Appunti di laboratorio Microbiologia degli alimenti

PROCEDURA:

1°) Preparazione campione: prelevare campione H O e capovolgerlo 10 volte per omogeneizzarlo.

2  

2°) Diluizioni seriali decimali: diluizioni utilizzate: 10⁰ (campione originale) 10⁻¹ 10⁻²



 Prelevare 1Ml, trasferirlo in provetta contenente 9mL soluzione fisiologica sterile diluizione 10⁻¹.



 Da questa, prelevare nuovamente 1 mL e trasferirlo in un’altra provetta con 9 mL 10⁻².

3°) Semina in piastra: 1 mL di ciascuna diluizione in 3 piastre Petri sterili vuore (triplicato per > affidabilità).

4°) Aggiunta del terreno colturale: circa 15 mL di Plate Count Agar (PCA) fuso, raffreddato a circa 45°C,

mescolando delicatamente per distribuire uniformemente il campione.

5°) Incubazione: piastre in termostato a 22°C per 72 ore (condizioni standard per aerobi mesofili).

6°) Conteggio UFC : dopo l’incubazione nelle piastre che contengono 10-300 colonie.

(Unità Formanti Colonia)

7°) Calcolo Carica Batterica: con la formula della media ponderata per esprimere il risultato in UFC/mL:

∑



= Esempio: se prendi in considerazione due piastre della diluizione

(1 )

+ 0,1

1 2

10⁻³ (n₁ = 2) e due piastre della 10⁻⁴ (n₂ = 2), allora d = 10⁻³.

 

n₁ = numero di piastre della prima diluizione d = diluizione della prima diluizione

 n₂ = numero di piastre della seconda considerata

Note teoriche da ricordare:

 CBS nell'acqua: parametro che valuta la qualità microbiologica di acque potabili, minerali o di processo.

 Una carica elevata può indicare contaminazione o inefficienza nei trattamenti di disinfezione.

 Si usa PCA perché è un terreno non selettivo adatto a contare i batteri aerobi mesofili.

❓ Domande teoriche frequenti

 

Conta microbica totale e cosa indica? misura carica batterica totale presente in un alimento. Non è

specifica per tipo di microrganismo, ma fornisce un'indicazione generale della qualità igienico-sanitaria.

 

Perché si eseguono le diluizioni decimali? Per ottenere un numero di colonie conteggiabile (10-300

UFC), evitando che le piastre siano troppo piene o vuote.

 

Perché si utilizza il Plate Count Agar (PCA)? terreno non selettivo che consente la crescita della maggior

parte dei batteri aerobi mesofili.

 

Cosa succede se la temperatura di incubazione è troppo alta o troppo bassa? Alcuni microrganismi non

cresceranno o cresceranno in modo anomalo, alterando il risultato.

 

Quali sono i limiti della TMC? Non distingue tra microrganismi patogeni e non, né tra cellule vive e

morte se si usano certi metodi.

 Qual è la differenza tra la CBS a 22°C e quella a 37°C?

 Perché si effettuano le diluizioni? Cosa succede se non le faccio?

 Qual è il significato di UFC?

 Quali sono i limiti normativi della CBS nelle acque potabili?

 DETERMINAZIONE: E. COLI e COLIFORMI TOTALI NELL’ACQUA: ricerca e conta di Escherichia coli e

Coliformi totali, usando filtrazione su membrana e terreno TBX (Tryptone Bile X-glucuronide agar).

PROCEDURA:

1°) Preparazione del campione: Prelevare il campione d’acqua da analizzare e capovolgerlo almeno 10 volte

per assicurare un’omogeneizzazione corretta.

2°) Filtrazione: Filtrare 100 mL di campione (ad esempio con 4 pipettate da 25 mL) attraverso una membrana

con porosità di 0,45 μm utilizzando un sistema di filtrazione a vuoto.

3°) Semina sulla membrana: Rimuovere la membrana con pinze sterili, evitando di capovolgerla, e deporla

delicatamente su una piastra Petri contenente terreno colturale TBX (Tryptone Bile X-glucuronide).

4°) Incubazione: in termostato a 37°C per 24-48 ore (può variare in base al protocollo di riferimento).

5°) Osservazione e interpretazione:

 Colonies blu/azzurre → Escherichia coli Il colore blu è dovuto alla scissione dell’X-glucuronide operata

dall’enzima β-glucuronidasi, tipico di E. coli.

 Colonies incolori o meno colorate → altri coliformi totali

Note tecniche:

 Il TBX agar è un terreno selettivo e differenziale:

Bile inibisce Gram-positivi

- X-glucuronide → substrato cromogenico per β-glucuronidasi

-

 Il metodo è normato per acque potabili, reflue, minerali, ecc.

 La presenza di coliformi indica contaminazione fecale o scarsa igiene.

❓ Domande teoriche frequenti

 Cosa sono i coliformi? → Sono batteri Gram-negativi, anaerobi facoltativi, fermentanti il lattosio, usati

come indicatori di contaminazione fecale o ambientale.

 Che differenza c’è tra E. coli e altri coliformi? → E. coli è un coliforme specifico di origine fecale; la sua

presenza indica contaminazione diretta con feci.

 Come funziona il terreno TBX? → È selettivo per coliformi e differenziale per E. coli, che appare blu per

la produzione di β-glucuronidasi.

 Perché si usa la filtrazione a membrana? → Per concentrare i batteri presenti in volumi grandi d’acqua

con bassa carica microbica.

 Cosa indica la presenza di E. coli in acqua potabile? → Non conformità igienico-sanitaria → l’acqua non

è potabile.

