Microbiologia

Microbiologia

CELLULA BATTERICA

Organismi procarioti unicellulari, hanno dimensioni 1-10 micron - il più grande è il

Thiomargarita Namibiensis, di 750 micron, il più piccolo è Mycoplasma Pneumoniae, di 0,2

micron - e sono visibili esternamente al microscopio ottico (a fresco, con colorazioni) e

internamente al microscopio elettronico.

Hanno forma regolare a causa della parete cellulare rigida.

Cocchi

Forma sferica, possono essere:

singoli;

diplococchi (Neisseriaceae);

catene (Streptococcus);

tetradi;

sarcina

ammassi (Staphylococcus).

Bacilli

Allungati, con estremità arrotondate:

singoli (Enterobacteriaceae);

diplobacilli (Haemophylus Influenzae);

streptobacillo (catena, Bacillus Anthracis);

palizzata.

Spirilli

Forma a spirale:

vibrione (Vibrio Cholerae);

spirillo;

spirocheta.

Il nucleoide è la regione del citoplasma dove si trova il materiale genetico, non separato da

una membrana.

Il DNA è di solito a doppio filamento, circolare, aploide, organizzato in un unico cromosoma.

Ci sono eccezioni come DNA lineare o con 2 cromosomi (Vibrio Cholerae). Il DNA è

compattato e superavvolto grazie a proteine associate al DNA (HU, H-NS) e a enzimi

specifici (girasi, topoisomerasi).

I plasmidi sono materiale genetico accessorio.

Nel citoplasma sono assenti i plastidi ma sono presenti dei corpi inclusi, granuli insolubili,

che accumulano sostanze utilizzabili in caso di necessità. Le sostanze di riserva sono:

carbonio

acido poli-β-idrossibutirrico, immagazzinato in presenza di fonti di carbonio ma in

assenza di zolfo, azoto, fosforo (sostanze fondamentali per la vita), viene poi

decomposto in acetil-CoA ed entra nel ciclo di krebs;

glicogeno;

magnetosomi, ricchi di ferro, nei batteri ambientali (per la decomposizione, il riciclo...),

che grazie a questo ferro fanno magnetotassi;

vescicole di gas, in batteri marini per galleggiare o per andare in profondità per

raggiungere vari nutrienti.

La membrana citoplasmatica è composta di fosfolipidi e proteine (200 tipi diversi,

compongono il 70% della membrana). Non sono presenti steroli (colesterolo) se non nei

mycoplasmi, questo fa sì che le membrane batteriche sono più fluide di quelle eucariotiche.

La membrana è un doppio strato fosfolipidico, un mosaico fluido, la cui composizione è

variabile in base alle condizioni ambientali; a temperature basse gli acidi grassi sono più

insaturi, aumentando la fluidità, a temperature alte gli acidi grassi sono più saturi, la

membrana diventa più rigida. La stabilità della membrana è data dagli opanoidi, simili agli

steroli.

Le funzioni della membrana sono permeabilità selettiva (trasporto dei soluti, omeostasi),

trasporto degli elettroni e fosforilazione ossidativa, supporto degli enzimi e molecole

trasportatrici (biosintesi del DNA, dei polimeri, dei lipidi), supporto dei recettori, delle proteine

del sistema chemiotattico, dei sensori di trasduzione, sito di ancoraggio del DNA.

Il trasporto attraverso la membrana è passivo o attivo.

Passivo, secondo gradiente, senza uso di energia.

Diffusione semplice

Sistema non selettivo, per molecole piccole e non polari come O2 e CO2.

Diffusione facilitata

Trasporto selettivo attraverso le permeasi, per molecole come il glicerolo.

Osmosi

Passaggio di acqua secondo gradiente attraverso le acquaporine.

Attivo, contro gradiente.

Trasporto ioni-accoppiato

Simporto, antiporto, uniporto. Le molecole passano attraverso la membrana grazie

a un gradiente protonico precedentemente creato - la membrana è quindi in stato

energeticamente carico, con carica positiva all'esterno e negativa all'interno. Il

gradiente si ha grazie alla respirazione cellulare (cascata elettronica, ossidazione

del glucosio per generare ATP).

Un esempio di simporto è quello della LACY (Lac permeasi), che trasporta

attivamente il lattosio in E. Coli accoppiandolo al trasporto di altri ioni; accumula

lattosio contro gradiente di concentrazione.

ABC (ATP binding cassette)

Consuma direttamente ATP, serve a importare i nutrienti (zuccheri, amminoacidi,

ioni metallici) e ad espellere sostanze tossiche/antibiotici.

