Medicina di laboratorio

ELISA SUPER-TECNOLOGICA

Per sopperire ai limiti di detection (ovvero all'impossibilità di rilevare antigene/anticorpo al di sotto di nanogrammi/mL) dei test ELISA tradizionali, è stato sviluppato il saggio ELISA super-tecnologico. Lo scopo di evidenziare quantità al di sotto di soglie così basse è quello di evidenziare biomarcatori prima che diventino diagnostici, ovvero di prevenire la comparsa del fenotipo clinico ed intervenire prima dello sviluppo della malattia. Altro obiettivo della tecnica è inoltre quello di poter ricercare gli stessi analiti attraverso tecniche meno invasive sfruttando matrici biologiche differenti.

Tramite test ELISA super-tecnologico, grazie alla chemiluminescenza, è possibile ottenere un limite di detection pari a femtogrammi/mL. Si utilizza al posto di un fluorocromo, un sistema chemiluminescente dalle maggiori capacità di visualizzazione dell'immunocomplesso.

Una tipologia di ELISA

super-tecnologico è rappresentato dall'ELISA digitale liquido, che può essere svolto su qualsiasi tipo di matrice biologica e permette di analizzare più parametri contemporaneamente (a differenza dell'ELISA tradizionale dove viene analizzato un analita alla volta).

Esistono due diverse tipologie di ELISA digitale liquido:

1. SIMOA
2. LUMINEX/BIOPLEX

SIMOA: Per lo svolgimento di questo test vengono utilizzate biglie magnetiche circondate dall'anticorpo specifico per l'analita di interesse (aumento delle possibilità di legame antigene-anticorpo), queste vengono messe a contatto con 20 microlitri di plasma e si avrà la visualizzazione dell'immunocomplesso. Il legame viene poi amplificato tramite marcatura terziaria con biotina-streptavidina che restituisce la fluorescenza finale (con pozzetti colorati e pozzetti non colorati).

Questa tecnologia consente di visualizzare, a differenza dell'ELISA tradizionale, le singole reazioni

cheavvengono in quanto ogni biglia occupa un singolo pozzetto; inoltre permette di utilizzare una quantità ridotta di campione biologico e fornisce un risultato più specifico e sensibile. Infine permette di valutare al massimo sei parametri contemporaneamente. Il sistema SIMOA ha sensibilità elevatissima, definita attomolare (microgrammo/microlitro), alta specificità e altissima riproducibilità (per eseguire questo test sono necessarie circa 3 ore). LUMINEX/BIOPLEX Per lo svolgimento di questo test vengono utilizzate biglie paramagnetiche dotate di cento gradazioni cromatiche differenti, pertanto consente la visualizzazione in contemporanea fino a 100 parametri distinti in quanto le biglie sono singolarmente analizzabili ciascuna con un anticorpo specifico. Nella realtà a causa della sovrapposizione dei diversi spettri, è meno sensibile del SIMOA che gli viene preferito nelle analisi laboratoriali. Il sistema LUMINEX ha riproducibilità

variabile (per eseguire questo test sono necessarie circa 3 ore).

Il sistema LUMINEX, grazie alla sua capacità di analizzare moltissima analiti contemporaneamente, è stato utilizzato in periodo Covid per studiare il cytokine storm, ovvero la tempesta citochinica tipica del paziente affetto da Covid.

NB: va ricordato che il corretto utilizzo di questi due sistemi ELISA prevede la seguente logica: prima si fa studio con LUMINEX, in quanto permette di analizzare più marcatori e di identificare eventuali alterazioni che, se presenti, vengono successivamente indagate tramite il sistema più sensibile del SIMOA.

SIMOA: UTILIZZO NEI TRIAL CLINICI

Grazie alla grande sensibilità del test SIMOA, esso viene utilizzato anche nei trial clinici (fasi di sperimentazione farmacologica). In particolare questo test è in grado di visualizzare, molto prima di qualsiasi altra strumentazione, i cosiddetti neurofilamenti light, prodotti degradativi delle cellule neuronali.

Permettendo così la diagnosi precoce e la differenziazione di diverse malattie neurodegenerative. Un altro beneficio, sempre in questo ambito, è che il test SIMOA, sempre grazie alla sua sensibilità, può essere effettuato su campioni da prelievo sanguigno, senza necessariamente effettuare sul paziente l'invasivo prelievo di liquor.

LUMINEX: UTILIZZO IN AMBITO ONCOLOGICO

La tecnologia LUMINEX viene anche sfruttata in ambito di ricerca oncologica; in particolare, si fa inizialmente uno studio dei profili di espressione genica, attraverso i quali è possibile identificare geni che vengono espressi in modo differente nel tumore rispetto al controllo, e successivamente si procede allo studio di questi per identificare un possibile biomarcatore tumorale attraverso LIMINEX.

L'elettroforesi è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido, il cui movimento avviene per

effetto di un campo magnetico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. L'elettroforesi su gel di agarosio consente di far muovere l'acido nucleico, carico negativamente, verso il polo positivo dell'elettrodo: le particelle di acido nucleico più grosse si fermeranno prima mentre quelle più piccole migreranno più facilmente verso il polo positivo. L'elettroforesi su gel di poliacrilammide, caratterizzato da pori di dimensioni minori rispetto al gel di agarosio, consente di far muovere le proteine, anch'esse più piccole rispetto al DNA e di suddividerle secondo gli stessi principi in base al loro peso molecolare. Si tratta di un procedimento più complesso in quanto per conoscere la carica elettrica di ciascuna proteina bisognerebbe: conoscere l'esatta posizione degli aminoacidi carichi che la compongono e la sua conformazione tridimensionale; conoscere le modifiche post-traduzionali che subisce la.

proteina.

