Laboratorio di metodologie cellulari

LABORATORIO DI METODOLOGIE CELLULARI

Colture in vitro di cellule somatiche

Le cellule umane vengono trattate allo stesso modo di quelle di mammifero.

Perché le colture in vitro di cellule somatiche?

● alghe unicellulari) l’individuo coincide con

negli organismi unicellulari (batteri, lieviti e

la cellula

● gli studi in vitro possono essere facilmente effettuati riproducendo in laboratorio

l’ambiente nel quale i microorganismi di trovano in natura

● gli studi in vitro consentono di lavorare in condizioni controllate e riproducibili

● le colture in vitro di cellule somatiche permettono di trattare le singole cellule di un

metazoo come individui

Problemi della sperimentazione su animali

● Gli animali sono complessi

○ sono costituiti da molti tessuti diversi

○ ogni cellula produce molte specifiche proteine

○ le cellule interagiscono tra loro

● È difficile analizzare singoli eventi in vivo

○ gli esperimenti su animali richiedono il sacrificio o comunque provocano

sofferenza all’animale

Vantaggi principali

● non si sacrificano animali

● si possono controllare i fattori esterni

● si può facilmente controllare il comportamento delle cellule

● le cellule si maneggiano e propagano facilmente

● le cellule in coltura sono popolazioni omogenee

○ i risultati sperimentali sono riproducibili

● Le colture cellulari sono economiche in termini di denaro, tempo e spazio

Svantaggi

● difficoltà nel disgregare tessuti solidi

● difficoltà di riprodurre in vitro le condizioni di nicchia tissutale

● necessità di attrezzature sofisticate (asepsi, quando arriva un campione questo viene

considerato contaminato, deve quindi essere sterilizzato tramite diversi processi per

essere lavorato)

● limiti alla quantità di cellule coltivabili con sistemi non industriali

● instabilità genetica durante la progressione in vitro

● pressioni selettive variabili e incontrollabili

● perdita del differenziamento

Applicazioni delle strutture in vitro

1. Studio della morfologia e fisiologia di tessuti e organi

2. Studio dello sviluppo e del differenziamento 1

3. Studio della trasformazione tumorale

4. Studio dei meccanismi di malattie

5. Genetica di cellule somatiche, genetica molecolare

6. Citogenetica, patologia cromosomica, citogenetica oncologica

7. Ingegneria riproduttiva

8. Manipolazione genetica

9. Terapia genica

10. Cellule staminali rigenerazione di tessuti e organi

11. Clonazione terapeutica

12. Biochimica cellulare

13. Virologia (crescita, isolamento, titolazione di virus animali)

14. Farmacologia

15. Immunologia, produzione di anticorpi poli e mono-clonali

Colture in vitro di cellule animali: cenni storici

Nella prima metà del ‘900 si sviluppano tecniche che consentono di manipolare in vitro

cellule di eucarioti multicellulari in analogia con quanto già si può fare con le cellule

batteriche.

● Harrison 1907

● Lewis 1911 colture di cellule di rana

● Carrel 1912

● →

Youngner 1953 tecniche di associazione per cellule di mammifero

● Earle 1948

● Eagle 1955 terreni di coltura, fattori di crescita per cellule di

● White 1963 mammifero

Il laboratorio di colture cellulari

Attrezzatura di base (strumenti):

● cappe a flusso laminare (a contenimento biologico)

● incubatore a CO 2

● microscopio rovesciato

● pipettatore elettrico

● pompa aspirante

● centrifuga da tavolo

● bagno termostatico

● frigorifero o freezer (vengono congelate con l’azoto a circa -180°C, il

dimetilsulfossido, viene usato perché è una soluzione acquosa. Quando l’acqua si

congela rompe le cellule mentre la presenza di metilsulfossido permette di congelare

le cellule in sicurezza)

● attrezzature per il congelamento e lo stoccaggio delle cellule

Attrezzatura ulteriore

● attrezzature per la sterilizzazione (le cose in vetro possono essere sterilizzate a

secco, mentre tutto il resto va in autoclave)

● bilancia

● agitazione vortex

● sistema di distillazione dell’acqua 2

● pH metro

● agitatore magnetico

● micropipettatori

● conta cellulare

● video camera con monitor

Materiale monouso (a causa di questo materiale i costi sono molto alti)

● contenitori per le colture (piastre di Petri, fiasche)

● pipette in plastica da 1,2,5 o 10 ml (ogni volta che si fa una pipettata, la pipetta deve

essere buttata, per garantire sterilità)

