Lezione 2 - Fisiologia vegetale

MODELLO TOPOLOGICO DELLE PROTEINE:

Studiando la sequenza amminoacidica di una proteina si può capire quante volte

questa passa attraverso la membrana.

Ad esempio se trovo una sequenza di amminoacidi idrofobi avrò una sequenza

transmembrana, se invece trovo amminoacidi idrofili avrò gruppi citosolici o

extracitosolici.

Nella pompa protonica le alfa eliche transmembrana si raggruppano e formano un

dominio chiamato M.

Dalla parte del citosol invece abbiamo due loop che formano due domini. Il loop

piccolo forma il dominio A, il loop più grande invece forma il dominio P (fosfato) e il

dominio N.

In carbossi-terminale è presente una lunga sequenza amminoacidica che sembra

chiudere la proteina su se stessa, infatti questo dominio è chiamato R, dove R sta per

regolatore.

Meccanismo di funzionamento dell’H+ATPasi:

La proteina nello stato E1, detto di riposo, si lega inizialmente al protone e poi all’ATP.

La fase successiva è l’idrolisi dell’ATP e il legame della proteina con il fosfato e in

seguito con una molecola d’H2O.

L’H+ATPasi passa alla conformazione E2, quindi è aperta verso l’esterno, inoltre

l’affinità per il protone diminuisce, quindi questo viene rilasciato.

A questo punto viene idrolizzato il fosfato, e la proteina torna alla conformazione E1 e

ricomincia il ciclo.

Funzioni dei domini:

Ci sono 5 domini:

Il dominio M lega il protone, il dominio N è una chinasi quindi lega l’ATP, lo idrolizza e

attacca il fosfato sul dominio P.

Il dominio A quando la proteina si chiude ostruisce il semicanale che porta al sito di

legame del protone.

Il dominio R, regolativo può chiudere o meno la proteina.

Quando non è presente il fosfato R si lega ad N (sito di legame dell’ATP) e chiude tutta

la proteina.

Il sito catalitico N dunque non può legarsi all’ATP e non avviene il ciclo di reazione.

Sistemi di segnalazione ormonale provocano la fosforilazione di R che si stacca e la

proteina si apre.

Se la proteina deve essere inattivata delle fosfatasi rimuovono il fosfato, ciò serve a

modificare la differenza di potenziale di membrana.

Funzionamento dell’H+ATPasi: (la prof lo ha rispiegato per la terza volta per

aggiungere qualche dettaglio)

Nel dominio M è presente un sito di legame ad alta affinità per il protone. In questo

sito è presente un semi-canale. Il dominio N attacca il fosfato derivante dall’ATP sul

dominio P attraverso un legame estereo con un amminoacido. La presenza di questo

fosfato modifica la struttura della proteina che passa alla conformazione aperta verso

l’esterno (E2).

Il semi-canale si chiude e l’affinità si abbassa, dunque il protone viene rilasciato nella

parete. Si ha un altro cambio conformazionale, l’ADP si stacca e si stacca anche il

fosfato. Si ritorna alla conformazione aperta verso l’interno (E1).

Il lavoro della proteina dunque crea un accumulo di H+ all’esterno rispetto al citosol.

All’interno la concentrazione di H+ è di 0,1 micromolare, mentre all’esterno è circa

100 volte più grande quindi 10 micromolare. Ciò porta alla differenza di potenziale di

120 mV.

Tipi di pompe protoniche in una cellula vegetale:

Si suddividono in tre gruppi:

1) quelle del plasmalemma (appena viste) dette pompe P;

2) quelle che stanno sul tonoplasto dette pompe V e portano due protoni dentro al

vacuolo per ogni ATP;

3) le pompe F, sintetizzano un ATP ogni 4 protoni e si trovano sui plastidi. (lavorano al

contrario rispetto alle prime due);

Le pompe V scindono il pirofosfato e portano e portano il protone dentro al vacuolo.

Queste pompe non sono ancora studiate a fondo quindi il meccanismo non è del tutto

chiaro.

Nel resting state le pompe V sono rivolte verso il citosol, legano due protoni su due siti

di legame e poi il pirofosfato.

Si ha l’idrolisi del pirofosfato e attraverso un meccanismo non ancora chiaro si ha la

modificazione conformazionale. Si ha l’apertura verso il vacuolo e il distacco del primo

protone, in seguito il secondo protone passa nel sito di legame del primo.

La presenza dei protoni nella parete genera un ph medio di circa 5/6 mentre nel citosol

è di 7.5.

All’interno dei vacuoli invece grazie alle pompe V il ph è acido (da 3 a 6).

La cellula ha bisogno di una rete omeostatica per tutti gli ioni, per esempio esistono

pompe del calcio che lo compartimentalizzano all’interno degli organuli oppure lo

portano all’esterno della cellula.

Il calcio è tossico nella cellula perché legandosi al fosfato precipita, inoltre deve essere

tenuto basso perché serve a meccanismi di segnalazione cellulare.

Altre pompe sono le heavy metal ATPasi, sono simili alla pompa protonica ma

differiscono da questa per il dominio M.

