Lezioni, Microbiologia

Lezione del 10/03/2011

Enzimi: catalizzatori biologici

Sono proteine e quindi macromolecole di natura proteica costituite da una catena di amminoacidi, di monomeri legati fra loro con legami covalenti che coinvolgono il gruppo amminico e carbossilico dell’amminoacido adiacente formando un legame peptidico. Sono caratterizzati da una sequenza amminoacidica con catena direzionale, avremo ad una estremità un amminoacido con gruppo amminico libero e all’altra il gruppo carbossilico libero; questa sequenza di amminoacidi viene definita struttura primaria, codificata a livello genetico.

Gli enzimi sono le proteine che hanno una struttura primaria molto complessa ma determinante per conferire all’enzima proprietà catalitiche. La struttura tridimensionale si forma tramite ripiegamenti della struttura primaria che avvengono attorno ai legami singoli presenti nella catena, e che fanno sì che la catena possa assumere una struttura 3D che può ricordare una struttura ad elica o a foglietto.

Accade che la catena primaria si organizza nello spazio formando legami deboli (legami a idrogeno) tra diversi residui amminoacidici, dando una conformazione caratterizzata da minore energia libera e quindi più stabile rispetto alla primaria. Quando questi legami a idrogeno si formano, la conformazione è quella ad elica, ma può succedere anche che una catena primaria possa formare delle zone, cioè possa ripiegarsi in modo tale da disporre vicine nello spazio delle sequenze di amminoacidi che si trovavano più lontane tra di loro e le iterazioni dei legami a idrogeno che si formano tra amminoacidi della catena primaria possono far assumere alla proteina un diverso tipo di struttura secondaria.

Questi sono ripiegamenti nello spazio che non fanno assumere alla proteine una struttura globulare. La struttura terziaria si ottiene con ulteriori ripiegamenti su se stessa, che portano diverse regioni, anche lontane della struttura primaria, vicine, tramite legami deboli, facendo assumere al complesso un'energia libera minore e conferisce maggiore stabilità. Per esempio, tutte le regioni con carattere idrofobico vengono poste all’interno della molecola in modo da non essere rivolta nella soluzione acquosa nella quale gli enzimi lavorano.

Abbiamo visto che alcune proteine sono immerse nella membrana citoplasmatica, ed in quel caso la struttura che devono assumere per essere stabili in un mezzo fosfolipidico, e quindi idrofobo, deve essere tale da esporre in questa zona degli amminoacidi idrofobici, stabilizzando il polimero. Questi ripiegamenti che danno origine alla struttura globulare sono essenziali per la forma specifica e creano zone nel polipeptide che servono per la loro attività enzimatica.

Alcuni enzimi, come i regolatori, sono caratterizzati anche da una struttura quaternaria tramite assemblamento di più strutture terziarie, che possono essere uguali o diverse tra loro a seconda del tipo di enzima. Ad esempio l’esochinasi.

Meccanismo di funzionamento degli enzimi

L’enzima possiede una tasca che è complementare al substrato, ed è in grado di accoglierlo, in modo selettivo, formando legami deboli tra il substrato stesso ed i propri amminoacidi. Tale tasca è presente nella struttura 3D.

Quello che avviene è una variazione della struttura tridimensionale dell’enzima. Gli enzimi sono strutture dinamiche perché man mano che reagiscono con i substrati modificano la loro struttura. La struttura 3D è in grado di accogliere il substrato modificando la sua struttura parzialmente e trasformando il substrato in un prodotto che non può più reagire con l’enzima e viene quindi rilasciato. Quindi la catalisi enzimatica avviene secondo questo principio di base.

Possono essere coinvolti più substrati contemporaneamente. La presenza di un enzima non modifica la termodinamica della reazione né l’equilibrio ma modifica la cinetica.

Catalisi enzimatica

Secondo il principio di attivazione, una reazione termodinamicamente possibile deve avere un'energia libera dei prodotti minore dei reagenti. In assenza di catalizzatore, il substrato deve superare una barriera energetica pari all’energia di attivazione, tale da rompere l’energia dei legami. Spesso l’energia di attivazione viene superata quando l’urto efficace supera tale energia. Con l’enzima, questo delta energetico si abbassa, quindi dobbiamo fornire meno energia.

