Laboratorio di analisi microbiologica degli alimenti

OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO - ATTIVITÀ ANTIMICROBICA & PROTEOLITICA

fasi :

• numerazione
• isolamento per strisci successivi
• colorazione di gram
• osservazione al microscopio
• saggio ossidasi

argomenti di questo capitolo:

• saggio antibiotico resistenza
• attività antimicrobica
• attività proteolitica
• test biochimici

Saggio antibiotico resistenza:

Si utilizza una capsula petri con terreno agarizzato. Vengono usati antibiotici che sono dispensati su dei dischetti a concentrazione nota, ci sono diverse concentrazioni. La concentrazione dell'antibiotico viene dalle direttive dell'EFSA per valutare l'antibiotico resistenza. Questi dischetti vengono venduti già così e si usa una siringa per dispensare. I dischetti vengono presi con delle pinze e si depositano sulla capsula petri distanziati uno dagli altri. Le piastre vanno incubate e dopo la crescita dei micro si visualizza il risultato ottenuto.

alone di inibizione → antibiotico diffuso in una certa zona vicino

Al dischetto, c'è una zona in cui il micro non riesce a crescere che si chiama alone di inibizione.

MATERIALE OCCORRENTE

• TERRA
• AGAR LATTE
• MRS AGAR SOFT

AGAR LATTE:

PESARE 15G DI AGAR IN UN MATRACCIO DA 1L ED AGGIUNGERE 500ML DI ACQUA DEIONIZZATA. AUTOCLAVARE. DOPO AUTOCLAVE AGGIUNGERE 500ML DI LATTE SCREMATO UHT. DISPENSARE IN CAPSULE PETRI.

MRS AGAR SOFT:

PESARE X G DI MRS BROTH, AGGIUNGERE 3,75 G DI AGAR, AUTOCLAVARE.

Si può anche guardare l'ATTIVITÀ ANTIMICROBICA:

1. Sciogliere l'MRS agar soft (soft perché la % di agar è minore di quella normale) e lasciarlo raffreddare.
2. Inoculare con Listeria sp. al 2% o L. monocytogenes.
3. Dispensare l'MRS inoculato in capsule petri e lasciar solidificare.
4. Strisciare con un ansa sterile il ceppo da saggiare sull'MRS inoculato oppure realizzare dei dischetti.
5. Incubare.

I batteri lattici producono le batteriocine che sono filogeneticamente vicine al micr produttore, sarà attività nei...

confronti di listeria monocytogenes o verso i batteri lattici.

ATTIVITÀ ANTIMICROBICA BATTERIOCINE

Proteine biologicamente attive sintetizzate ribosomalmente o complessi proteici in grado di esercitare attività battericida nei confronti di altre specie batteriche, ma non sul microrganismo produttore.

La batteriocina più nota: la Nisina prodotta da ceppi di Lactococcus lactis subsp. lactis

• Attiva contro altri batteri lattici e patogeni come Listeria monocytogenes e Clostridium botulinum
• Peptide contenente 34 aminoacidi (3354 Da)
• Agiscono modificando il potenziale di membrana attraverso la formazione di piccoli pori e la conseguente fuoriuscita di molecole

ATTIVITÀ PROTEOLITICA - valutare se il mio microrganismi ha enzimi proteolitici ovvero che vanno a degradare le proteine. il risultato finale avrà sempre una zona di inibizione.

Strisciare con un ansa sterile il ceppo da saggiare sull'agar latte. Incubare.

Le proteasi batteriche sono in genere

Le proteasi sono enzimi che vengono prodotte dalla cellula in fase di crescita e sono stabilizzate dalla presenza degli ioni Ca. Questi enzimi sono in grado di idrolizzare tutte le frazioni delle caseina e molte di esse sono termostabili.

I test biochimici, chiamati anche gallerie api, permettono di valutare le capacità fermentative e metaboliche dei microrganismi, nonché la presenza di attività enzimatiche specifiche. Tuttavia, la principale limitazione di questi test è il tempo necessario per apprezzare le modificazioni prodotte dai microrganismi.

Le gallerie api sono composte da microprovette contenenti substrati disidratati che vengono inoculate con una sospensione batterica, ricostituendo così i terreni. Durante il periodo di incubazione, le reazioni prodotte si traducono in viraggi colorati spontanei o rivelati successivamente all'aggiunta di reattivi. La lettura di queste reazioni (positiva/negativa) viene registrata su una apposita tabella che permette di ottenere un risultato.

profilo numerico; tale profilonumerico permette l'identificazione della specie attraverso il confronto con un software di identificazione.

quali sono i TEST BIOCHIMICI - GALLERIE API -> es; presenza di ureasi, lisina decarbossilasiecc.. si basano sulla fermentazione degli zuccheri. gli zuccheri stanno in delle cellette e in base aquello si capisce se il test è positivo o negativo.

