Medicina di laboratorio

Introduzione

La medicina di laboratorio studia le alterazioni dell’organismo nello stato di malattia attraverso l’esame di campioni biologici (liquidi o tessuti biologici prelevati dal paziente), da cui si ricavano informazioni utili a scopo diagnostico, terapeutico, preventivo, prognostico e riabilitativo. Quindi la finalità della medicina di laboratorio è quella di fornire informazioni.

Campioni biologici

Sangue, urine, feci, saliva, lacrime, sudore, succo gastrico, liquor, liquido sinoviale, liquido amniotico, liquido seminale, liquidi di versamento delle cavità sierose (pleurico, pericardico, peritoneale).

Marcatore biologico (o biomarker)

= parametro biologico misurabile che serve da indicatore per valutazioni di fisiopatologia o di salute (rischio di malattia, abuso di sostanze, esposizione ad agenti ambientali, gravidanza).

Il laboratorista e il clinico sono due figure distinte che devono interagire: il laboratorista aiuta il clinico nel prendere una decisione. Il clinico deve conoscere la medicina di laboratorio (quali esami di laboratorio richiedere e come interpretare i risultati).

Richiedere molte analisi inutili prima di formulare una diagnosi è sbagliato e porta a grossi sprechi economici, perciò andrebbero richiesti solo gli esami mirati. Spesso il medico richiede troppi esami per salvaguardarsi dalle responsabilità medico-legali. Il laboratorio non ha nessun controllo sulle richieste.

Suddivisione dell'organizzazione teorica della medicina di laboratorio

• Anatomia patologica (citologia, istologia)
• Biochimica clinica (chimica clinica, immunometria, elettroforesi, allergologia, ecc.)
• Microbiologia e virologia (batteriologia, micologia, parassitologia, virologia, sierologia)
• Genetica (citogenetica, genetica molecolare)
• Ematologia ed emostasi

La maggior parte delle analisi biochimico-cliniche vengono eseguite sotto forma di:

• Analisi singole (es: test di gravidanza, glicemia, colesterolo)
• Raggruppamenti storici, strumentali, profili biochimici
• Prove di funzionalità dinamiche o metaboliche (es: curva da carico orale di glucosio in caso di diabete)
• Esami di screening consentono la diagnosi precoce di determinate malattie e condizioni morbose
• Esami d’urgenza

Perché si richiede un esame di laboratorio?

• Per confermare un sospetto clinico
• Per confermare o escludere una diagnosi
• Per monitorare la terapia
• Per monitorare i livelli terapeutici di un farmaco
• Per formulare una prognosi
• Per definire la gravità di una malattia
• Per lo screening di una malattia tra persone apparentemente sane

L'esame di laboratorio deve risultare utile per:

• Scopi diagnostici
• Scopi prognostici
• Attivazione di un trattamento immediato
• Valutazione dello stato generale di un paziente
• Valutazione di patologie allo stato subclinico
• Follow up trattamento farmacologico
• Attività di ricerca

Un esame di laboratorio comprende una serie di passaggi:

1. Richiesta dell’esame
2. Preparazione del paziente
3. Raccolta del campione
4. Fase preanalitica
5. Fase analitica
6. Fase post-analitica
7. Controllo di qualità
8. Referto
9. Compatibilità dei dati ottenuti

Fase preanalitica

Fasi dell’esame di laboratorio:

1. Fase preanalitica: quesito clinico, scelta del test, richiesta al laboratorio, raccolta del campione (prelievo), trasporto al laboratorio, conservazione del campione in attesa dell’analisi.
2. Fase analitica: analisi, controlli di qualità.
3. Fase post-analitica: validazione referto, interpretazione, decisione e azione.

Variabilità in medicina di laboratorio

• Variabilità della misura:
  • Fase preanalitica: variabilità legata al paziente o alla conservazione del campione.
  • Fase analitica: variabilità legata al metodo di analisi.
  • Fase post-analitica: variabilità legata al dato.
• Variabilità biologica:
  • Intra-individuale (a carico dell’individuo): ritmi biologici, dieta, periodo mestruale, gravidanza.
  • Inter-individuale (tra diversi individui): età, sesso, razza, massa corporea, attività fisica, fumo, alcol, farmaci.

Fase preanalitica: raccolta

Variabilità legata a:

• Modalità di raccolta e conservazione del campione.
• Attribuzione del campione al paziente prima del prelievo (mai successivamente), si deve porre sulla provetta l’etichetta con il barcode in cui sono presenti tutti i dati del paziente.
• Idoneità del materiale.
• Accorgimenti per stabilizzare gli analiti.

