Appunti completi esame di Laboratorio di metodologie molecolari e cellulari

Screening degli errori della Taq polimerasi

L'introduzione di errori da parte della Taq polimerasi rappresenta un problema per il clonaggio del prodotto di PCR. Un errore nella molecola che si inserisce nel vettore viene infatti replicato e trasmesso a tutto il clone. Bisogna fare uno screening delle colonie per identificare i cloni senza errori. Con l'utilizzo di polimerasi ad alta fedeltà è possibile ridurre il problema.

Screening delle colonie mediante PCR

Si fa una PCR con primer universali disegnati sulla sequenza del vettore ai lati del sito di clonaggio. Posso fare la PCR su un plasmide, il prodotto di amplificazione prevede le sequenze che fiancheggiano quelle di clonaggio multiplo + il frammento che si vuole amplificare. Si conosce la distanza fra le sequenze primer e il frammento, si riesce a capire se il frammento amplificato è della lunghezza corretta. Posso fare PCR su colonia, prelevo un po' di colonia e la unisco alla miscela di PCR.da tutte le piastre (8 pool). Si fa la PCR con primer specifici su ciascun pool secondario→ identificazione dei cloni positivi.tutte le piastre (8 pool) → PCR e identificazione dei pool positivi → identificazione del clone che contiene la sequenza d'interesse (eventuale screening terziario). MUTAGENESI SITO SPECIFICA CON PCR Muto uno o pochi nucleotidi per studiare dei mutageni per capire come funzionano alcuni meccanismi di biologia molecolare. Si fanno 2 PCR (A e B) della sequenza che si vuole mutare, usando dei forward e dei reverse che si appaiano allo stampo e poi primer che sono uno complementare all'altro ma con un mismatch nel mezzo, sono primer più lunghi di 20-25 nucleotidi come i classici e la mutazione è messa al centro di modo che sia stabilizzata dalle basi prima e dopo. Si fanno le 2 amplificazioni, quando si generano i frammenti con il primer di mutagenesi incorporato (dal 2 ciclo), la PCR fa in modo che questo errore sia incorporato anche nei frammenti successivi. Si trovano due frammenti, quello di PCR A e B, che hanno nella stessa posizione la mutazione che si

Si prende una piccola aliquota di queste PCR con le mutazioni, si fanno denaturare e si fanno poi rinaturare, la maggior parte dei frammenti si riappairà su se stesso, tornerà al prodotto di partenza, ma una piccola parte andrà a formare i due frammenti che si sovrappongono a livello del primer (il frammento della PCR A si sovrappone al reverse del filamento della PCR B, e viceversa), fanno da autoinnesco, permettendo l'estensione alla polimerasi, così da allungare i frammenti che mancano da una parte all'altra. A questo punto faccio una PCR utilizzando il forward del frammento A e il reverse del frammento B, così da amplificare tutto il frammento con la nuova mutazione inserita.

REVERSE-TRANSCRIPTION (RT) PCR (RT-PCR)

È la combinazione di retrotrascrizione (RT) e PCR → PCR eseguita su cDNA. Ha tante applicazioni: analisi qualitativa e quantitativa dell'espressione genica, clonaggio di cDNA, studio dello

splicing. Nella PCR one step uso primer sequenza specifici e aggiungo tutti componenti. Si usano 2 coppie di primer: primer 1 complementare all'mRNA che si va a legare ad esso, formando il primo filamento di cDNA; da qui in avanti si fa la PCR con il primer 2, complementare al filamento di cDNA appena generato, che si lega, va a copiare il filamento che era uguale all'RNA di origine ma di DNA, da qui prosegue l'amplificazione. Può essere fatta solo e soltanto con una retrotrascrizione specifica per un gene, perché si usa per retrotrascrivere uno dei due primer che userà per la PCR.

In quella a due step prima faccio la retrotrascrizione e ottengo cDNA e poi faccio la PCR. Faccio una retrotrascrizione con dei random primer o oligo di T (primer anche non specifici), per poi fare PCR specifiche per geni diversi. È possibile una contaminazione da DNA della preparazione di mRNA. Bisogna evitare l'amplificazione di DNA genomico che potrebbe falsare

i risultati dell'analisi in RT-PCR. Si fa un trattamento dell'RNA con DNAsi (DNAsi RNAsi-free), ma non si ottiene mai una rimozione totale del DNA genomico contaminante e la PCR è una tecnica estremamente sensibile. Quando è possibile la strategia più sicura è quella di progettare opportunamente i primer per l'amplificazione:

1. Primer che si appaiano a sequenze contenute in esoni diversi: il cDNA non contiene introni, mentre il DNA genomico sì
2. Primer che si appaiano a cavallo di una giunzione di splicing fra due esoni: i primer si appaiano solo sul cDNA, perché nel DNA genomico c'è l'introne

PCR QUANTITATIVA (QPCR) O PCR REAL-TIME

La PCR Real-Time è una metodica che permette di seguire l'andamento della reazione di amplificazione e l'accumulo dei prodotti di PCR nonché di quantificare il DNA stampo iniziale. È possibile grazie all'utilizzo di coloranti fluorescenti che

utilizzando la formula della retta per ottenere la concentrazione dei campioni incogniti. Le sonde marcate con fluorofori complementari a sequenze specifiche emettono fluorescenza unicamente quando sono legate a DNA a doppia elica. Per misurare la fluorescenza, sono necessari termociclatori in grado di rilevare la variazione di intensità luminosa nel corso della reazione.

