Metodologie di farmacologia preclinica e clinica (Farmacologia sperimentale)

SAGGI DI VITALITÀ e DI PROLIFERAZIONE CELLULARE

In farmacologia bisogna andare a fare questi saggi per valutare se una cellula è viva o morta

Bisogna valutare ciò quando si vuole vedere l’effetto di un farmaco

Quindi questi saggi servono per valutare:

• l’efficacia di un farmaco

effetti citotossici

• gli collaterali

Ad esempio, si va a valutare l’efficacia di un farmaco antitumorale = quindi si vuole andare a vedere se il farmaco è citotossico

per le cellule tumorali e se va a diminuire la vitalità (cosa positiva)

Invece se si vuole andare ad aumentare la vitalità delle cellule, un esempio può essere con le cellule neuronali nella malattia di

Alzheimer, e quindi l’obiettivo dell’esperimento è valutare se il farmaco o nuova molecola è in grado di aumentare la vitalità o

proliferazione

Definizioni:

Vitalità:

• stima del numero delle cellule vive a seguito di un trattamento sperimentale

Proliferazione:

• stima del numero di cellule proliferanti o della effettiva attività di proliferazione a seguito di un

trattamento sperimentale

Quindi una cellula vitale può essere anche non proliferativa, ma una cellula proliferativa è quasi sempre vitale

Vari tipi di saggi:

Diversi saggi sono utilizzati per determinare l’effetto di una sostanza sulla vitalità o sulla proliferazione in vitro, e possono essere:

Determinazione diretta della vitalità

• Trypan blue

- —> conta cellulare o metodi di misurazione della esclusione o inclusione di coloranti

Determinazione indiretta della vitalità

• MTT, LDH

- Valutazione della capacità di una cellula di generare un prodotto metabolico da una reazione ossidoriduttiva —> es.

Determinazione della proliferazione:

• Timidina, BrdU

- Saggi di incorporazione di nucleotidi —>

- Saggio clonogenico-CFSE —> misura la percentuale di cellule di una

popolazione in grado di dare origine ad un clone

Quindi i saggi possono essere divisi in base alla:

• Integrità di membrana

• Attività metabolica

• Attività sintetica di membrana

Saggi che valutano l’integrità

Si va a valutare l’integrità di membrana perché durante la morte cellulare, la membrana si rompe e si ha alterazione della

permeabilità di membrana

Trypan blue

Saggio del

Il trypan blue viene utilizzano anche nelle conteggio delle cellule, solamente che qua servono per contare solo le cellule morte

Il Trypan blue è una colorante che colora le cellule non vitali con un caratteristico colore blu se osservate al microscopio, mentre

le cellule vitali appaiono non colorate

Le cellule vitali hanno membrane cellulari intatte e quindi non assorbono il colorante dal mezzo circostante

Infatti, le cellule non vitali non hanno una membrana intatta e funzionale e quindi assorbono il colorante dall'ambiente circostante

Ciò si traduce nella capacità di distinguere facilmente tra cellule vitali e non vitali, poiché le prime

sono non colorate, piccole e rotonde, mentre le seconde sono macchiate e gonfie

Il metodo tradizionale per eseguire l'analisi della vitalità delle cellule blu tripan prevede la colorazione

manuale e l'uso di un emocitometro per il conteggio Svantaggi:

Vantaggi: • metodo lungo e con possibili errori soggettivi

• basso costo • non adatto ad un numero molto elevato di campioni

• necessità solo del microscopio e dell’emocitometro

Qua bisogna almeno contare dalla 100 alle 200 cellula per avere poi una stima veritiera della percentuale di mortalità delle cellule

Per velocizzare il processo di conta, sono stati sviluppati dei software che contano in automatico le cellule morte nella dish

rilascio del LDH (lattato deidrogenasi)

Saggio del

L’enzima LDH è un enzima che è presente nel citoplasma della cellula, quindi quando si trova a livello extracellulare, vuol dire

che c’è stata morte cellulare perché si è alterata la membrana plasmatica

Quindi, andando a prelevare il mezzo di coltura delle cellule, si andrà a misurare quanto LDH è presente nel mezzo di coltura

per capire quanto morte cellulare c’è stata, perché sarà direttamente proporzionale

La LDH, lattato deidrogenasi, ha come substrato il lattato che lo trasforma in piruvato

Questa reazione è NAD-dipendente

Quindi al mezzo di coltura si aggiunge lattato e NAD, e in base a quanto piruvato e NADH

ritorno si sono formati, si può capire quanta LDH è presente nel mezzo di coltura

Per capire la concetrazione di LDH, si andrà a vedere allo spettrofluorimetro quando NADH+ si forma, essendo fluorescente

Oppure si possono aggiungere degli altri substrati che sono convertiti in composti cromogeni dal LDH, e poi la loro concetrazione

è misurata tramite lo spettrofotometro

Il metodo che si utilizza viene scelto in base a quali macchinari si ha in laboratorio

Come avvengono questi esperimenti:

Si ha un dish trattato con il solo veicolo e poi si ha dei dish con al loro interno diversi

farmaci e, ad esempio, si vuole capire quale farmaco induce più morte cellulare

Dopo aver trattato le cellule con il farmaco, dopo 24-48h si va a prelevare il surnatante

e lo si va a posizione nella soluzione con la LDH e i suoi cofattori, e poi si va a leggere

l’assorbanza

Come si può capire la percentuale di cellule morte:

C’è bisogno di un controllo positivo = cioè bisogna andare ad uccidere tutte le cellule così per capire quanto è tutto LDH presente,

e questo presenta il nostro 100% di LDH che contengono le cellule

Il saggio del LDH è un test molto utilizzato essendo un enzima che si trova in molte cellule, ma ogni cellula ha una espressione

del LDH variabile

Quindi se si analizzano cellule diverse, poi dopo bisogna fare un rapporto tra la quantità di LDH che produce ogni tipo di cellula

Live dead

Saggio del

Questo saggio sfrutta sia l’integrità di membrana e sia l’attività metabolica

Infatti il test LIVE/DEAD viene utilizzato per determinare sia l'integrità della membrana cellulare che la funzione enzimatica citosolica

Quindi si utilizzeranno due sonde differenti

La soluzione di colorazione del test Live/Dead è una miscela di due sonde altamente fluorescenti,

calceina AM etidio omodimero 1,

e che marcano in modo differenziale le cellule vive e morte:

cellule vive verde

La calceina AM è un composto che serve per marcare le —> emette fluorescenza

Si basa sulla attività metabolica della cellula, quindi sono una cellula viva è in grado di fluorescere

La calceina AM è permeabile alla membrana e non fluorescente, fino a quando le

esterasi intracellulari ubiquitarie rimuovono i gruppi estere e rendono la calceina

fluorescente cellule morte

L’etidio omodimero 1 è un composto non è di per se permeabile alle membrane, dunque penetra solo nelle e le

rosso,

marca in cioè le cellule con membrane plasmatiche compromesse

L’etidio omodimero 1 è un intercalante ed è impermeabile alla membrana e si lega al DNA con elevata affinità

Una volta legata al DNA, la fluorescenza aumenta di 30 volte

Per capire quale saggio utilizzare, bisogna anche capire quale è il tipo di morte cellulare:

necrosi,

Perché se la cellula muore per allora si ha più rilascio di LDH

apoptosi,

Invece se la cellula muore per allora è meglio utilizzare il saggio Live/dead così da visualizzare i corpi apoptotici che

sono ricoperti dalla membrana plasmatica Il test MTT serve per valutare il numero delle cellule vive come funzione dell’attività mitocondriale delle cellule

Infatti il substrato MTT aggiunto alle cellule e viene metabolizzato dalle stesse ad opera di una deidrogenasi mitocondriale

metabolica

Saggi che valutano l’attività L'enzima mitocondriale succinato deidrogenasi, è attivo infatti soltanto nelle cellule vive, e la sua funzione consiste nel tagliare

l'anello di tetrazolio dell'MTT (sostanza di colore giallo) con la formazione, di conseguenza, di formazano (un sale blu/viola)

MTT

Saggio Questa reazione è valutata e misurata mediante la lettura spettrofotometrica del campione, alla lunghezza d'onda di 570 nm

Questo saggio si basa sulla attività metabolica della cellula, perché se una cellula è vitale è anche metabolicamente attiva

giallo,

Il saggio MTT è un saggio colorimetrico che si basa sulla riduzione enzimatica di un sale di tetrazolio 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

viola metabolicamente attive

MTT, che forma un cristallo di formazano in cellule = vive

difeniltetrazolio bromuro

Poi dopo, con lo spettrofotometro, si andrà a misurare la concentrazione e di formazano formato

Le cellule che hanno una colorazione molto viola, vuol dire che hanno

una alta attività metabolica e quindi ci saranno molte cellule vive

Quindi se aumentiamo la concentrazione di farmaco citotossico, la

colorazione si riduce

Se la colorazione rimane gialla, vuol dire che tutte le cellule sono morte

Possibili problematiche del saggio MTT:

La riduzione del colorante del tetrazolio dipende dagli enzimi ossidoreduttasi dipendenti da NAD(P)H in gran parte nel

compartimento citosolico della cellula, quindi:

• La riduzione dell'MTT e di altri coloranti al tetrazolio dipende dall'attività metabolica cellulare dovuta al flusso di NAD(P)H,

quindi bisogna fare attenzione ad agenti/farmaci che interferiscono con i livelli di NAD

• Le cellule con un metabolismo intrinsecamente basso riducono molto poco l'MTT, invece le cellule in rapida divisione

mostrano alti tassi di riduzione dell'MTT. Quindi è utile avere delle cellule di controllo per rapportarle alle nostre cellule

• Contenuto di glucosio —> più c’è glucosio all’interno della cellula, è più la cellula è metabolicamente attiva

• La precipitazione delle proteine del siero può creare interferenze con questo saggio —> questo è dovuto al solvente che si

utilizza, infatti è meglio non utilizzate etanolo come solvente

• Utilizzo del rosso fenolo —> il rosso fenolo è spesso presente nei terreni di coltura e può andare a interferire con la lettura

del assorbanza

• Incompleta solubilizzazione —> si possono formate dei cristalli di formazano che sono insolubili all’interno della cellula e quindi

non verranno letti dallo spettrofotometro, causano una lettura più bassa dell’assorbanza

• Confluenza —> quando due cellule arrivano a confluenza, possono andare incontro a morte o a ridurre la loro attività metabolica

prolifer