Prelievo sangue

Dove fare il prelievo di sangue?

• Vena cubitale mediana
• Vena basilica
• Vena cefalica

NB: è importante la disinfezione della cute prima del prelievo

Dal prelievo di sangue si possono ottenere 4 diversi tipi di campioni:

• Sangue intero
• Plasma
• Siero
• Sangue intero essiccato su carta

Una volta prelevato, il sangue viene distribuito nelle varie provette in modo da ottenere i campioni da utilizzare per le diverse metodiche, che sono:

• Siero: chimica clinica, immunometria (tecnica che utilizza una reazione antigene-anticorpo per determinare la concentrazione di un analita)
• Plasma: chimica clinica, immunometria
• Plasma citratato: test coagulativi
• Sangue citratato: VES (velocità di eritrosedimentazione)
• Sangue con EDTA: emocromo

È importante usare la provetta idonea. Le provette per la raccolta di sangue intero hanno un tappo codice colore che indica la presenza di sostanze utilizzate per le diverse misurazioni. Esempi di additivi comunemente usati:

• EDTA (tappo viola): chela in modo irreversibile il calcio, ideale per l’esame emocromocitometrico.
• Sali di eparina (tappo verde): l’eparina attiva l’antitrombina III e quindi inibisce i fattori della coagulazione, adatta per l’emocromo e la chimica clinica sul plasma.
• Sodio citrato (tappo azzurro): chela in modo irreversibile il calcio, ideale per esami della coagulazione sul plasma.
• Provette vuote o con gel separatore (tappo rosso): le provette per siero hanno all’interno delle micro-particelle di silice che attivano la coagulazione quando le provette vengono invertite dopo il prelievo. Le provette per siero con separatore contengono un gel nella parte inferiore e durante la centrifugazione il gel si muove verso l’alto formando una barriera che separa il siero dalle cellule, adatte per la chimica clinica e l’elettroforesi di proteine.
• Provette per VES (tappo nero): contengono una soluzione tamponata 3,8% di tri-sodio citrato.

Per ottenere il plasma bisogna aggiungere al sangue contenuto nella provetta un anticoagulante e poi centrifugare; in questo modo la parte corpuscolata si deposita sul fondo della provetta e il plasma rimane sopra. Se non si aggiunge l’anticoagulante, alla parte corpuscolata si lega il fibrinogeno e centrifugando, o semplicemente attendendo un po’ di tempo, la parte solida si deposita sul fondo e sopra rimane un liquido (siero).

Scelta degli anticoagulanti

• Chelanti del calcio = EDTA, sale bisodico o tri-potassico, citrato di sodio, ossalato di ammonio e di potassio legano in modo irreversibile gli ioni calcio e in assenza di ioni calcio non avviene la coagulazione.
• Eparina = in commercio esiste sotto forma di sale di potassio e sodio (più economici), ma viene comunemente usato il sale di litio e ammonio. L’eparina lega l’antitrombina III (diventa 1000 volte più efficace) e quindi inattiva la trombina e il fattore X della coagulazione. Non è utilizzabile per studi morfologici delle cellule ematiche perché conferisce alle cellule una colorazione scura.

NB: il non corretto utilizzo degli anticoagulanti è una delle più frequenti cause di errore nella fase preanalitica.

Esame urine

• Recipiente di raccolta: assolutamente pulito e, in caso di urinocoltura, anche sterile.
• Campione: prima minzione mattutina.
• Urine 24 ore: alcuni parametri biochimici subiscono variazioni cronobiologiche, perciò si deve scartare la prima minzione e raccogliere in un unico recipiente tutte le urine emesse nelle 24 ore.

Prelievo liquor (liquido cefalorachidiano)

• Puntura tra la 3^ª e 4^ª vertebra lombare (L3-L4).
• Prelievo: nell’adulto circa 160 mL, nel neonato 40-60 mL.
• Permette di accertare infezioni sospette a carico del cervello (es: meningiti), verificare patologie demielinizzanti e rilevare la presenza di eventuali cellule neoplastiche.

Prelievo liquido sinoviale

• Ultrafiltrato plasmatico prodotto dalle cellule che rivestono la membrana sinoviale delle grosse articolazioni.
• Ha una funzione lubrificante e protettiva delle cartilagini che rivestono i capi articolari delle ossa.
• Puntura percutanea delle cavità intra-articolari.
• Il materiale prelevato viene posto in un contenitore sterile ed esaminato immediatamente.
• In condizioni patologiche (es: infiammazione) aumenta la quantità di liquido.