Questo avviene con il sito attivo dell’enzima e grazie alle modificazioni conformazionali dell’enzima. Nel momento in cui l’enzima viene strutturato, si formano dei legami deboli che liberano una certa quantità di energia che modifica la conformazione dell’enzima e rende la tasca non più perfettamente complementare al substrato ma la rende complementare a quello che sarà il prodotto maggiore, quindi sarà il prodotto ad avere un'affinità temporanea con l’enzima. E questo è quello che si ha nella transizione tra substrato e prodotto, e il sistema enzima-substrato ha un'energia libera minore rispetto al substrato o comunque ad uno strato di transizione tra substrato e prodotto in assenza di enzima.

Quindi la reazione enzimatica avviene secondo un percorso diverso da quello in assenza di catalizzatore, l’enzima forma uno stato di transizione con energia libera minore e quindi l’energia di attivazione è minore. Nel caso di reazioni enzimatiche con più substrati, questi possono essere portati vicini l’uno all’altro in modo da ridurre l’energia libera e da aumentare la probabilità di urto efficace tra i substrati. La conformazione di un enzima consente di avere determinati prodotti.

Le caratteristiche della catalisi enzimatica sono la catalisi regio, stereo ed enantio specificità. Gli enzimi sono catalizzatori capaci di riconoscere molecole simili tra loro ma con differenze essenziali, ad esempio se molecole differiscono nella posizione di un sostituente, e quindi può essere stereo ed enantio specifici capaci di riconoscere diversi stereo isomeri (cioè stessa struttura grezza ma diversa disposizione nello spazio, struttura R-S in caso di centro chirale).

La catalisi enzimatica riconosce il substrato anche in una miscela di molecole ed è essenziale perché questa non generi soltanto una molecola in un certo tipo di prodotto. Inoltre, sono noti i catalizzatori biologici per lavorare a temperatura ambiente e pH neutro. Non formano sottoprodotti ed essendo biopolimeri sono facilmente degradabili. Lavorano bene in ambienti acquosi, e lavorando in condizioni diverse dal normale, essi non funzionano.

Alcuni enzimi, per avere la loro attività, richiedono anche dei cofattori, molecole organiche o inorganiche in assenza delle quali non si può avere catalisi. Noi dobbiamo sapere se l’enzima che permette la degradazione di un certo inquinante ha bisogno di cofattori. Tra i cofattori vi sono: ferro, manganese e zinco oppure molecole organiche non polimeriche. Alcuni coenzimi sono molto simili al monomero degli acidi nucleici.

Un'altra informazione essenziale è sapere se gli enzimi sono esocellulari o endocellulari, cioè nel secondo la cellula li sintetizza e poi li utilizza nel suo interno, nel primo caso subiscono quei processi di trasformazione e trasporto fino ad essere rilasciati nell’ambiente esterno. Un enzima endocellulare se vogliamo utilizzarlo al di fuori della cellula funzionerà meno dell’altro. Se ci serve un enzima endocellulare sarà più utile usare la cellula stessa.

Enzima costitutivo se viene prodotto dalla cellula e la produzione non dipende dalle condizioni ambientali in cui la cellula vive. Enzima inducibile viene prodotto a grandi concentrazioni in determinate condizioni ambientali. Sono noti migliaia di diversi enzimi ma riconducibili a 6 diverse classi in base alla reazione che devono catalizzare.

Ogni enzima può essere classificato in base alla reazione che catalizza e al substrato che trasforma. Esempio l’esochinasi catalizza il trasferimento di un gruppo fosforico da un ATP al glucosio quindi è una transferasi, glucosio fosfo transferasi.

Alcuni enzimi lavorano bene a temperatura ambiente in soluzioni acquose a pH neutro. Dobbiamo sapere come le condizioni ambientali vanno ad influenzare l’attività dell’enzima. Dobbiamo decidere come valutare l’attività enzimatica cioè in termini di velocità specifica di reazione, cioè come la quantità di prodotto formato nel tempo normalizzata per la quantità di catalizzatore cioè su grammi di proteine. Come vedremo questa velocità specifica di reazione è la velocità specifica iniziale di reazione.

