Laboratorio di microbiologia

Altre colorazioni per la microscopia ottica

Colorazione della capsula

La capsula batterica può essere messa in evidenza sia utilizzando colorazioni positive che colorando la capsula in modo specifico, sia utilizzando colorazioni negative che colorano il campo circostante lasciando incolore la capsula. La colorazione negativa viene preferita perché i coloranti specifici possono alterare i costituenti della capsula.

a) Colorazione negativa con inchiostro di china o nigrosina

Inchiostro di china o nigrosina diluiti

Fucsina

Si stempera la patina batterica in una goccia d'inchiostro di china, anziché di acqua, si lascia asciugare e quindi si fissa al calore. Si colora la cellula con il colorante di contrasto. Al microscopio ottico la capsula appare come una zona non colorata fra il corpo batterico rosso e lo sfondo nero. Il materiale capsulare prende difficilmente il colore.

b) In alternativa: ad una goccia di inchiostro di china si aggiunge una goccia di sospensione cellulare. Si copre con

un vetrino coprioggetti, si schiaccia leggermente e si osserva al M.O. La capsula apparirà come un alone chiaro intorno alla cellula su un fondo scuro. Colorazione della guaina mucillaginosa La colorazione della guaina mucillaginosa può essere fatta analogamente che per la capsula con una colorazione negativa utilizzando il Rosso Congo. Il Rosso Congo può essere utilizzato per una colorazione complessa: - Soluzione 10mM di cetil-piridin cloruro - Fissativo di Bouin - Miscela 2:1 di soluzione satura di Rosso Congo e Tween 80 al 10% - Fucsina carbolica al 10% I vetrini su cui è stata precedentemente distribuita una sospensione di cellule sono ricoperti con la soluzione di cetil-piridin cloruro ed asciugati all'aria per 20-30', quindi fissati con fissativo di Bouin per 4'. Sciacquati e colorati per 20' con una miscela 2:1 di soluzione satura di Rosso Congo e Tween 80 al 10%. Di seguito per 30'' con fucsina carbolica al 10%, sciacquati ed asciugati.37°C. Il sale d'ammonio quaternario precipita i polisaccaridi che vengono colorati dal rosso Congo, la cuicolorazione è intensificata dal Tween, le cellule sono colorate in rosso dalla fucsina. Colorazione dei flagelli I flagelli dato il loro diametro (10-30nm) non sono visibili al M.O. Le tecniche di colorazione consistono nel depositare sostanze colorate su queste strutture, aumentandone il diametro. La colorazione più usata è quella di Leifson o sue modificazioni (Leifson, modif. da Fisher e Conn) Soluzione A: 18 ml di acido tannico al 10% in acqua + 6 ml di FeCl3·6H2O al 6% in acqua Soluzione B: 3,5 ml di sol.A + 0,5 ml di fucsina basica allo 0,5% in alcool + 0,5 ml di HCl concentrato + 2 ml di formaldeide Fucsina carbolica di Ziehl. Procedimento: - Saggiare la mobilità della coltura batterica mediante osservazione al M.O. con esame a fresco o a goccia pendente. - Se il microrganismo è mobile lavare la superficie dell'agar della

coltura in tubo a becco di clarino con 1 ml di acqua distillata sterile, agitando dolcemente e trasferire quest'acqua di lavaggio nella provettina contenente 2 ml di acqua distillata sterile.

Incubare la provetta così preparata in termostato a 37°C per 10', se il batterio non produce esopolisaccaridi; per 30' se li produce.

Saggiare di nuovo la mobilità al M.O. mediante osservazione a fresco.

Prelevare con una pipetta Pasteur una goccia della sommità della sospensione (dove la quantità di batteri mobili è maggiore) e deporla ad un'estremità di un vetrino (i vetrini vengono lasciati per una notte in miscela cromica, poi lavati con acqua corrente e successivamente con acqua distillata; al momento dell'uso immergere i vetrini in alcool etilico al 95° e passati velocemente alla fiamma per fare evaporare l'alcool).

Inclinare il vetrino in modo che la soluzione scivoli verso l'estremità opposta del vetrino.

Elasciarlo ad asciugare all'aria in posizione inclinata.

Versare la sol. A sul vetrino mediante un filtro e lasciarla agire per 5'.

Togliere la sol. A e senza sciacquare aggiungere la sol.B lasciandola agire per 10'.

Lavare con acqua distillata, versare sul vetrino la fucsina carbolica di Ziehl lasciandola agire per 1'su di una piastra calda ad 80°C fino a sviluppo di vapori.

Lavare con acqua corrente e lasciare asciugare all'aria.

I batteri ed i flagelli sono colorati in rosso fucsia.

Colorazione delle spore (Shaffer-Fulton)

Soluzione acquosa di Verde malachite al 5%

Soluzione acquosa di safranina allo 0,5%

Il preparato opportunamente allestito viene colorato con verde di malachite e riscaldato sino allacomparsa di primi vapori per 30-60".

Si lava con acqua distillata e si effettua la colorazione di contrasto con safranina per 2'.

Le spore risultano colorate in verde, mentre il corpo batterico in rosso.