Prelievo liquidi di versamento delle cavità sierose (pleurico, pericardico, peritoneale)

• Svolgono una funzione lubrificante favorendo lo scorrimento endocavitario dei visceri, a loro volta rivestiti da una membrana sierosa come le cavità che li contengono.
• Si formano per ultrafiltrazione del plasma e vengono riassorbiti attraverso i capillari delle sierose.
• In condizioni patologiche (es: infiammazione o neoplasie) aumenta la quantità di liquido.

Prelievo liquido amniotico

• Puntura transaddominale del sacco amniotico dopo la 12^ª settimana o prima sotto controllo ecografico.
• Permette di valutare la funzionalità di organi e apparati fetali, rivelare malformazioni fetali, accertare eventuali malattie genetiche o cromosomiche.

Prelievo liquido seminale

• Permette di ottenere lo spermiogramma, cioè l’analisi del liquido seminale per valutare la qualità degli spermatozoi (forma, numero, motilità). Questo esame rappresenta lo strumento principale per la valutazione della fertilità maschile.
• Il paziente deve effettuare almeno 2-3 giorni di astinenza prima del prelievo.
• Il campione va tenuto a 37°C ed analizzato entro un’ora dal prelievo.

Criteri di non accettabilità dei campioni biologici

• Identificazione assente o incompleta
• Mancanza di informazioni necessarie per l’esecuzione dei test
• Contenitore non idoneo
• Prelievo non corretto
• Quantità insufficiente
• Rapporto sangue/anticoagulante non corretto
• Mancata aggiunta di un idoneo conservante
• Presenza di coaguli
• Emolisi evidente
• Conservazione a temperatura non corretta
• Esposizione a luce solare diretta
• Congelamenti e scongelamenti ripetuti
• Paziente non a digiuno per esami come glicemia e/o lipidemia
• Paziente non sottoposto al regime dietetico previsto
• Paziente non a riposo per test in cui il riposo è indispensabile (es: dosaggio renina)

Fase preanalitica: trasporto

Dopo il prelievo:

1. Trasporto e spedizione
2. Accettazione e verifica dell’idoneità del campione: ogni campione deve giungere al laboratorio accuratamente etichettato (nome e cognome, codice fiscale, data e ora).
3. Centrifugazione e sieratura
4. Smistamento secondo le analisi richieste
5. Eventuali trattamenti specifici
6. Conservazione

Fase preanalitica: conservazione

• Contenitori chiusi con tappi ermetici per evitare l’inquinamento e l’evaporazione di acqua e CO₂
• Refrigerare i campioni a 4°C
• Congelare a -20°C plasma e siero
• Non congelare il sangue intero
• Conservazione al buio: bilirubina, porfirine, vitamine
• Analisi entro il più breve tempo possibile

Temperature di conservazione:

• Raffreddamento (4°C): conservazione dei campioni per 2-3 giorni, al massimo una settimana.
• Congelamento (-20°C/-80°C): conservazione per tempi più lunghi.

Perché conservare i campioni di sangue?

• Ripetizione di analisi dubbie
• Ripetizione di test a esito contrastante con la patologia
• Ulteriori analisi a conferma di un’ipotesi diagnostica

Cause di alterazione del campione

• Eccessivo tempo di conservazione
• Temperatura inadeguata
• Esposizione alla luce
• Mancanza di asepsi

Emolisi = distruzione dei globuli rossi, colorazione rossa del plasma o del siero dopo la centrifugazione. È causa di errore nei risultati delle analisi perché provoca:

• Presenza di emoglobina libera
• Aumento di enzimi sierici
• Aumento di fosforo

Cause di emolisi

• Di natura biologica: difetti endogeni o fattori esogeni dei globuli rossi.
• Di natura chimica: presenza di disinfettante, detergenti o altre sostanze sulla cute, nell’ago o nelle provette oppure prelievo in zone edematose.
• Di natura meccanica: ago di piccolo calibro, aspirazione forzata in siringa, forte pressione nel travasare il sangue in provetta, violento mescolamento del sangue intero, centrifugazione non bilanciata.
• Di natura fisica: conservazione a temperature non idonee o per tempi prolungati.

In conclusione

Ci possono essere analisi errate su un prelievo ben eseguito, ma non potrà mai esserci un’analisi corretta su un prelievo eseguito male.