● pipette Pasteur

● filtri per la sterilizzazione di soluzioni

● punte per micropipette

Cappe

● Se si lavora in camera sterile perfettamente isolata non è indispensabile usare una

coppa sterile

● Esistono cappe a flusso orizzontale e a flusso verticale

● Le cappe a flusso verticale sono a contenimento biologico

● Le cappe sono dotate di luce UV per la sterilizzazione dell’area di lavoro e sono

accese prima e dopo non durante la manipolazione delle cellule

● Le cappe devono essere sempre disinfettate con alcool e non deve essere lasciato

nulla sotto la cappa

Cappe a flusso orizzontale vs. cappe a flusso verticale

● orizzontale

○ viene mantenuta sterile l’area di lavoro

○ Il flusso d’aria investe l’operatore

○ Sono eccellenti per lavorare sterilmente il rischio di contaminazione è molto

ridotto

○ L’operatore è esposto a rischio biologico

○ L’uso di queste cappe richiede protezioni personali quali mascherine, camici

e guanti appositi

● verticale

○ Il flusso d’aria scorre verticalmente di fronte all’operatore

○ L’area di lavoro è isolata con un vetro che si trova di fronte all’operatore 3

○ Resta uno spazio di circa 20 cm tra il piano di lavoro e il margine inferiore del

vetro che permette di introdurre agevolmente le braccia

○ L’aria è riciclata e passa attraverso filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air

filter) prima di essere reimmessa nella stanza

Incubatore (termostato a CO )

2

Per la maggior parte delle cellule di mammifero:

● temperature = 37gradi

● Umidità 95%

● CO2 5%

● Tutte le cellule di mammifero richiedono incubatori a CO2

● Sono preferibili termostati con camicia d’acqua, ma si possono utilizzare vasche

d’acqua distillata aperte poste sul fondo di termostati a secco

● Cellule di specie diverse dai mammiferi possono richiedere condizioni di coltura

diverse

Perché la CO ?

2

I terreni sono generalmente tamponati con bicarbonati.

+ 3-

⇌

H O + CO H + HCO

2 2

3- + 3-

⇌

NaHCO Na + HCO 4

Lo scambio con la CO tra fase liquida e fase gassosa mantiene il pH del terreno costante.

2

pH

I terreni in base al pH cambiano colore. In base alla concentrazione di CO il terreno è più

2

acido o basico e si capisce dal colore del terreno.

● ph ottimale 7.4 range 7.0 -7.7

● Tutti i terreni contengono un indicatore di ph:

○ 7.4 rosso

○ 7.0 arancio

○ 6.5 giallo

○ 7.6 violetto

○ 7.8 viola

● Base di tutti i terreni è una soluzione salina bilanciata (BSS) addizionata con:

○ aminoacidi essenziali

○ vitamine

○ sali

○ glucosio

○ componenti organici (nucleosidi, piruvato, lipidi)

Temperatura

● temperatura ottimale per le cellule di mammifero: 36.5°C +/- 0.5

● le cellule resistono a lungo a basse temperature:

○ sopravvivono bene senza replicarsi a 4°C

○ sì congelano in azoto liquido a -196°C

● Non tollerano aumenti di temperatura superiori ai 2°C

Microscopio rovesciato

● è fondamentale guardare le cellule regolarmente

● un cambiamento morfologico spesso è il primo segno di sofferenza della coltura

● rovesciati perché non si possono aprire i contenitori, quindi obiettivi sotto e luce incid

dall’alto

● contrasto di fase, le cellule non vengono fissate ne colorate

● la maggior parte delle cellule non si vedono in luce diretta se non vengono colorate

Microscopio a contrasto di fase

● Il microscopio a contrasto di fase è un tipo particolare di microscopio che,

analogamente al microscopio a luce trasmessa, lavora nel campo del visibile.

● Si basa sul fenomeno dell'interferenza luminosa.

● Il preparato viene illuminato da un fascio luminoso in realtà suddiviso a livello del

condensatore in due porzioni di fase differente e con diverso angolo di incidenza.

● Il cambiamento ulteriore di fase dovuto alla porzione di luce che attraversa il

campione, andandosi a ricombinare con la luce non rifratta renderà visibili

componenti trasparenti ma di indice di rifrazione differente da quello del mezzo.

● In campo biologico, la maggior parte dei componenti cellulari è trasparente alla luce

visibile, anche a causa dell'elevata presenza di acqua.