SDS-PAGE: POLIACRILAMMIDE GEL ELETTROFORESI

Date le problematiche elencate precedentemente sulla separazione elettroforetica delle proteine, viene utilizzata una tecnica nota come SDS-PAGE che prevede denaturazione delle proteine mettendole a contatto con un detergente detto SDS (sodio laurilsolfato) -> la proteina perderà la conformazione naturale e risulterà lineare e circondata dal detergente, il quale è inoltre in grado di donare cariche negative alle proteine essendo esso stesso carico negativamente.

Una volta lineare, la proteina sarà in grado di effettuare la corsa elettroforetica esclusivamente in base alle sue dimensioni.

WESTERN-BLOT

La tecnica di Western-blotting o Western-blot è importante in tutti gli ambiti diagnostici in quanto consente di ottenere su un qualsiasi supporto maneggiabile, generalmente una membrana, la replica esatta di ciò che avviene nel gel dopo una corsa elettroforetica. In particolare, dopo elettroforesi,

risulta impossibile eseguire ulteriori analisi sul gel, mentre è possibile farlo sulla membrana. Le bande elettroforetiche, e quindi le proteine, che si trovano trasferite sulla membrana del Western-blot risultano separate in base al peso molecolare ma non ne è nota natura e posizione. Il Western-blot prevede l'aggiunta al substrato di un anticorpo specifico per l'analita di interesse, una volta avvenuto il riconoscimento specifico viene inserito un anticorpo secondario marcato, che può essere di tre tipologie differenti:

1. anticorpo secondario che rilascia colore,
2. anticorpo secondario specifico che ricade esattamente nel punto in cui viene a formarsi l'immunocomplesso,
3. anticorpo secondario che reagisce rilasciando qualcosa di visibile nel punto in cui si viene a formare l'immunocomplesso.

Il risultato di questo test è dato da una serie di bande nere presenti in corrispondenza della proteina di interesse sulla membrana (e di conseguenza).

Anche nel gel elettroforetico). E' importante avere la divisione delle proteine per peso molecolare in quanto è un ulteriore parametro che permette di capire se la proteina è quella corretta.

Il Western-blot ha valenza diagnostica in quanto permette di capire se il paziente esprime o non esprime una data proteina di interesse. Si effettua anche un passaggio detto controllo di caricamento, per verificare che tutti i passaggi siano stati svolti nel modo opportuno: si va a ricercare una proteina housekeeping, ovvero espressa in tutte le cellule, come ad esempio la tubulina: se è presente si conferma la validità del test, se è assente vi è stato un errore nello svolgimento.

14DOT-BLOT: WESTERN-BLOT IN LABORATORI AD ALTA PROCESSIVITA'

Il Western-blot nei laboratori ad alta processività viene effettuato nella modalità semplificata di dot-blot, nel quale non vi è il passaggio elettroforetico, ma si ha solo la

formazionedell’immunocomplesso come precipitato goccia per goccia. Si tratta di una metodica che non permettedi sapere se il peso molecolare della proteina è corretto, e quindi manca di un parametro importante,ma viene utilizzato per screening farmacologici e molecolari.

MICROARRAY

I microarray sono dei vetrini o chip di silice su cui vengono fotolitografati degli epitopi. Si tratta diuna tecnologia che permette di analizzare i profili di espressione genica: a seconda degli epitopi,che, nel protein microarray sono anticorpi (possono anche essere auto-anticorpi), posizionati sulmicroarray, viene passato il siero del soggetto sopra di questi, e vi sarà la formazione degliimmunocomplessi nella posizione in cui è presente l’antigene corrispondente all’anticorpo.

Sarà quindi possibile visualizzare la formazione dell’immunocomplesso grazie alla marcatura delleproteine presenti nel siero (oppure viene utilizzato un anticorpo secondario).

Il risultato di questa analisi è la cosiddetta heatmap, o mappa di calore, una sorta di codice colorato in cui:

• Il colore nero corrisponde al negativo, ovvero non è avvenuta in quel punto, e quindi con quell'epitopo, nessuna reazione;
• Il colore blu corrisponde ad una piccola percentuale di formazione dell'immunocomplesso;
• Il colore giallo corrisponde al positivo, ovvero è avvenuta abbondantemente la formazione dell'immunocomplesso.

Grazie alle heat maps è possibile clusterizzare un'analisi, ovvero andare a costruire dei gruppi, noti come cluster, sulla base di somiglianza e diversità. L'obiettivo dei microarray è quello di riscontrare la possibile malattia prima che questa si manifesti clinicamente: una forte colorazione gialla, ovvero una positività in un paziente che non è ancora affetto da una patologia autoimmune, potrebbe significare che questa patologia si deve ancora manifestare ed è

possibile intervenire tramite medicina preventiva.
ISOELECTRIC FOCUSING
L'isoelettrico