Partiamo dalla concentrazione iniziale di substrato ed è ovvio che per considerare la variazione di questa velocità in funzione di altri parametri dobbiamo mantenere altri parametri costanti tra cui la concentrazione di enzima.

Cinetica enzimatica

Primo caso: T pH costanti. All’aumentare della concentrazione di substrato la velocità specifica aumenta ma la relazione non è lineare perché il sistema è saturabile, quindi man mano che aumenta S l’incremento di v è sempre minore e tende ad un valore massimo, spiegabile al concetto di saturazione.

La catalisi enzimatica prevede interazione di substrato con il sito attivo e quindi a parità di concentrazione di enzima, aumentando la conc di S, ogni molecola troverà sito attivo libero fino a saturazione continuando ad aumentare S, tutte le molecole di enzima sono già occupate. Quindi raggiungiamo una velocità max., sperando che essa sia sufficiente per garantire un biorisanamento. Raggiunta la velocità max, il processo di disinquinamento impiegherà più tempo.

Cinetica di Michaelis-Menten: La velocità specifica di reazione è uguale alla formula delle slide, dove vmax è la velocità specifica max mentre Km è quella concentrazione di substrato alla quale la velocità specifica di reazione è pari alla metà di vmax. Cosa ci dice Km? Ci dice che se abbiamo conc di S superiori a Km abbiamo velocità di azione enzimatica elevate, se scendiamo avremo che per piccoli decrementi di conc di S, abbiamo delle grosse diminuzioni delle velocità di reazione.

Se partiamo da concentrazioni elevate, il nostro inquinante viene degradato ma quando arriviamo a conc di S vicino a Km avremo velocità di reazione basse impiegando tempi lunghi per degradare il residuo inquinante. Km ci dà un'idea dell’affinità dell’enzima con il substrato.

Esempio: Prendo due enzimi differenti caratterizzati dalla stessa vmax ma due Km diversi corrispondenti a due diverse conc di S, e uno stesso substrato. Se lavoriamo con l’enzima 1, abbiamo la metà di vmax corrisponde a conc di S molto più piccole di quelle dell’enzima 2. Lavoriamo meglio con l’enzima 1.

Sono molto importanti altri fattori ambientali che sono temperatura e pH. Ma a quale ambiente ci riferiamo? A quale pH lavoriamo meglio (pH di falda o marino). Dobbiamo sapere come si comporta l’enzima in diverse condizioni.

Secondo caso: T cost e S cost. Abbiamo un valore massimo di velocità in corrispondenza di pH detto ottimale, solitamente per molti enzimi endocellulare il pH ottimale è quello vicino alla neutralità ma molti enzimi esocellulari possono avere pH ottimale lontano dalla neutralità. La catalisi enzimatica si basa sulla formazione di legami deboli tra enzima e substrato e questi legami possono cambiare in funzione del pH, quindi il pH può cambiare lo stato di associazione e dissociazione di alcuni gruppi funzionali e quindi la funzionalità del sito attivo.

Terzo caso: pH cost e S cost, vario T. L’andamento è come da slide cioè la velocità di reazione aumenta all’aumentare della temperatura, aumentando gli urti efficaci superando l’energia di attivazione. Ma questo aumento non è infinito perché gli enzimi sono strutture globulari e la loro struttura è tenuta da legami deboli quindi aumentando la temperatura oltre determinati valori si possono rompere tali legami denaturando l’enzima e facendo rimanere l’enzima in struttura secondaria o primaria, perde la struttura terziaria.

Molti enzimi possono essere inibiti dalla presenza di alcune molecole in ambiente di reazione, sia in ambito citoplasmatico, quando una molecola viene portata dall’esterno all’interno della cellula, oppure anche per enzimi extracellulari. L’inibizione può essere divisa in due tipologie: reversibile o irreversibile. La seconda si ha quando l’enzima non acquisisce più la sua funzione, mentre la prima quando viene inibito per un tempo determinato.

In quest’ultimo caso possono essere di tipo competitiva, non competitiva, incompetitiva e da substrato. Quella competitiva si ha quando una molecola può interagire in modo reversibile formando dei legami non covalenti con l’enzima interagendo con il sito attivo della molecola enzimatica. L’enzima può legarsi con la molecola inibitrice, formando un complesso enzima-inibitore che non catalizza la reazione. Questo succede quando la molecola inibitrice è molto simile alla molecola substrato e quindi, essendo in realtà diversa, non viene trasformata in prodotto.