Fase analitica

Variabilità legata a:

• Metodo di misura
• Strumento di misura
• Esecuzione

È la fase in cui si analizzano i campioni, si segnalano eventuali non conformità e si forniscono informazioni che possono giustificare valori patologici.

Il campione può essere: coagulato, emolizzato, diluito, lipemico, itterico, lattescente, scarso non conformità. Prima di eseguire qualsiasi esame su uno strumento, il tecnico di laboratorio deve preparare lo strumento, effettuando controlli, calibrazioni, controllando lo stato dei reagenti e degli scarichi; solo dopo queste operazioni si possono caricare i campioni.

Es: taratura e calibrazione non sono la stessa cosa: la taratura di una bilancia permette di capire con quale incertezza le sue misure sono attendibili (prendi una bilancia e ci metti una massa x e vedi il valore che ti restituisce. Prendi un’altra bilancia di riferimento, che funziona correttamente, e pesi di nuovo la stessa massa. Ripeti la stessa operazione con masse diverse confrontando i valori ottenuti e alla fine del processo di taratura ti rendi conto quanto la tua bilancia è precisa). Se i valori sono accettabili bene, altrimenti la bilancia va calibrata (prendi una massa nota pesata con una bilancia campione, la poni sulla tua bilancia e modifichi lo strumento affinché restituisca un valore il più possibile vicino a quello della bilancia di riferimento. Ripeti l’operazione con masse diverse). La calibrazione di una bilancia permette di migliorarne l’accuratezza e di conseguenza di migliorare la sua incertezza strumentale.

Lo scopo della misura è quello di ottenere un valore analitico che si avvicini il più possibile a un valore reale. La qualità di una misurazione dipende sia dall’abilità dell’operatore, sia dall’affidabilità dell’apparecchio utilizzato. C’è sempre qualche incertezza nel valore di una misurazione. Per quantificare l’incertezza in una misurazione si usa accuratezza e precisione.

Attendibilità (o veridicità) = indica la qualità di un metodo (o risultato) analitico è determinata da:

• Precisione = esprime l’efficienza dello strumento, indica quanto si avvicinano tra loro diverse misure ripetute dello stesso campione (es: se salgo su una bilancia per 5 volte di fila e ottengo sempre lo stesso peso, allora la bilancia è precisa).
• Ripetibilità = concordanza dei risultati di misure successive nelle stesse condizioni sperimentali (stesso laboratorio, stesso apparecchio, stessi reagenti).
• Riproducibilità = concordanza dei risultati di misure successive in condizioni sperimentali diverse (laboratorio diverso, apparecchio diverso, reagenti diversi).
• Accuratezza = esprime quanto la misura rilevata è corretta, indica quanto un valore medio si avvicina al valore vero (es: se peso su una bilancia un oggetto di 9 kg e ottengo una lettura di 8,7 kg, allora la bilancia non è accurata).
• Specificità = capacità del metodo di misurare solo la sostanza da analizzare, senza interferenze da parte di altre sostanze presenti nel campione.
• Sensibilità = capacità del metodo di dosare anche piccole concentrazioni della sostanza da analizzare (valore minimo quantificabile).

Errori di misura

• Errore totale = differenza tra il valore vero e il valore misurato, risulta dalla somma di: errore casuale + errore sistematico + errore grossolano = errore totale.
• Errore casuale = è la somma di tutte le piccole e imprevedibili variazioni nell’esecuzione delle operazioni analitiche; non può essere eliminato, ma stimato e limitato facendo tante misure ripetute.
• Errore sistematico = si ripete tutte le volte che si effettua lo stesso tipo di analisi con lo stesso metodo: dipende da imperfezioni dello strumento di misura o da disattenzioni costanti dell’operatore.
• Errore grossolano:
  • Sbaglio = è un errore di notevole entità dovuto in genere a disattenzioni dell’operatore (es: confusione tra campioni, errori di calcolo).
  • Occasionale = si verifica occasionalmente, è spesso grande e provoca un significativo scostamento di un singolo dato da tutti gli altri.

Controlli

Allo scopo di tenere sotto controllo l’efficienza dei metodi di misura, ed in particolare la precisione e l’accuratezza, si utilizzano i sistemi di controllo di qualità. Esistono 2 tipi di controlli:

• Controllo di qualità interno (CQI)
• Controllo di qualità esterno (CQE) o valutazione esterna della qualità (VEQ)

Per legge sono obbligatori entrambi; i controlli interni andrebbero eseguiti ad ogni seduta analitica.

Controllo di qualità interno (CQI)

Per effettuare un controllo di qualità...