Medicina legale

La ricerca di materiale genetico si può attuare su una vasta gamma di campioni

biologici, anche su campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina per un riscontro

genetico o un eventuale scambio di persona. In casi di violenza sessuale si può

attuare una microdissezione laser per ricercare spermatozoi, una ventina di questi

basta per fare una indagine molecolare. Tutte le tracce e i reperti vanno lasciati

asciugare a temperatura ambiente, le tracce secche vanno inumidite con un

tampone ed essiccate, come gli indumenti umidi che vanno lasciati essiccare a

temperatura ambiente; invece, i reperti istologici e i prelievi sotto le unghie è meglio

conservarli a -20°C. i tamponi utilizzati per repertare devono essere DNA free, i

tamponi di riferimento sono tamponi orali.

Per quanto riguarda l’estrazione e l’amplificazione del DNA per i campioni biologici

nell’ambito della medicina legale, vi sono diverse metodiche:

- Estrazione organica di DNA aggiungendo egual volume di fenolo e successiva

eliminazione del fenolo con cloroformio/alcol. Viene utilizzato un tris-NaCl-EDTA,

un tampone a pH fisiologico e inibente DNAsi. L’EDTA serve a chelare gli ioni

magnesio e il fenolo e la proteinasi K permettono l’eliminazione delle proteine.

- Chelex: resina chelante a scambio ionico, per sottrarre gli ioni magnesio, viene

incubato a circa 100°C per denaturare le proteine e aprire la doppia elica,

pronto poi per essere amplificato

- FTA Papers: carte assorbenti di cellulosa contenenti sostanze che denaturano le

proteine e imprigionano il DNA per l’analisi

- Solid Phase DNA Extraction: basato su un substrato contenete silice

Polimorfismi del DNA: SNPs e STRs

Indagine genetica ai fini identificativi per discriminare su base genetica ogni singolo

soggetto, per fare ciò è necessario individuare marcatori genetici che consentano

questa discriminazione; questi sono marcatori che variano nella popolazione, quindi

non hanno una sequenza identica. Ad esempio, il sistema AB0 del gruppo sanguigno.

Polimorfismi -> zone del DNA in cui è presente una variazione.

Più del 99,7% del genoma è identico per ogni individuo, le differenze sono confinate

nel 0,3% del genoma ed è qui che sono presenti le variazioni interindividuali ->

marcatori polimorfi

Polimorfismo: quando la variante più rara è rappresentata da almeno l’1% della

popolazione, se <1% si parla di variante rara.

SNP: single nucleotide polymorphism, è un polimorfismo di sito tendenzialmente

biallelico, con due forme, wild type e mutata. Due alleli possono assortire 3 differenti

genotipi: AA, AT, TT. Questo polimorfismo è molto diffuso nella popolazione,

rappresenta il 90% della variabilità del genoma ed è poco rappresentativo per l’analisi

genetica.

Esiste un’altra variabilità di sequenze ripetute concentrate in determinate regioni del

DNA, le più note sono le Alu, di circa 300 paia di basi.

VNTRs: Variable number of tandem repeats, sono variazioni nel numero di unità

ripetute in tandem, esempio quante volte la sequenza CAGT è ripetuta. L’unità

ripetuta identifica i minisatelliti, quantificabili tra 8 e 100 bp, o microsatelliti, più

piccoli ma più importanti -> STRs, short tandem repeats tra 100 e 350 bp, che

può essere binucleotidico, trinucleotidico, tetranucleotidico (quella che interessa) o

pentanucleotidico. Gli alleli di questi marcatori vengono chiamati in base al numero di

unità ripetute caratterizzanti.

Prima del DNA venivano utilizzato altri marcatori come:

- Sistemi gruppali eritrocitari: AB0, Rh, Duffy, Kidd

- Polimorfismi sierici: Hp, Gc, Tf

- Polimorfismi enzimatici eritrocitari: PGm, EsD, GLO

- Polimorfismi degli antigeni leucocitari: sistema HLA

Con l’introduzione dei marcatori del DNA è stato possibile analizzare ogni liquido

biologico costituito da cellule, prima si analizzava solo il sangue. Per ottenere un

risultato attendibile si necessita di poco materiale essendo la PCR molto sensibile, un

6

milione di volte più sensibile rispetto a prima (10 ). Possono essere analizzati i cold

cases di vecchia date se presenti ancora reperti.

I primers utilizzati per la PCR amplificano solamente il DNA umano, devo analizzare

tanti marcatori contemporaneamente ed essere in grado di tipizzarli, questo viene

effettuato attraverso due criteri:

1. Seleziono i primers e posso scegliere dove inserirli, posso selezionare il range di

amplificazione di ogni singolo marcatore secondo il peso molecolare degli alleli

(es. 120-160 bp)

2. Ad ogni primer posso associare un fluorocromo differente, originando picchi di

colore specifici per ogni allele

Ottengo così un elettroferogramma contenente picchi separati per peso molecolare e

identificati con colorazioni specifiche tramite fluorocromi. Posso avere due alleli di

marcatori distinti con uguale peso molecolare ma identificati con colorazioni differenti.