Questo complesso si può dissociare, in quanto sono processi reversibili, e l’enzima può legare un substrato e trasformarlo in prodotto. Come si va a modificare la cinetica di reazione? Si osserva la classica curva della velocità di reazione in funzione della conc di substrato (Michaelis-Menten tipica). In caso di inibitore, questo compete con il substrato e avremo che la molecola di enzima sarà in parte complessata a substrato e in parte complessata a inibitore, quindi la velocità di reazione diminuisce, perché è come se avessimo una concentrazione di substrato un po’ più bassa rispetto a quella presente senza inibitore.

Quindi se aumentiamo la conc di inibitore si ha la formazione di complessi inibitore-enzima ancora più alte e quindi diminuiamo la velocità di reazione. Se noi teniamo costante la concentrazione enzima e quella dell’inibitore e aumentiamo quella di substrato avremo che l’equilibrio si sposta e tenderà a legarsi l’enzima con il substrato e non con l’inibitore, riuscendo ad ottenere la velocità max di reazione, ma avremo un Km diverso (detto apparente), perché la Km dell’enzima è quella con assenza di inibitore.

Quindi questa inibizione reversibile influenza la Km ma non influenza la vel max aumentando la conc di substrato. È ovvio che non possiamo aumentare la conc di inquinante per far avvenire la reazione, ma avviene principalmente in ambito fisiologico. In altri casi l’inibitore non si lega allo stesso sito attivo su cui si legherebbe il substrato e può farlo nel caso specifico della inibizione reversibile incompetitiva, in cui l’inibitore si lega al complesso enzima-substrato in un sito diverso.

Questo induce una modifica della struttura tridimensionale che rende incapace l’enzima di trasformare il substrato in prodotto. Trattandosi anche in questo caso di un legare reversibile, la reazione procede e quindi è regolata dalle concentrazioni dei reagenti. In questo caso specifico vengono modificate sia la velocità max che la Km, si può osservare un abbassamento di entrambi i parametri.

Esiste una situazione in cui abbiamo questo caso, ma l’inibitore lega sia il complesso enzima-substrato sia enzima libero su un sito diverso di quello del substrato e ci si trova nel caso di inibizione reversibile mista modificando ancora sia la Km che vel max. Se poi la cinetica di formazione del complesso enzima-inibitore ed enzima-substrato-inibitore, quindi la K1 e la K1’ sono uguali, viene detto inibizione reversibile competitiva ed abbiamo in presenza di inibitore diminuisce la vel max di reazione e rimane costante la Km (caso particolare).

Quando sfruttiamo la capacità dell’enzima in ambiente complesso, dobbiamo tener presente che la presenza di alcune molecole può influenzare i parametri tipici di questo tipo di processi. Un altro esempio di inibizione è quella da substrato. In caso di una certa concentrazione di substrato, esso oltre a legarsi al sito attivo dell’enzima può legarsi anche ad un altro sito attivo dello stesso enzima, modificando la struttura proteica e rendendo inefficace l’enzima. Esso è anche reversibile e l’effetto è che la reazione procede con velocità maggiori man mano che aumenta la conc di substrato ma oltre una conc di substrato la velocità di reazione diminuisce tanto più è alta la concentrazione di substrato.

Ci può essere il caso in cui essendo in presenza di un inquinante che può essere degradato da un processo enzimatico, può accadere che la concentrazione di inquinante è superiore rispetto a quella per cui si ha inibizione da substrato andando a ridurre le velocità di degradazione dell’inquinante stesso. Oltre ad essere inibiti, gli enzimi possono essere anche regolati. Una molecola può modificare l’attività enzimatica, aumentandola o diminuendola. Possiamo avere la regolazione allosterica con formazione di legami non covalenti, e la regolazione mediante la formazione di legami covalenti.

Gli enzimi regolati catalizzano la reazione con velocità differenti a seconda della conc di substrato e a seconda della presenza o meno di queste molecole che possono regolare l’enzima, chiamate modulatore. Questi reagiscono con l’enzima in un punto diverso del sito attivo, e in ogni caso pr...