Medicina interna/Immunologia clinica

ANTICORPI ANTI-FOSFOLIPIDI

Parte sono patogeni (in grado di procurare danno trombotico ++) trombosi venose e arteriose e poliabortività (interferenza su formazione del trofoblasto e quindi danneggiare l'annidamento dell'ovulo fecondato).

Si determinano con due gruppi di test differenti:

1. Test ELISA (test che usano proteine o complessi proteina-fosfolipide sulla fase solida) per la misura di anticorpi ACLA (anti-cardiolipina), anti-beta2Gpi (anti-beta 2 glicoproteina) e anti-PT (anti-protrombina)
2. Test di tipo funzionale chiamato LAC (lupus anti coagulant, perché sono anticorpi presenti nei soggetti con lupus o altre malattie autoimmuni che in vitro allungano il tempo di coagulazione), è un particolare test di coagulazione fosfolipido-dipendente

I test che misurano questi anticorpi usano o delle proteine oppure dei complessi fosfolipide-proteina (questo test detto ACLA è quello più ampio perché cattura più specificità).

il più reattivo con gli anticorpi); il ruolo di questa proteina non è chiaro ma probabilmente serve a contribuire alla creazione di una superficie anticoagulante sugli endoteli sui quali le cellule devono scorrere senza aderire. PERCHE GLI ANTICORPI ANTIFOSFOLIPIDI SONO TROMBOGENI? Sono procoagulanti, ma da soli non riescono a innescare il processo coagulativo. Innescano la formazione del trombo solo se c'è un altro fattore (trauma, infezione) che attiva l'endotelio. L'anticorpo funziona da elemento aggiuntivo per portare avanti il processo coagulativo e il suo ruolo si esplica a vari livelli. Indirettamente contribuisce ad attivare l'endotelio e le piastrine legandosi alla beta2glicoproteina, direttamente rallenta i meccanismi di fibrinolisi e interferisce con l'attivazione degli anticoagulanti naturali come la proteina C. In questo modo, l'anticorpo arriva ad accelerare la coagulazione. Dal punto di vista analitico, il suo ruolo è quello che potenzialmente

è più correlato con la malattia test funzionale (LAC) trombotica in quanto riproduce ciò che avviene in vivo nell'individuo, è più specifico ma meno sensibile dei test ELISA e ha una capacità più alta di identificare gli anticorpi potenzialmente patogeni. Inoltre, ha anche un'associazione più forte con trombosi.

In questo test si misura il tempo di coagulazione in vitro in un test fosfolipidi-dipendente (KCT, aPTT, DRVVT), aggiungendo una serie di reattivi si misura il tempo di coagulazione che è allungato se un siero contiene anticorpi anti-fosfolipidi (che causa allungamento dell'aPTT) e il tempo potrebbe essere allungato o per un difetto fattori dellacoagulazione (in questo caso aggiungendo plasma normale il tempo torna normale), mentre se il tempo torna nella norma aggiungendo fosfolipidi il LAC risulta positivo e l'aumento del tempo è dovuto alla presenza di anticorpi anti-fosfolipidi (nei 2/3 dei casi).

I casi sono anti-beta2 glicoproteina e in 1/3 anti-protrombina mentre nel 5% dei casi si hanno anticorpi anti-annessina V, proteina S e proteina C). Vanno ricercati tutti i tipi di anticorpi anti-fosfolipidi perché possono esserci varie combinazioni di positività, importante fare tutti i test (IgG e IgM).

Ci possono essere casi rari in cui ci sono manifestazioni tipiche da sindromi di questi anticorpi, ma non si riesce a dare una risposta positiva in ELISA e può succedere che ci siano o ACLA o anti beta 2 non di classi IgG o IgM ma di classe IgA (per fare il test basta cambiare l'anticorpo secondario) e ci sono in commercio anche fasi solide preparate con altri fosfolipidi che sono però più rari da trovare e non vengono misurati nella routine; si parla di sindrome da anticorpi anti-fosfolipidi sieronegativa in subset di pazienti con manifestazioni tipiche della sindrome ma persistentemente negativi a LAC, ACLA e anti-beta2GPI.

Le problematiche sono:

terapia anticoagulante interferenza con determinazione del LAC.

• non tutte le metodiche sono perfettamente standardizzate
• sono anticorpi eterogenei, quindi, vanno utilizzati test differenti per misurarne la varietà massima possibile
• il loro meccanismo d'azione non è completamente chiarito e probabilmente è eterogeneo

Nelle alcune mediate da anticorpi ANCA, sono anticorpi rari perché sono molto rare le VASCULITI SISTEMICHE. Malattie in cui si ricercano e sono anticorpi il cui titolo è abbastanza correlato all'attività di malattia. Sono determinati mediante immunofluorescenza su granuli di granulociti neutrofili fissati con etanolo e gli antigeni riconosciuti sono la mieloperossidasi (MPO) e la proteinasi 3 (PR3). L'etanolo impermeabilizza le membrane per cui il contenuto dei granuli si disperde nel citoplasma e può avere o una diffusione omogenea e la reazione da una colorazione omogenea.