Una volta estratto il DNA, tendenzialmente ad alto peso molecolare, può essere

degradato e quindi riesce a correre facilmente in un gel di agarosio poiché ha peso

molecolare ridotto

Per la separazione del DNA, essendo caricata negativamente in un campo elettrico

migra verso il polo positivo, esso si separa in base al peso molecolare in bp; dobbiamo

applicare un campo elettrico, le prime ad uscire sono le molecole a basso peso

molecolare, la separazione avviene tramite elettroforesi capillare. Nel capillare il DNA

passa tramite iniezione elettrocinetica legata al campo elettrico e al tempo; il

campione di DNA deve essere scarso di salinità poiché i Sali possono dare problemi

nella corsa capillare. Il capillare è tendenzialmente di vetro contenente silice, il DNA

migra in proporzione al suo peso molecolare, in corrispondenza dell’uscita è presente

un laser che eccita i fluorocromi legati ai marcatori, registrando il passaggio dei

marcatori e identificando i singoli picchi. L’unità di misura dell’elettroforesi capillare

genetica e 1 bp, devo discriminare sezioni differenti per 1 paio di basi. Iniezione,

separazione e identificazione sono automatizzati, generalmente le separazioni durano

20 minuti e i dati analitici sono conservati automaticamente e analizzati

successivamente.

Il peso molecolare degli alleli viene calcolato usando uno standard interno, una serie

di frammenti di DNA a peso molecolare noto che faccio migrare in elettroforesi

capillare, creando così una curva di regressione legata al tempo. È così possibile

identificare il peso molecolare di campioni ignoti in base al tempo di uscita

dall’elettroforesi.

Dopo il peso molecolare, utilizzo dei ladder allelici per attribuire un nome agli alleli

separati; i ladder allelici sono scale di marcatori già separati e identificati che

servono a confrontare alleli nuovi da identificare in base al peso molecolare.

I marcatori AMEL (amelogenina) attribuiscono il sesso dell’individuo che ha lasciato

una traccia, questi marcatori sono presenti sui cromosomi X e Y.

Il test del DNA è un esame comparativo, il profilo genetico determinato dalla traccia

deve essere confrontato con altri profili genetici, come gli indagati, con tracce

biologiche o una banca dati.

Per identificare un individuo tramite test del DNA comparativo, devo tenere conto della

presenza statistica di ogni variazione genetica, ogni marcatore è un evento

indipendente, posso quindi moltiplicare la frequenza sulla popolazione totale (0,05 x

-10

0,03…) per ottenere una statistica di 1,6632 x 10 -> un soggetto su 6 miliardi. Più

marcatori analizzo minore è la probabilità di trovare più soggetti con quelle

caratteristiche genetiche.

Questo test ha applicazione quali:

- Test di paternità

- Violenze sessuali

- Disastri di massa: 11 settembre, tsunami in asia del 2004. Ogni nazione ha un

organo di DVI: disaster victims identification. L’identificazione può essere

effettuata tramite materiali biologici molto piccoli oppure ossa/denti comparati

con oggetti delle persone scomparse o tramite un’analisi parentale.

Il profilo del DNA seve anche a scagionare individui innocenti, esiste il progetto

americano innocence project, in cui sono stati analizzati casi violenti in cui le persone

condannate non fossero realmente i colpevoli e quindi scagionate tramite l’analisi di

reperti. Una volta scagionate queste persone sono stati poi identificati i colpevoli dei

crimini in questione.

Indagini di paternità

La disciplina normativa è essenzialmente posta a tutela del figlio, la filiazione è il

rapporto intercorrente tra una determinata persona fisica e coloro che l’hanno

concepita e i soggetti del rapporto giudiziario, ovvero la relazione tra due o più

soggetti regolata dai diritti e doveri, sono il figlio e i genitori. In ambito giuridico tale

rapporto è stato aggettivato come filiazione legittima o naturale.

I presupposti per dichiarare un rapporto di filiazione legittimo sono il matrimonio dei

genitori e il parto della moglie e concepimento in costanza di matrimonio, anche se

tutti i figli hanno lo stesso stato giuridico introdotto come responsabilità genitoriale.

L’azione di disconoscimento di paternità del figlio nato può essere esercitata dal

marito, dalla madre e dal figlio stesso; chi esercita l’azione è ammesso a provare che

non sussiste un rapporto di filiazione, la sola parola della madre non esclude la

paternità. La madre può disconoscere il figlio entro 6 mesi dalla nascita o dal momento

di avvenuta conoscenza dell’impotenza di generare del marito, il marito può

disconoscere il figlio nel termine di un anno o dal momento in cui è venuto a

conoscenza della nascita ma in ogni caso l’azione non può essere proposta oltre i 5

anni dal giorno della nascita. L’azione può essere poi proposta dal figlio che ha

raggiunto la maggiore età e l’azione esercitata dal figlio è imprescrittibile.

Le indagini genetiche sono attualmente ritenute il mezzo più importante per

dimostrare con obiettività il rapporto parentale in ambito giudiziario ed

extragiudiziario, le situazioni in cui la prova biologica è ammessa sono il

disconoscimento del figlio nato all’interno del matrimonio e la dichiarazione giudiziale

di paternità in ambito di filiazione al di fuori del matrimonio. Il prelievo del materiale

biologico è incoercibile (non rifiutabile), tuttavia il rifiuto può essere valutato dal

giudice per trarre elementi di prova contrari alla parte rifiutante.

Un accertamento parentale comprende ogni accertamento genetico mirato a

stabilire il grado di consanguineità dei soggetti analizzati.

Ogni genitore trasmette metà del suo patrimonio genetico alla