Grazie alla differenza di potenziale di membrana data dall’H+ATPasi è possibile il

traffico di molecole contro gradiente all’esterno o all’interno della cellula, questo è

detto trasporto attivo secondario. (Il trasporto primario è quello delle pompe stesse)

Come avviene il trasporto contro gradiente di concentrazione e di carica? Ci sono 2

modi semplificati:

Esempio 1: Ho una molecola equamente ripartita tra l’esterno e l’interno di una

cellula. Per accumularla da una parte metto una differenza di potenziale di membrana,

dunque l’interno è negativo e l’esterno è positivo. La specie carica positivamente

attraversa il proprio trasportatore e si ripartisce a seconda della differenza di carica

che ho applicato, cioè va verso la parte negativa, quindi all’interno.

L’equazione di Nerst infatti dice che all’equilibrio la differenza in concentrazione è

bilanciata da quella in carica ed è questo ciò che avviene.

Esempio 2: abbiamo una molecola neutra o carica negativamente ripartita equamente

e voglio accumularla all’interno che però è negativo. Per farlo si utilizza un protone

preso dall’esterno e si porta all’interno insieme a una molecola carica negativamente o

neutra. Senza la differenza di potenziale la membrana non potrebbe svolgere questo

lavoro.

TRASPORTO ATTIVO: è un tipo di trasporto che avviene sempre contro gradiente. Si

suddivide in TRASPORTO ATTIVO PRIMARIO e in TRASPORTO ATTIVO

SECONDARIO.

Il primario è quello della pompa protonica, visto precedentemente, questa spende ATP

per portare fuori gli ioni.

Il secondario lavora con la spesa indiretta di ATP, cioè sfrutta la differenza di

potenziale data dal trasporto primario.

TRASPORTO PASSIVO: avviene secondo gradiente di concentrazione e segue la

legge di Fick sulla diffusione. Esistono due tipi di trasporto passivo: DIFFUSIONE

TRANSMEMBRANA e DIFFUSIONE FACILITATA. La prima è quella che si ha per

molecole che permeano la membrana, la seconda invece per molecole che non la

permeano e sfruttano proteine trasportatrici (carriers).

TIPI DI TRASPORTATORI TRANSMEMBRANA:

1)CANALI –> Permettono il movimento degli ioni secondo il gradiente elettrochimico.

Se in una cellula vegetale l’interno è negativo e l’esterno è positivo gli anioni escono

attraverso il canale e i cationi entrano.

L’apertura e la chiusura dei canali è regolata da molteplici sistemi:

VOLTAGGIO: i canali possono avere al loro interno una sequenza amminoacidica

 carica che sente le iperpolarizzazioni e le depolarizzazioni di membrana e di

conseguenza si muove aprendo o chiudendo il canale;

LIGANDO: è una molecola che si lega al canale aprendolo o chiudendolo;

 STRESS: ad esempio la pressione meccanica;



I canali sono proteine transmembrana con una parte centrale che è un poro selettivo

per lo ione da trasportare, ovvero avrà la dimensione dello ione e carica opposta a

questo. Esistono anche canali specifici per l’acqua.

2) CARRIERS --> possono lavorare senza spesa di energia e in questo caso mediano la

diffusione facilitata oppure con spesa di energia per il trasporto attivo secondario. Nel

secondo caso abbiamo due tipi di trasportatori:

ANTIPORTI: una molecola passa in una direzione e l’altra nella direzione

 opposta;

SIMPORTI: entrambe le molecole passano nella stessa direzione;



La combinazione tra antiporti e simporti permette qualunque scambio di una molecola

tra interno e esterno contro gradiente di concentrazione della molecola da

trasportare.

FUNZIONE DEL PROTONE:

ESEMPIO. La molecola è molto concentrata all’interno e poco fuori, se voglio

continuare a caricarla all’interno della cellula avrò bisogno di un simporto.

Il trasportatore è aperto verso l’esterno e espone due siti di legame: uno per la

molecola da trasportare e uno per il protone. L’affinità per la molecola è molto alta, il

sito di legame per il protone invece ha un’affinità molto bassa compensata però

dall’alta concentrazione extracellulare di protoni. Il trasportatore una volta legato al

protone e alla molecola da trasportare cambia conformazione e si apre verso il citosol.

In questa conformazione si abbassa l’affinità del sito di legame per la molecola che

così viene rilasciata.

L’affinità del sito di legame per il protone invece rimane bassa e poiché all’interno

della cellula la concentrazione di protoni è bassa questo viene rilasciato.

In questo caso non si ha una spesa diretta di ATP ma di protoni, per questo si tratta di

trasporto attivo secondario. Simporto e antiporto si possono anche usare per

trasportare contro gradiente elettrico un catione o un anione. Tutto ciò è possibile

grazie alla differenza di potenziale.

Anche nei vacuoli i carrier rendono possibile il trasporto di cationi e anioni contro

gradiente elettrico.

Se un catione deve essere portato all’interno di un vacuolo avremo un antiporto.

Se un anione deve essere portato fuori dal vacuolo avremo un simporto.

Come è possibile riconoscere un trasporto mediato da carrier rispetto a una diffusione

semplice?

Si riconosce bene quando un soluto sfrutta un trasporto mediato da carriers perché

questo trasporto ha un andamento analogo al fenomeno della cinetica enzimatica.

Questi trasportatori seguono una cinetica simile a quella di Michaelis-Menten: se la

concentrazione della molecola aumenta ne viene trasportata di più fino a raggiungere

un livello massimo. Anche i parametri sono gli stessi: Vmax e Km.

La diffusione semplice invece ha una cinetica lineare: più la concentrazione di soluto

aumenta più questo diffonde.

Osservazione:

Variazioni nel trasporto di membrana potrebbero implicare una variazione del pH

citosolico, questo però deve rimanere costantemente tr