Il ciclo soglia (Ct) rappresenta il ciclo in cui la fluorescenza comincia ad aumentare rapidamente, superando la linea di base e diventando misurabile dallo strumento. Il valore di Ct è inversamente correlato alla quantità iniziale di DNA presente nel campione. Più concentrato è il DNA, più basso sarà il valore di Ct.

Per effettuare una quantificazione assoluta, è possibile allestire una curva standard di calibrazione utilizzando diluizioni seriali dello stesso campione a concentrazioni note. Questa curva viene poi utilizzata per determinare le quantità dei campioni incogniti che si stanno analizzando. Sull'asse delle ascisse viene rappresentato il logaritmo della concentrazione, mentre sull'asse delle ordinate viene rappresentato il valore di Ct. La curva ottenuta è una retta con pendenza negativa. Utilizzando la formula della retta, è possibile interpolare il valore di Ct per ottenere la concentrazione dei campioni incogniti.

del DNA a concentrazione incognita su questa curva per ricavare la concentrazione del campione. Posso fare una quantificazione relativa, in questo caso non si utilizza una curva di calibrazione ma la differenza di ciclo soglia (ΔCt) del target (gene) analizzato rispetto ad un frammento (gene) di riferimento. Determina il rapporto fra la quantità del frammento/gene target e la quantità del frammento/gene di riferimento (fold change). Il ΔCt rapporto o fold change viene calcolato con la formula: R = 2^(ΔCt). Si assume che l'efficienza di amplificazione dei due frammenti/geni sia simile e sia prossima a 1 (semplificazione di (1+E)). Mi dice di quanto è più o meno rappresentato il mio gene rispetto a quello di riferimento. Questa formula implica che l'efficienza di entrambi i geni sia 1, quindi è una semplificazione in cui non si prevedono i fattori limitanti, si può fare perché la rilevazione.del ciclo soglia è abbastanza vicina all'inizio, quando i fattori influiscono poco. Sistemi di rilevamento La fluorescenza si rileva con intercalanti a fluorescenza come il SYBR green o sostanze che emettono fluorescenza solo quando sono legate al doppio filamento, quindi a mano a mano che si accumula prodotto di PCR, sempre più colorante si intercala e sempre più fluorescenza è rilevata. SYBR Green è molecola fluorescente che si lega in maniera non specifica al solco minore del DNA ed emette fluorescenza solo se legato al DNA. Questa è una metodica di rilevamento aspecifica, il SYBR Green si lega a qualsiasi frammento di DNA amplificato (e anche a eventuali dimeri di primer). È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici. Per farlo faccio una curva di dissociazione (o curva di melting) a fine amplificazione (misura della fluorescenza aumentando progressivamente la temperatura da 55°C a95°C) poiché la curva di dissociazione di un frammento di DNA dipende dalla sua lunghezza e dalla sua sequenza, con questa analisi è possibile stabilire il numero di prodotti di amplificazione e quindi la specificità della reazione. Denaturo il DNA in modo che la fluorescenza mano a mano sparisca. Si ha un grafico fluorescenza-temperatura con pendenza negativa. Se si ha più di un frammento all'interno della PCR faccio la derivata negativa in funzione della temperatura e si hanno dei picchi diversi. Le sonde sono oligonucleotidi specifici per una data sequenza, quindi non ho il problema che ho con il sybr green: - Sonde TaqMan: sono oligonucleotidi lunghi 20 basi che hanno un fluoroforo legato covalentemente a un'estremità e un quencher dall'altra (un gruppo che blocca l'emissione di fluorescenza). Quando il fluoroforo e il quencher sono vicini, l'emissione del fluoroforo è bloccata dal quencher; ma quando si fa la PCRdurante l'amplificazione l'attività esonucleasica 5'-3' della polimerasi idrolizza la sonda (sonde a idrolisi) allontanando il fluoroforo dal quencher, causando l'emissione della fluorescenza. Con il progredire dei cicli di PCR, si avrà un accumulo del prodotto e quindi un aumento nell'emissione della fluorescenza. Le sonde Molecular Beacon sono sonde fatte a forcina, con una regione che si appaia al DNA stampo e una regione che si appaia a sé stessa. Queste sonde presentano da un lato il fluoroforo e dall'altro il quencher. Quando il fluoroforo e il quencher sono vicini, l'emissione è spenta. Durante la fase di appaiamento della PCR, la sonda è disegnata in modo che la regione si appaia allo stampo, distanziando il fluoroforo dal quencher e permettendo la fluorescenza. La fluorescenza è emessa durante la fase di appaiamento e man mano che si producono sempre più sonde, sempre più fluorescenza viene emessa. La sonda non viene idrolizzata.

non si consuma ad ogni ciclo come per le taqman. L'appaiamento al DNA a stampo è in equilibrio con la formazione della sonda a forcina, questo rende l'appaiamento più specifico, perché deve competere con la forma a forcina.

32ESPRESSIONE DEI GENI CLONATI