Traslocazione di gruppo

Con trasformazione chimica del soluto al momento del trasporto (sistema PTS,

fosfotransferasi system), usato per la captazione di zuccheri come glucosio, mannosio,

fruttosio. Il trasportatore è una proteina transmembrana che riconosce specificamente lo

zucchero, dopo il riconoscimento PEP (fosfoenolpiruvato) trasferisce P a una serie di

proteine, enzimi Enz II (enzimi specifici) fosforilano il glucosio mentre lo trasportano -

perché solo G6P può essere trasportato nella cellula. Il glucosio è poi stoccato sotto

forma di glicogeno.

La parete cellulare è un contenitore rigido che protegge la cellula dalla lisi osmotica, da

agenti tossici chimici e biologici, e conferisce la forma al batterio. La componente principale

è il peptidoglicano.

I batteri sono divisi in Gram+ o Gram- in base alla composizione della barriera cellulare.

Essa infatti risponde in modo diverso alla colorazione Gram (cristalvioletto e safranina): il

cristalvioletto (basico) si lega ai residui acidi, si ha poi decolorazione con alcool, che dissolve

i lipidi della membrana esterna, la safranina (colorante basico di contrasto) infine si lega ai

residui acidi esposti. I batteri Gram+ trattengono il colorante blu-viola perché l'alcol non ha

danneggiato sufficientemente la parete cellulare, quelli Gram- assorbono la safranina rosa

perché l'alcol ha sciolto i lipidi.

Il peptidoglicano è composto da N-acetilglucosammina (NAG) e N-acetilmuramico (NAM),

legati con legame β(1->4) e da catene laterali (con 4 aa legati a NAM) connesse tramite

ponti interpeptidici che variano tra specie batteriche. Il tetrapeptide è composto tipicamente

da L-alanina, D-glutammato, acido meso-diaminopimelico (DAP) o L-lisina e infine D-

alanina. I legami crociati nei gram- sono tra DAP e D-alanina, nei gram+ sono composti da 5

glicine che collegano L-lisina a D-alanina.

La reazione di creazione dei ponti transpeptidici è la transpeptidizzazione, catalizzata dalle

transpeptidasi e dalle carbossipeptidasi, enzimi definiti proteine leganti la pennicillina (PBP);

essi infatti sono bersagli per la pennicillina, che li lega irreversibilmente, e per altri antibiotici

β-lattamici. I batteri pennicillino-resistenti modificano la struttura delle PBP.

Nella parete sono presenti anche acido teicoico e lipoteicoico, polimeri che contengono

residui di glicerofosfato o ribitolo fosfato, legati ad altri zuccheri, che danno quindi carica

negativa alla parete. In assenza di fosfato questi acidi sono sostituiti dall'acido teicuronico.

L'acido teicoico si lega covalentemente al peptidoglicano, quello lipoteicoico è associato ai

lipidi di membrana.

Le funzioni di questi acidi sono di dare rigidità e stabilità alla parete, di regolare l'attività delle

autolisine, di fare adesione grazie alla carica negativa e agli zuccheri specifici, di interagire

con l'ospite (sono i PAMPs che scatenano la risposta immunitaria, riconosciuti dai PRR e dai

TLR Immunologia > ^2a7afe).

Lo spazio periplasmico si trova tra la membrana esterna e la membrana plasmatica,

contiene quindi il peptidoglicano e una sostanza proteica gelatinosa, con enzimi idrolitici

(funzioni degradative di nutrimento e resistenza ai farmaci), proteine di legame (trasporto,

regolazione dell'espressione genica, chemiotassi) e lipoproteina, che lega la membrana

esterna al peptidoglicano e serve a stabilizzarla.

La membrana esterna contiene fosfolipidi, lipopolisaccaride (LPS), porine e recettori

specifici. LPS forma una potente barriera idrofila (respinge molecole idrofobiche), protegge

quindi da detergenti, antibiotici lipofili, e da sali biliari. I composti idrofili - nutrienti quali

zuccheri, amminoacidi, ioni, vitamine - si diffondono tramite le porine (omp, outer membrane

proteins).

LPS, presente nei gram-, è composto da :

lipide A, un fosfolipide contenente glucosamina fosforilata (GlcN-P) a cui sono legate

catene di acidi grassi variabili, è la porzione idrofobica, rappresenta l'endotossina

rilasciata dal batterio per lisi data dal siistema immunitario (causa shock);

core polisaccaridico, contiene carboidrati inusuali, costanti nelle varie specie, come KDO

(acido ketodeossioctonico), glucosio e galattosio;

antigene O, catena polisaccaridica variabile composta da 3-5 residui ripetuti, è la

porzione idrofilica esterna, rappresenta il maggiore antigene di superficie dei gram-

(immunogeno, conferisce specificità antigenica).

LPS è sia un PAMP che un'endotossina.

Ci sono delle eccezioni nei batteri gram-, che non producono lipide A come endotossina

ma invece lipo-oligosaccaridi (LOS), che sono fattori di virulenza e fanno evasione del

sistema immunitario imitando molecole dell'ospite. I batteri che possiedono i LOS sono

per esempio Neisseria Meningitidis, N. Gonorroheae, H. Influenzae.