● Le radiazioni luminose una volta oltrepassata una componente o un organello

cellulare, subiscono dei cambiamenti di fase che dipendono sia dallo spessore, sia

dal diverso indice di rifrazione della struttura oltrepassata. 5

● Mediante il microscopio a contrasto di fase è possibile andare a determinare tali

cambiamenti e convertirli in differenze di densità.

Scelta del contenitore

● La maggior parte delle cellule di mammifero cresce in monostrato su un substrato

solido artificiale

● La maggior parte delle cellule per proliferare ha bisogno di diffondere attaccandosi

ad un supporto

● Il sovraffollamento inibisce la crescita

● Ma le cellule richiedono una densità minima

● La resa cellulare è proporzionale allo spazio disponibile

Substrato

● il substrato migliore è il vetro

● le cellule per aderire al supporto hanno bisogno di una superficie carica

● la plastica usa e getta deve essere pretrattato: polistirene idrofilo trattato con raggi

gamma

● grande variabilità della qualità del materiale in plastica monouso

● per alcune colture i contenitori vengono saturati con sostanze che favoriscono la

crescita 6

Attrezzatura per crioconservazione

● Azoto liquido

● Fase liquida (-196°C) o fase di vapore (156°C)

● Il congelamento deve avvenire gradualmente

● Contenitori a tenuta con scomparti per lo stoccaggio delle cellule

● Carrelli per portare lentamente le cellule dai vapori d’azoto all’azoto liquido

Condizioni di sicurezza

● standard minimo da applicare in ogni laboratorio di colture cellulari

○ contenimento di categoria 2

○ la sicurezza si applica nei due sensi:

1. protezione delle cellule dalla contaminazione

protezione dell’operatore

2.

Problemi di sicurezza

● vetro rotto

● strumenti taglienti

● elettricità

● lesioni da azoto liquido

● ustioni (becchi Bunsen)

● radiazioni (se si utilizzano radioisotopi)

● tossici chimici volatili

● mutageni chimici

● contaminazione biologica (virus, batteri, ospiti delle cellule coltivate)

Regole generali

● Si deve assumere che tutte le colture cellulari sono pericolose in quanto possono

ospitare virus latenti o altri microorganismi non caratterizzati.

● Non bisogna MAI pipettare a bocca per minimizzare il rischio d’ingestione e

l’inalazione di aerosol contaminato.

● In laboratorio non si mangia, non si beve e non si fuma.

● Bisogna lavare le mani prima di iniziare a lavorare e dopo aver finito anche se si

usano i guanti.

● Disinfettare e decontaminare tutte le superfici prima e dopo.

● Utilizzare in modo appropriato i contenitori per rifiuti biologici e chimici solidi e liquidi.

● Tutto il materiale biologico prima di essere eliminato deve essere trattato con

ipoclorito di sodio. 7

Asepsi

● sterilità chirurgica e sterilità in vitro non coincidono

● in vitro la contaminazione è molto più probabile

○ i terreni sono ideali per la crescita di tutti i contaminanti

○ le cellule sono direttamente esposte, non esiste un sistema di difesa tipico

dell’organismo in toto

● Tutte le manipolazioni devono essere fatte in camera sterile o sotto cappa

● Le lampade UV devono essere spente 10’-20’ prima di incominciare a lavorare

● Il flusso laminare deve essere avviato 10’-20’ prima di incominciare a lavorare

● Tutte le superfici vanno pulite con alcool etilico al 70%

Tecniche di sterilizzazione

• –

Metalli S, A

• –

Vetro S, A, R

• Plastica - A, R, G

• Terreno - R, F

• Siero - R, F

• Soluzioni saline - A, R, F

● stufa a secco (250°C-300°C)

● autoclave (160°C-180°C)

● radiazioni

● filtrazioni

○ filtri con pori di 0.2 micron per eliminare batteri

○ filtri da 0.45 micron rimuovono solo aggregati

● gas

Filtrazione

● Filtri con pori di 0.2 µm per eliminare batteri (i batteri hanno dimensioni di 1-2 µm)

● Filtri di 0.45 µm rimuovono solo gli aggregati

● Micoplasmi (batteri endocellulari) e virus non vengono eliminati con la filtrazione

● Esistono filtri di molte dimensioni e sono tutti estremamente cari

● I migliori sono in cellulosa, policarbonato, PTFE (politetrafluoroetilene) perché non

trattengono proteine 8

Contaminazioni

● funghi, muffe e lieviti

● batteri

● micoplasma

● altre cellule

L’analisi al microscopio rivela la contaminazione da lieviti, funghi e batteri.

1.