Come si fa il test:

• Preparazione della galleria
• Riunire fondo e coperchio di una vaschetta di incubazione e distribuire circa 5 ml d'acqua distillata negli alveoli
• Mettere la galleria nella vaschetta di incubazione.
• Aprire una fiala di API Staph Medium e stemperare al suo interno le colonie
• Servendosi di una pipetta, inoculare le microprovette della galleria con. Riempire solo le microprovette e non le cupole, senza superare il livello superiore della microprovetta stessa. Per evitare la formazione di bolle all'interno delle microprovette inclinare in avanti la vaschetta

tavolino dal basso verso l alto - mettere a fuoco con lavite micrometrica—> microspostamenti del tavolino in modo da poter raggiungere il fuoco - regolarel’intensità della luce —> ghiera rotante che permette di regolare la luce che passa nel tavolino -regolare l’apertura del diaframma considerando che con l’obiettivo 100x il diaframma deve avere lamassima apertura- spostare il preparato sul tavolino mediante il sistema di viti poste al di sotto di esso- individuare un buon campo e quindi ruotare l’obiettivo successivo (10x) e passare poi al 40xmantenendo sempre il fuoco- abbassare leggermente il tavolino traslatore, mettere una goccia di olioda immersione al centro del vetrino, abbassare l’obiettivo 100x con cautela verso la goccia e metterea fuoco - descriverequanto osservatosi usa sempre prima l obbiettivo 4x. si spostano e si girano gli oculari fino all obbiettivo 10x e 40x finoa 100x. quest ultimo viene utilizzato mediante l

olio di immersione come l'olio di legno di cedro perché aumenta la rifrazione della luce, permette un ingrandimento maggiore del preparato. Se abbiamo una sospensione liquida bisogna ricordarsi di agitare prima di metterlo. Se si usa una capsula petri bisogna ricordarsi di stemperarla.

OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO

FORME FUNGINE

Viluppo colturale fungino

Velocità di crescita: è di solito di 5-7 giorni e si ottiene osservando il rovescio dell'aplastra (più lenti rispetto ai batteri).

Sviluppo del micelio: il micelio può essere sommerso o aereo (si sviluppa dentro la capsula o sopra). Esistono colonie piatte, aderenti al terreno, bombate, ondulate, con superficie regolare, eterogenea, opaca, vischiosa, polverulenta, vellutata, lanosa, fascicolata, infeltrita, fioccosa.

La tessitura è determinata dalla disposizione delle ife che supportano la riproduzione; può essere vellutata, lanosa, fascicolata.

Colore e pigmentazione: la colonia assume una

La colorazione evidente si manifesta quando iniziano a maturare le forme di riproduzione. Alcune colonie presentano un micelio vegetativo colorato in modo intenso, per cui è necessaria l'osservazione della cromogenesi superficiale e quella del rovescio della colonia.

Disegno della superficie ed essudazioni: una colonia matura può presentare sulla superficie disegni ed ornamenti particolari come cerchi concentrici, settori circolari, crateri e pieghe. La superficie può inoltre presentare gocce di essudazione, limpide o colorate, localizzate normalmente nella parte centrale.

Fruttificazione: la fruttificazione inizia di solito al centro della colonia per poi diffondersi verso i bordi. I diversi tipi di riproduzione determinano questo aspetto della colonia; possono essere ammassati, a catena, raggruppati, sferici singoli ecc.....

Micelio aereo -> fungo chiamato tricoderma. Sono 3 ceppi diversi e diversi gradi di inoculazione. Durante le fasi di crescita ci sono...

più colorazioni diverse. il micelio si sviluppa sulla superficie superiore della piastra

Micelio sommerso —> il micelio si sviluppa all interno, questa è lamonilia. è in fase di fruttificazione

Caratteristiche delle ife : Con il termine ife si indicano i filamenti unicellulari o pluricellulari, uninucleati o polinucleati, di forma cilindrica allungati, che disposti uno sull'altro formano il micelio, ovvero il corpo vegetativo dei funghi. Si possono osservare sulle ife: pigmentazione delle pareti, la rugosità, la presenza di setti, di inclusioni, di forme di resistenza, di intrecci, di fasci tipici. E’ possibile notare il diametro, che può essere costante o variare lungo l'asse edare strozzature o rigonfiamenti. Hanno molteplici funzioni strutturali e di trasporto delle sostanze nutrizionali.

L'insieme di queste ife costituiscono il vero corpo (Tallo) del fungo (non il "frutto", che viene chiamato carpoforo o

(sporoforo)Classificazione in base alla morfologia del tallo (= corpo fungino)

1. FUNGI FILAMENTOSI o MUFFE —> Caratterizzati da ife.
2. LIEVITI —> Caratterizzati da tallo costituito da cellule isolate, di solito rotondeggianti o dovalari, più o meno grandi, dette blastospore (Alcuni lieviti possono dare origine a forme allungate (sia vere ife che pseudoife)

Pseudoife: sono originate da blastospore che, andando incontro a gemmazione successiva, restano unite tra loro assumendo forma allungata e ricordando la morfologia delle ife

Funghi Filamentosi sono:

1. ZIGOMICETI

Il corpo degli Zigomiceti è il micelio formato da un intreccio di ife. Le ife non possiedono vere pareti o setti cellulari ma il micelio è costituito da un tallo sifonale; Le sporangiospore sono prodotte dentro una struttura simile a una testa di uno spillo chiamato sporangio (S)

2. ASCOMICETI

Gli Ascomiceti producono le spore (ascospore) all'interno d