LPS produce nell'ospite un effetto detto shock endotossico COLLEGARE A PATO, grave

quadro clinico che può accompagnare setticemie da batteri gram- e che comprende febbre,

ipotensione, acidosi, insufficienza renale e respiratoria, CID e multi-organ failure. Questa

complicazione ha esito fatale nel 40-60% dei pazienti, nonostante gli antibiotici.

. LPS è riconosciuto dall'ospite attraverso TLR-4 Immunologia > ^820fb7.

2. Si attiva una cascata intracellulare, con produzione di IL-1 e TNF, i sintomi sono la

risposta infiammatoria e l'aumento della permeabilità vascolare.

3. Le citochine prodotte dai macrofagi attivano le cellule T, è prodotto IFN, che amplifica la

risposta infiammatoria. LPS e le citochine aumentano la permeabilità vascolare.

4. Si ha edema (fuoriuscita del plasma dai vasi), abbassamento della pressione arteriosa,

formazione di microtrombi dall'endotelio danneggiato.

5. LPS e le citochine influenzano la funzione epatica, si ha ipoglicemia e produzione di

ormoni che sequestrano il ferro (non dev'essere più disponibile per i batteri).

6. Vengono richiamati i polimorfonucleati, che fanno fagocitosi del batterio e rilasciano

ROS, che causano danno endoteliale e infiammazione sistemica.

7. Si attivano i mastociti, che rilasciano istamina e prostaglandine, aumentando la

permeabilità vascolare.

8. Si promuove l'attività delle piastrine, con formazione di microtrombi e consumo dei fattori

della coagulazione, che porta a CID: si hanno sia trombosi che emorragie.

9. Si attiva la cascata del complemento, i frammenti di C3a e C5a aumentano la

permeabilità vascolare e promuovono infiammazione sistemica.

Infine la morte è provocata dalla combinazione di ipotensione, infiammazione sistemica

e CID, con collasso cardiovascolare e disfunzione multi-organo.

I micoplasmi sono gli organismi viventi più piccoli (150-250 nm), non hanno parete cellulare

e quindi manca un bersaglio per gli antibiotici. Sono gli unici batteri ad avere steroli nella

membrana cellulare. Sono pleiomorfi - di forma variabile. Questi batteri acido-alcol resistenti

hanno anche una parete cellulare con doppio strato fosfolipidico esterno, che contiene molte

cere (acidi micolici): fanno da barriera idrofobica, danno resistenza a coloranti, disinfettanti,

decoloranti, e molti antibiotici. Essi sopravvivono in condizioni estreme come secchezza, pH

acido, stress chimico. La struttura complessa della barriera rallenta l'importazione di nutrienti

e quindi anche la crescita. Alcuni esempi sono M. Pneumoniae, M. genitalium, M. Hominis.

Sono visibili con la colorazione di Ziehl-Neelsen (fucsina feniciata e blu di metilene).

La capsula batterica è una sostanza mucosa costituita da polisaccaridi - variabili tra specie,

determinano i tipi sierologici di batteri (ad esempio M. Pneumoniae ha 100 sierotipi - e

proteine (più raramente); è un rigonfiamento osservabile a fresco con colorazione a

inchiostro di china.

"Glicocalice" è la terminologia corretta per indicare un rivestimento polisaccaridico del

batterio: se il glicocalice è denso, nettamente definito ed esclude particelle esterne è

chiamato capsula, se è associato in modo lasso alla cellula è chiamato strato mucoso.

Le funzioni della capsula sono di dare resistenza alla disidratazione, di protezione contro

agenti tossici, di adesione alle superfici, di riserva di nutrienti, di formazione di biofilm, di

fattore di virulenza (capacità di causare malattia nell'ospite).

I fattori di virulenza dati dalla capsula sono il mascheramento di determinanti antigenici,

l'inibizione della risposta anticorpale (fattori anti-opsonizzazione), l'evitamento della

fagocitosi (interferenza con il riconoscimento dei recettori, difficoltà di adesione e

inglobamento da parte dei fagociti), la modulazione della risposta infiammatoria, la

variazione antigenica della capsula.

Lo Streptococus Pneumoniae ha circa 100 sierotipi. La sua capsula è ancorata

covalentemente alla parete, ha potere anti-fagocitario, ha basso potere antigenico ed è

bersaglio del vaccino pneumococco coniugato (PVC) - esso protegge da 98 sierotipi, viene

dato a neonati, bambini fino ai 7 anni e anziani.

Lo Streptococcus Pyogenes ha una capsula di acido ialuronico, fatto di acido glucuronico e

N-acetilglucosamina; anche essa ha potere anti-fagocitario, è totalmente non immunogena,

evade completamente il sistema immunitario.