2. Per la rilevazione del micoplasma esistono colorazioni specifiche che devono essere

fatte regolarmente.

Solo la conoscenza della morfologia cellulare e l’analisi di marcatori citogenetici e/o

3. molecolari possono rivelare la contaminazione da parte di altre cellule.

Terreni di coltura

● Base di tutti i terreni è una soluzione salina bilanciata (BSS) addizionata con:

○ aminoacidi essenziali

○ vitamine

○ sali

○ glucosio

○ componenti organici (nucleosidi, piruvato, lipidi)

● Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) è il terreno più utilizzato

Altre componenti del terreno

● Antibiotici (penicillina e streptomicina)

○ Prevengono la contaminazione batterica

● Sali e tamponi

○ Simulano l’ambiente in vivo

● Siero

○ Separato dal sangue dopo coagulazione della frazione cellulare e fibrosa

○ Bovino (neonatale o fetale), di cavallo, di pecora

○ Viene addizionato in percentuale variabile ed è indispensabile per la crescita

cellulare

● Lipidi, proteine

● Fattori di crescita specifici 9

Componenti del siero

● Proteine:

○ albumina, fibronectina, transferrina

● Fattori di crescita:

○ fgf, pdgf, egf, msa (moltiplication stimulating activity), insuline like grow factor

● Ormoni:

○ insulina, ormone della crescita, somatomedine, idrocortisone

● Metaboliti vari:

○ amminoacidi, chetoacidi

● Minerali:

○ ferro, zinco, rame, selenio • g globulin

Definizioni

1. Coltura primaria

a. coltura iniziata da cellule, tessuti, organi, presi direttamente da un organismo

b. si considera una coltura primaria fino al primo passaggio

2. Linea cellulare

a. è derivata da una coltura primaria

3. Ceppo cellulare

a. è derivato da una coltura primaria o linea cellulare per selezione o clonazione

4. Clone cellulare

a. popolazione di cellule derivate da una cellula singola per mitosi

5. Efficienza di piastramenti

a. % di cellule seminate in grado di formare colonie, misura del grado di

autonomia cellulare

6. Inibizione da contatto

a. blocco della proliferazione indotto dal contatto tra cellule

7. Densità di saturazione

a. numero massimo che si possono ottenere in una piastra/fiasca in condizioni

sperimentali note

8. Inoculo minimo

a. numero minimo di cellule che si possono seminare per ottenere crescita

cellulare in condizioni sperimentali note

Colture primarie

● espianto primario

● le cellule migrano a partire da un frammento di tessuto

● disgregazione del tessuto dipende dall’abbondanza del materiale di partenza

○ meccanica

○ enzimatica (tripsina, collagenasi ialuronidasi)

Regole generali

● Sterilità chirurgica e sterilità in vitro non coincidono

● Il materiale prelevato può essere conservato per 3-4 gg a 4°C in terreno o soluzione

fisiologica contenente antibiotici

● Va rimosso tutto il tessuto grasso o necrotico

● Il frammento va tagliato con un bisturi il più finemente possibile

● Nella coltura primaria la concentrazione di cellule deve essere sempre molto alta 10

● Si deve scegliere un terreno ricco con alta concentrazione di siero fetale

● Si impiantano meglio tessuti embrionali

Explant culture skin

Evoluzione di una coltura

La coltura primaria ha una fase di crescita lineare, la linea cresce per un numero definito di

volte, le cellule umane solitamente hanno 20 cicli ma arrivano fino a 50. Successivamente

alla crescita si va incontro ad una fase di crisi e poi di morte. A volte quando entra nella fase

di crisi, entra in una nuova fase chiamata linea cellulare continua, e ci si riferisce alle cellule

tumorali, ovvero cellule che perdono la capacità di morire e continuano a dividersi. La

telomerasi è coinvolta nel processo di senescenza cellulare. Quando la cellula va incontro a

morte cellulare si verifica l’accorciamento dei telomeri a causa dell’inattivazione della

telomerasi. Se noi ad una linea cellulare aggiungiamo telomerasi possiamo immortalizzare le

cellule. La maggior parte delle cellule tumorali hanno riattivato la telomerasi, diventando così

immortali. 11

Caratteristiche della linea primaria

● una coltura primaria subisce forti pressioni selettive che ne consentono l’adattamento

in vitro

● una coltura primaria è eterogenea

● una linea cellulare è omogenea e non necessariamente uguale alla coltura da cui

deriva

● Se non vengono usati accorgimenti particolari crescono cellule parzialmente

indifferenziate con morfologia fibroblastoide (FGF nel siero)