C M (E )FOLORAZIONE PER OSSERVAZIONI IN

MICROSCOPIA A PIÙ FLUORESCENZA

Acridina Orange - L'arancio di acridina conferisce al DNA fluorescenza verde, e all'RNA fluorescenza arancio, per cui al microscopio ad epifluorescenza i batteri, le cui dimensioni sono piccole e il cui DNA è libero nel citoplasma, si colorano con Acridina Orange assumendo fluorescenza uniforme verde; i microrganismi eucarioti (funghi ialini, lieviti) presentano colorazione differenziale con nucleo verde e citoplasma arancio; i microrganismi pigmentati (ad es. funghi demaziacei, Black yeast) non assumono il colorante ed appaiono di colore scuro; i detriti cellulari appaiono dotati di fluorescenza arancio, le alghe e i cianobatteri sono dotati di autofluorescenza rossa o verde (a seconda dei tipi di pigmenti presenti) quando sono vitali e giallo arancio quando sono senescenti. I cristalli di materiale inorganico, non possedendo acidi nucleici, non assumono il colorante.

Colorazione con Acridina Orange

Ad una goccia di sospensione batterica posta su un

1. vetrino portaoggetti
2. Acridina Orange (0,2mg/ml) sterile
3. vetrino coprioggetto
4. microscopio a fluorescenza a 50x o a 100x ad immersione (rispettivamente ad acqua e ad olio)
5. Filtro di eccitazione 450-490 nm che conferisce una colorazione verde al DNA
6. Colorazione con DAPI
7. DAPI (0.1 mg/ml) sterile
8. terreni di coltura per batteri marini eterotrofi

Argomento: Preparazione di terreni di coltura per batteri marini eterotrofi.

Scopo: Preparare un terreno di coltura per l'isolamento di batteri marini eterotrofi eseguendo correttamente i vari punti del procedimento.

Note teoriche: I terreni sono dei substrati di crescita che vengono utilizzati per la crescita di batteri marini eterotrofi.

microrganismi: disolito contengono una serie di fattori di crescita specifici per i differenti gruppi di microrganismi (nutrienti, spazio, temperatura e pH). I terreni di coltura possono essere liquidi o solidi (basta l'aggiunta di agar al terreno liquido). Possono poi essere naturali (composizione non definita), sintetici (composizione definita), semisintetici generici (terreno naturale con aggiunta di sostanze chimiche) o semisintetici specifici (terreni che corrispondono alle esigenze degli organismi).

Materiale

• Carta da laboratorio
• Carta stagnola
• Barchette
• Bilancia
• Ingredienti per la preparazione dei terreni: Marine Agar e Marine Broth
• Spatola
• Beuta da 1 L con collo largo
• Bacchetta
• Cilindro graduato
• Forno a microonde
• pH-metro
• Spruzzetta
• Provette
• Pipetta da 10 ml
• Pipetor
• Nottolino

Procedimento

1. Calcolare la quantità in percentuale di composti per la preparazione di 550 ml di terreno liquido Marine Broth secondo Zobell.
2. Pesare gli ingredienti.
3. Versare 550 ml d'acqua di mare in un

cilindro graduato

Porre ad uno ad uno i componenti precedentemente pesati all'interno di una beuta a collo largo aggiungendo contemporaneamente parte dell'acqua del cilindro. Prima di aggiungere l'ingrediente successivo avere cura di dissolvere completamente il composto.

Agitare il preparato in modo tale che non si formino grumi nel terreno e riscaldare leggermente su piastra riscaldata.

Aggiungere il resto dell'acqua di mare.

Aggiustare il pH a 7,6 utilizzando HCl o NaOH.

Ripartire il terreno come segue:

• 300 ml in una bottiglia con tappo a vite a cui si aggiunge l'agar per la preparazione del Marine Agar,
• il restante terreno liquido si distribuisce in ragione di 10 ml ciascuno in provettoni 18x180 e si chiude con tappo di metallo.

Sterilizzare sia la bottiglia con il Marine Agar che le provette contenenti il Marine Broth in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Versate il terreno agarizzato dopo sterilizzazione quando raggiunge la T

di circa 55-60°C in piastre Petri sterili (circa 20 ml ciascuna)  Fare solidificare il terreno e capovolgerle  Conservarle in frigorifero fino al momento dell'uso. Composizione del Terreno di Zobell Aged sea water 1000 ml Peptone 5g/L Estratto di lievito 0,1g/L Per il Marine agar Agar 15g/L pH 7,5-7,6 Per le diluizioni: Distribuire 9 ml di H2O di mare in 6 provettoni e sterilizzare insieme ai terreni. ESPERIENZA SUI METODI DI ALLESTIMENTO E COLORAZIONE DEL VETRINO Lo studio di una colonia di batteri è effettuato attraverso un esame a fresco per osservarne la motilità oppure previa colorazione per osservarne la morfologia. Nell'esame a fresco è necessario un becco di Bunsen, un vetrino copri oggetti, un'ansa terminante con un loop all'estremità, acqua, pinzetta per prendere il vetrino senza toccarlo con le mani, la capsula Petri contenente la colonia batterica e un vetrino portaoggetti a goccia pendente, vale a dire un vetrino dotato di una

cavità il cui bordo è circondato da vasellina o da quattro gocce di acqua per far aderire il vetrino copri oggetti a quello portaoggetti. Nel caso in cui voglio osservare la motilità, la vitalità e l’aggregazione della colonia ricorro all’impiego di tale esame in quanto non prevede alcuno schiacciamento della sospensione batterica. Dopo aver acceso il becco di Bunsen in modo da ottenere una fiamma ben ossigenata, prendo il vetrino con la pinzetta e lo faccio passare sulla fiamma per accertarmi che sia pulito. Prendo l’ansa, la sterilizzo mettendola sulla fiamma finchè non diventa rossa, la immergo in acqua e pongo quattro gocce, una per ogni lato, sul vetrino portaoggetti. Inserisco nuovamente l’ansa nel contenitore dell’acqua, metto la goccia intrappolata nel loop sul vetrino co