La Pseudomonas Aeruginosa ha una capsula polisaccaridica che contiene algina

(polisaccaride viscoso), PSL (polisaccaride ricco in mannosio) e PEL (polisaccaride ricco in

glucosio). Questo glicocalice agisce come matrice polisaccaridica nei biofilm, che in questo

caso forma in superfici anche molto diverse (infezioni legate all'assistenza).

Info

Nei pazienti affetti da fibrosi cistica, P. Aeruginosa può essere isolata con fenotipo

"mucoide", con abbondante alginato e propensione a creare biofilm con resistenza ad

antibiotici e disinfettanti, e "rugoso", proprio di batteri sprovvisti di capsula che vivono in

forma isolata (planctonica) e che sono quindi più facilmente aggredibili dalla terapia.

Il Bacillus Antracis ha capsula proteica con acido poli-D-glutammico. Essa è non-

immunogenica ed è uno dei fattori di virulenza del batterio.

I flagelli sono organi di locomozione, appendici filiformi di diametro 12-30 nm composte

prevalentemente da flagellina; la flagellina è fortemente antigenica perché contiene

l'antigene H.

La tassia è la capacità di muoversi in direzione definita in risposta a uno stimolo, essa

aumenta le probabilità di sopravvivenza del batterio.

L'assemblaggio del flagello ha come primo step la formazione dell'anello MS, poi dell'uncino

e degli ancoraggi, poi della flagellina, aggiunta all'estremità.

I movimenti avvengono in risposta a un gradiente temporale, quando dopo un lungo

movimento viene percepito una diminuzione di concentrazione attraente, allora aumentano

le rotazioni e diminuiscono i movimenti lineari. Inizialmente i movimenti sono casuali,

vengono poi orientati in base al gradiente rilevato grazie ai chemiocettori o MCPs (methyl-

accepting chemiotaxis proteins).

L'endoflagello è un tipo di flagello appartenente ai batteri Spirochete (Treponema Pallidum,

l'agente biologico della sifilide, e Borrelia Burgdoferi, entrambi Gram-), che non si trova

esternamente al batterio ma nello spazio periplasmatico. Il suo movimento rotatorio produce

nel batterio un movimento a spirale che gli permette di muoversi in ambienti densi (sangue,

muco). Inoltre la sua posizione non esposta permette l'evasione del sistema immunitario.

Le fibrie (pili) sono strutture proteiche (pilina, adesine), più piccole e numerose rispetto ai

flagelli, disposte su tutta la superficie cellulare. Servono all'adesione alle superfici/mucose,

facilitano la colonizzazione dei tessuti, impediscono la fagocitosi. Sono antigenici.

Il movimento dato dai pili è detto twitching/contrazione, con adesione dell'estremità del pilo e

ritrazione.

I pili sessuali mediano il trasferimento intercellulare del materiale genetico durante la

coniugazione.

Neisseria Gonorrhoeae ha la capacità di produrre diversi antigeni nei propri pili, può aderire

alle cellule anche in presenza di anticorpi contro i propri pili originari.

Info

PAMPs riconosciuti dal sistema immunitario sono peptidoglicano, LPS, acidi teicoici e

lipoteicoici, flagellina e isole CpG non metilate (sono sempre metilate negli eucarioti).

SPORE E BIOFILM

La spora è una forma di resistenza del batterio, per sopravvivere in condizioni estreme, è

attuata tramite sporogenesi. Essa è endocellulare, in quanto si differenzia dalla forma

vegetativa (cellula madre o sporangio), è metabolicamente quiescente, sprovvista di attività

riproduttiva, è finalizzata alla protezione della cellula e del suo materiale genetico. Non è

risultato di un evento riproduttivo.

Per sporulare sono necessari al batterio circa 20 geni diversi, è caratteristica tipica di un

gruppo di batteri Gram+ - non sono però necessarie caratteristiche fisiologiche specifiche: lo

possono fare aerobi e anaerobi, fototrofi e chemiolitotrofi. I più comuni a sporulare sono i

Gram+ aerobi (Bacillus) e anaerobi obbligati (Clostridium). Le specie sporigene di rilevanza

medica sono il C. Botulinum, il C. Tetani, il C. Perfringens, il B. Cereus e il B. Anthracis.

In condizione di carenza di nutrienti la cellula batterica si differenzia in spora, questo avviene

quindi dopo la crescita esponenziale iniziale - possono mancare N o C, variare i tassi di O2

o CO2, essere presenti radiazioni ionizzanti, cambiare il pH o presentarsi essiccamento. Al

ripristinarsi delle condizione favorevoli la spora fa gemmazione e ritorna ad essere cellula

vegetativa. Il processo è dimorfogenico. Da un'unica cellula origina un'unica spora e

viceversa.

La sporulazione avviene dopo una cascata di