciare relazioni filogenetiche tra i microrganismi

CLASSIFICAZIONE

L’ordinamento degli organismi in gruppi detti TAXA (singolare TAXON) sulla base delle similarità reciproche o

delle affinità evolutive. I taxa sono categorie organizzate in un ordinamento gerarchico: ogni categoria

riunisce i gruppi del livello inferiore in base a proprietà condivise.

La classificazione utilizza tutte le informazioni conosciute: morfologia, ecologia, epidemiologia, biochimica,

biologia molecolare, fisiologia.

Oggi la tassonomia evolve rapidamente, con l’impiego di nuove tecniche molecolari.

Tipi di Classificazione

• Schema a cinque regni comprendente Monera, Protista, Fungi, Animalia e Plantae.

I microrganismi si trovano nei primi tre regni

• Schema a tre regni, basato sul confronto dell’RNA ribosomale.

Classifica i microrganismi in Bacteria (batteri veri), Archaea e Eucarya (eucarioti)

I metodi di classificazione artificiale utilizzano criteri arbitrari, scelti per motivi pratici e senza tener conto

necessariamente del loro significato biologico, per suddividere gli organismi in diversi raggruppamenti.

Con il sistema di classificazione naturale, introdotto da Linneo, si cominciarono a considerare caratteristiche

che esprimessero la natura biologica dell’organismo vivente che si stava classificando. In seguito gli studiosi

iniziarono a sviluppare sistemi di classificazione filogenetica che valutavano le relazioni evolutive tra gli

organismi viventi. Questo tipo di classificazione mira a raggruppare gli organismi in base alla loro derivazione

da un ipotetico antenato comune.

Un enorme progresso fu possibile quando si cominciò a poter utilizzare i calcolatori e a programmarli in

modo che confrontassero i dati relativi a un gran numero di caratteri, soprattutto biochimici e fisiologici, in

un gran numero di organismi per determinarne il grado di similarità. Su questa base fu sviluppato un sistema

di classificazione, detto fenetico, che raggruppa gli organismi sulla base della loro reciproca somiglianze e

dei loro caratteri fenotipici comuni.

Gli studi fenetici possono evidenziare anche possibili correlazioni evolutive, ma non sempre caratteri simili

sono indice di evoluzione comune.

Con questo sistema di classificazione quindi non emerge sempre la comune evoluzione. La tassonomia

numerica, che è l’applicazione di questo sistema fenetico, è un sistema di ordinamento tassonomico basato

sulla quantificazione delle somiglianze e delle differenze tra organismi calcolando un coefficiente di

similarità S.

Si prendono in considerazione più batteri e li si confronta fra di loro, a coppie, per un numero n di

caratteristiche. Si analizzano nei diversi batteri caratteristiche fisiologiche, biochimiche, genetiche,

morfologiche.

NOMENCLATURA

Deve avere validità internazionale:

- ogni tipo distinto è designato come specie

- la specie è designata con due nomi latini

- l’assegnazione dei nomi è basata su regole

Esempio: ogni specie ha un nome costituito da due parole:

I Parola - nome latino (bacillus) - nome di origine greca e latinizzato (staphylococcus) - nome latinizzato

(pasteurella)

II Parola - è descrittiva: Staphylococcus aureus

ESEMPIO DI NOMENCLATURA BATTERICA

SPECIE Salmonella enteritidis

GENERE Salmonella

TRIBU Salmonellae

FAMIGLIA Enterobacteriaceae

ORDINE Enterobacteriales

CLASSE Batteri

DIVISIONE O PHYLUM Procarioti indifferenti alla luce

REGNO PROCARIOTI

DIVISIONE DELLA CELLULA BATTERICA

Crescita cellulare e scissione binaria

Crescita microbica = aumento numerico

Processo di crescita di una cellula batterica prevede 2000 reazioni biochimiche di diverso tipo, quindi

necessità di elevato apporto energetico:

trasformazione dell’energia

- biosintesi di piccole molecole

- polimerizzazioni

- Cofattori e coenzimi

-

Tempo di generazione: intervallo di tempo impiegato dalla cellula per dividersi o dalla popolazione per

raddoppiarsi Es. Escherichia Coli: si duplica in

17 minuti.