del citoplasma (C-cellula, ANCA = fluorescenza diffusa tutta lereazione a PR3) o tende a distribuirsi intorno al nucleo con ANCA, fluorescenza perinucleare (P-reazione con MPO). test ELISA con PR3 o MPO nei pozzetti. Se è oggi clinico sospetta una vasculite sistemica il laboratorio fa subito un test ELISA e eventualmente se necessario una conferma con immunofluorescenza e il test ELISA fornisce un risultato quantitativo che è molto importante soprattutto quando si segue il paziente per sapere quanto anticorpo c'è. La determinazione della mieloperossidasi non è cambiata nel tempo (messa su piastra) mentre nella determinazione dell'anti-PR3 ci sono stati dei cambiamenti: - test classico è PR3 diretto con soluzione di proteina nel pozzetto che si lega nella fase di coating - ma rimanevano diversi sieri che avevano la malattia in cui non si misuravano anticorpi quin ti test migliorato bloccando la PR3 alla fase solida attraverso un anticorpo.monoclonale anti-PR3• invece di usare un anticorpo (che potrebbe interferire con le altre fasi del test) si usa una molecola inerte, test moltopiù sensibili. Questi anticorpi servono per le diagnosi differenziale di queste malattie, vanno diagnosticate in una fase precoce per identificare una terapia adeguata e importanti per fare il monitoraggio della malattia. Nelle vasculiti ANCA positive, gli ANCA sono diretti contro enzimi dei granuli dei neutrofili piccola quantità di questi enzimi può essere espressa sulà neutrofilo in una condizione di infiammazione aumentata produzione citochine proinfiammatorie incrementandoà àl'espressione in membrana del contenuto dei granuli quindi se c'è l'anticorpo si lega al neutrofili e ha una serie di effetti:•induce il neutrofilo a formare delle reti di cromatina dette NET (neutrophil extracellular traps) effetto fisiologico inà caso di noxa, ma può fare danno se

attivato in particolari organi (es. rene).

• gli ANCA inducono la formazione di NET nei neutrofili attivati
• complessi circolanti di DNA e MPO dimostrati nei sieri di pazienti con vasculite ANCA-associata in fase di attività
• nelle vasculiti è stata trovata la presenza di NET nell'organo bersaglio (biopsie renali) e in circolazione sono presenti i residui di NET (complessi di cromatina e mieloperossidasi) e in queste malattie formazione NET può avvenire per esempio a livello del capillare renale e si danneggia l'endotelio quindi il meccanismo da difensivo diventa di danno.

CITOCHINE, IMMUNITÀ INNATA E ADATTATIVA

Nella nostra difesa dagli agenti infettivi entrano in gioco numerosi fattori, il primo livello di difesa è rappresentato da barriere di tipo anatomico, come l'integrità della cute e il rivestimento mucoso (di vie aeree e intestino che sono le aree di contatto più esteso tra noi e il mondo esterno). A livello

dell'apparato respiratorio un altro meccanismo di difesa è la produzione di muco da parte delle cellule dell'epitelio e la presenza di ciglia, che con il loro movimento eliminano gli agenti estranei. Nell'apparato digerente abbiamo invece l'acidità dello stomaco e gli enzimi proteolitici. Nelle lacrime e nella saliva ci sono componenti, come il lisozima, con attività antibatterica. Poi entrano in gioco i meccanismi dell'immunità innata, in cui abbiamo componenti cellulari come granulociti, cellule NK, macrofagi, cellule dendritiche e mastociti. L'immunità adattativa, invece, coinvolge le cellule dendritiche che fanno parte dell'immunità innata ma innescano anche la risposta immune ad un antigene esogeno, attivando i processi dell'immunità adattativa con i linfociti T e B. I meccanismi di difesa dell'immunità innata includono le proteine del complemento e altre proteine come la proteina C reattiva, che ha una funzioneantimicrobica perché si lega sulla fosfofolina presente sulla parete di diversi germi e poi attiva il complemento con l'altra estremità) mentre nell'immunità adattativa il prodotto umorale sono gli anticorpi. Le citochine hanno un ruolo fondamentale di connessione tra immunità innata e adattativa e ce ne sono di diversi tipi. L'immunità innata è la prima linea di difesa contro agenti infettivi, è costituita da cellule che non hanno recettori clonali mentre la risposta immune adattativa è una seconda linea di difesa caratterizzata dall'espansione di cellule T e B caratterizzate dalla presenza di recettori clonali (nella B è l'Ig e nella T è il recettore di membrana della cellula T), è una risposta sicuramente più precisa perché ogni anticorpo riconosce uno specifico antigene e allo stesso modo la cellula T citotossica attacca la cellula per cui il suo recettore è.specifico.Le citochine servono a garantire la comunicazione tra questi diversi tipi cellulari, reclutare elementi sia dell'immunità innata che adattativa (ch