● Si osserva instabilità genomica ed accumulo di mutazioni

● Una linea primaria ha vita definita: va incontro a morte programmata (apoptosi)

● La durata di una coltura dipende dalle caratteristiche delle cellule e dalle condizioni in

vitro

● Fibroblasti umani da biopsia cutanea possono essere mantenuti per 50-70 passaggi

12

Trasformazione cellulare (processo tramite il quale le cellule diventano immortali)

● Processo attraverso il quale le cellule diventano “immortali”

● L’immortalità cellulare = potenzialità replicativa infinita

● Può avvenire spontaneamente (raramente in vitro, in vivo: trasformazione

neoplastica) o essere indotta da agenti fisici o chimici

Trasformazione

● Metodi

○ mutageni

○ Virus

○ oncògeni

○ oncogèni

○ spontanea in vitro

○ spontanea in vivo: tumorale

● Caratteristiche

○ vita infinita

○ elevata potenzialità replicativa

○ bassa dipendenza da fattori di crescita

○ perdita di inibizione da contatto

○ dall’ancoraggio)

capacità di crescere in sospensione (indipendenza

○ instabilità genomica

○ aneuploidia

○ capacità di indurre tumori nell’animale

Non tutte queste caratteristiche sono sempre presenti COMUNE DENOMINATORE DI

L’IMMORTALITA’ REPLICATIVA

TUTTE LE CELLULE TRASFORMATE È

Trasformazione cellulare: proprietà delle cellule trasformate

Caratteristiche di crescita:

● immortali (crescita indefinita)

● ancoraggio indipendenti

● perdita inibizione da contatto

● crescita su monostrati confluenti di “foci”

● inoculo minimo ridotto alta densità di saturazione • limitata richiesta di siero •

indipendenza da fattori di crescita • alta efficienza di piastramento • breve tempo di

raddoppiamento 13

La caratteristica che determina la trasformazione è l’immortalità.

Caratteristiche genetiche

● alta frequenza di mutazione spontanea

● aneuploidia

● eteroploidia

● instabilità genomica generalizzata

Proprietà neoplastiche

● tumorigene

● angiogeniche: capacità di richiamare vasi per ricevere nutrienti

● aumentata secrezione di proteasi: diventano invasive e entrano nel torrente

circolatorio, le proteasi rompono le membrane e si disperdono nel torrente

circolatorio permettendo così alle cellule tumorali di attecchire in qualsiasi altro

tessuto e metastatizzare

● invasive

Mantenimento della coltura

● Quando le cellule raggiungono la confluenza vengono

○ staccate dal supporto

○ contate

○ risospese ad una diluizione opportuna

○ piastrate in nuovi contenitori (cellule che crescono in sospensione vengono

semplicemente diluite contate e riseminate)

● Per staccare le cellule si usa un enzima proteolitico: la tripsina 14

● Questa operazione si chiama passaggio in vitro

● Tra un passaggio e il successivo vengono fatti cambi regolari di terreno

Conteggio delle cellule LO CHIEDE SEMPRE

Perché arriviamo a quei numeri????? (domanda della prof). Perché conosciamo il volume

all’interno del quale sono contenute le cellule. Noi calcoliamo il volume in mm cubi che deve

essere trasformato in cm cubi e poi in ml. Ora faccio il rapporto e imposto la proporzione. Se

conosco il volume noto e il numero di cellule FINIRE GUARDANDO SBOBINE

Conteggio con la camera di Burcker

Trattamento con tripsina

CONTEGGIO CON CAMERA DI BÜRKER:

NUMERO DI CELLULE PER ml

numero medio di cellule VIVE contate in ogni quadrato per fattore

moltiplicativo 4 5

quadrati grandi n x 10 quadrati piccoli n x 2,5 x 10

SEMINA DELLE CELLULE IN TERRENO COMPLETO ALLA

DILUIZIONE OPPORTUNA

● spessore dell’intercapedine tra coprioggetto e porta oggetto=0.1mm.

● nei quadrati grandi si contano le cellule interne al perimetro delimitato dalla seconda

delle tre linee, non quelle ad essa tangenti

● il lato del quadrato è 1mm.

● nei quadrati piccoli si contano le cellule tangenti il perimetro interno o nello spazio fra

le righe, non quelle tangenti al perimetro esterno.

● il lato del quadrato è 0.2mm 15

Conteggio cellule

● Le cellule vengono tripsinizzate, risospese perfettamente, opportunamente diluite,

colorate con tripanblu

○ il tripan blu penetra nelle cellule morte ch