Treponem Pallidum si duplica in

1980 minuti: presenta nicchie che

lo proteggono e permettono

condizioni più ottimali: può

permettersi di replicarsi

lentamente

Analisi della curva di crescita di una popolazione microbica La crescita di una popolazione

microbica può essere studiata in vitro,

allestendo una coltura detta coltura in

sistema chiuso.

In questo sistema chiuso la crescita

cellulare causa una diminuzione dei

nutrienti disponibili e un accumulo di

sostanze di rifiuto.

Se si misura il numero di cellule

batteriche presenti nel terreno di

coltura durante il periodo di

incubazione e si riportano in un

grafico i valori ottenuti in funzione del

tempo, si ottiene una curva di

crescita.

In tale curva si possono distinguere

quattro fasi: una fase di latenza, fase di crescita esponenziale, fase stazionaria e un’eventuale fase di morte.

Per tutti i batteri che si dividono per scissione binaria in un sistema chiuso la curva di crescita avrà un

andamento simile a quello nell’immagine sopra.

Al variare della specie batterica, del terreno di coltura, della temperatura e delle altre condizioni utilizzate

potrà variare la durata delle diverse fasi.

Fase di latenza: in questa fase non c’è aumento del numero di cellule. Queste ultime adattano il proprio

metabolismo alle condizioni chimico-fisiche in cui si trovano. Ad esempio, se le cellule provengono da un

terreno complesso e sono trasferite in un terreno minimo, prima di iniziare a crescere e dividersi

sintetizzano tutti gli enzimi necessari a costruire le molecole già disponibili nel terreno ricco e che ora

devono produrre de novo.

Quando cellule metabolicamente attive sono trasferite senza subire sbalzi termici in un terreno

chimicamente identico a quello di provenienza, la fase di adattamento metabolico potrà essere breve o

anche del tutto assente.

Fase di crescita esponenziale: il numero di cellule presenti nel terreno aumenta nel tempo alla massima

velocità possibile per quella specie batterica. Tale velocità si mantiene costante per tutta la durata della fase

esponenziale e le cellule si accrescono e si dividono a intervalli regolari di tempo.

In particolari condizioni la crescita batterica può essere bilanciata. In una coltura in crescita bilanciata il

numero di cellule, cromosomi, ribosomi, flagelli, singoli enzimi e quant’altro raddoppia nello stesso tempo.

Nonostante tutto alcune proprietà delle cellule si modificano durante tale fase. Tali modifiche, spesso

minime, dipendono dai cambiamenti che subisce l’ambiente esterno alla cellula, cioè il terreno di coltura.

Con la crescita batterica nel terreno si osserva una riduzione di concentrazione dei nutrienti e un accumulo

di sostanze di scarto e di molecole segnale. Esempi di proprietà che si modificano durante la fase

esponenziale sono la capacità di produrre antibiotici o di incorporare DNA all’esterno. Le condizioni di

crescita bilanciata in una coltura in batch si verificano durante la fase esponenziale solo quando la

concentrazione cellulare è bassa.

Fase stazionaria: il numero di cellule non aumenta nel tempo o perché le cellule smettono di crescere e

dividersi o perché viene raggiunto un equilibrio tra crescita e morte cellulare. Diverse sono le cause

dell’instaurarsi di questa fase:

Esaurimento di uno o più nutrienti nel terreno

- Limitazione ossigeno libero (per aerobi)

- Accumulo di sostanze di rifiuto o di molecole segnale

- Elevata densità cellulare

-

La fase stazionaria è uno stato fisiologico complesso in cui la cellula batterica mette in