 DETERMINAZIONE: ENTEROCOCCHI NELL’ACQUA

PROCEDURA:

1°) Preparazione del campione: prelevare il campione di acqua da analizzare e capovolgerlo almeno 10 volte

per assicurare un’omogeneizzazione uniforme.

2°) Filtrazione: filtrare 100 mL di campione (ad esempio con 4 pipettate da 25 mL) attraverso una membrana

con porosità di 0,45 μm utilizzando un sistema di filtrazione a vuoto.

3°) Semina della membrana: rimuovere la membrana con pinze sterili, evitando di capovolgerla, e

appoggiarla delicatamente su una piastra Petri contenente KEA agar (Kanamicina Esculina Azide Agar).

4°) Incubazione: delle piastre in termostato a 37°C per 48 ore.

5°) Osservazione delle colonie: dopo l’incubazione, osservare la crescita di colonies marroni o brunastre,

indice della presenza di Enterococchi. Il colore marrone deriva dalla scissione dell’esculina da parte degli

enterococchi, con successiva reazione con i sali ferrici contenuti nel terreno.

Note tecniche:

 Il terreno KEA è un terreno selettivo e differenziale:

Azide sodica → inibisce la flora Gram-negativa

- Kanamicina → inibisce alcuni Gram-positivi indesiderati

- Esculina + sali ferrici → rivelano la presenza di Enterococchi (colonies scure)

-

 Gli Enterococchi fecali sono indicatori più resistenti nell’ambiente rispetto a E. coli, e quindi più adatti a

indicare contaminazioni croniche o pregresse.

❓ Domande teoriche frequenti

 Chi sono gli Enterococchi e perché si ricercano nell’acqua? → Sono batteri Gram-positivi intestinali,

utilizzati come indicatori di contaminazione fecale.

 Qual è il significato della colorazione scura sul KEA? → È dovuta alla scissione dell’esculina e formazione

di composti scuri in presenza di ioni ferrici.

 Perché è importante rilevare gli Enterococchi oltre a E. coli? → Perché resistono più a lungo nell’ambiente

e in condizioni sfavorevoli → contaminazioni pregresse.

 Che caratteristiche ha il KEA agar? → Selettivo per enterococchi e differenziale grazie all'esculina.

 Quali sono i limiti normativi per Enterococchi nelle acque potabili? → Assenza in 100 mL di campione

(come E. coli).

 DETERMINAZIONE: PSEUDOMONAS AERUGINOSA = METODO FILTRAZIONE A MEMBRANA: protocollo per

la ricerca di Pseudomonas aeruginosa in un campione liquido: acqua, bevande o campioni ambientali.

PROCEDURA:

1°) Preparazione campione: capovolgere contenitore campione 10 volte per garantire omogeneizzazione.

2°) Filtrazione del campione filtrare 100 mL di campione attraverso una membrana con porosità di 0,45 μm,

utilizzando: 4 pipettate da 25 mL, oppure direttamente 100 mL tramite filtro a vuoto.

3°) Inseminazione su terreno selettivo: con pinze sterili, rimuovere membrana filtrante e, senza capovolgerla,

appoggiarla su piastra Petri contenente terreno Pseudomonas CN agar (Cetrimide–Nalidixic acid).

4°) Incubazione: delle piastre in termostato a 37°C per 48 ore.

5°) Osservazione colonie: dopo l'incubazione, osservare la crescita di colonie tipiche di P. aeruginosa = colore

blu-verde (dovuto alla produzione di piocianina); a volte può presentare fluorescenza sotto luce UV.

Note tecniche e teoriche

 Il terreno Pseudomonas CN è un terreno selettivo:

contiene cetrimide che inibisce la crescita di altri batteri Gram-negativi

- contiene acido nalidixico che inibisce i batteri Gram-positivi

-

 Metodo basato su filtrazione a membrana, adatta per campioni con bassa contaminazione batterica.

 La porosità da 0,45 μm è standard per il trattenimento dei batteri

❓ Domande teoriche frequenti

 Perché si utilizza il terreno Pseudomonas CN? → selettivo per P. aeruginosa, inibisce flora contaminante.

 Qual è il ruolo della filtrazione a membrana? → Permette di concentrare i microrganismi su una

superficie filtrante per aumentarne la rilevabilità.

 Quali caratteristiche rendono riconoscibile P. aeruginosa? → Colonia blu-verde, a volte fluorescente,

odore caratteristico.

 Perché è importante individuare Pseudomonas aeruginosa? → È un patogeno opportunista, indicatore

di contaminazione e rischio sanitario, soprattutto in ambienti ospedalieri e in acque.

 Che differenza c'è tra Pseudomonas spp. e Pseudomonas aeruginosa? → Il genere Pseudomonas include

molte specie; P. aeruginosa è la specie più rilevante clinicamente.

 DETERMINAZIONE: SPORE B. CEREUS IN ALIMENTI A BASSA a

w

PROCEDURA:

1°) Prelievo e diluizione del campione: prelevare circa 10 g di

prodotto (es. farina, semi, tè, cacao) e inserirli in un

sacchetto sterile + aggiungere soluzione di Sale Triptone in

quantità sufficiente per ottenere la prima diluizione

decimale (10⁻¹).

2°) Omogeneizzare manualmente per almeno 2 minuti.

3°) Pastorizzazione: prelevare 10 mL della sospensione diluita e trasferirli in una provetta sterile. Pastorizzare

la sospensione a 80°C per 10 minuti per eliminare le forme vegetative e selezionare le spore. 

4°) Diluizioni successive: prelevare 1mL sospensione pastorizzata e diluirlo in Sale Triptone: 10⁻² 10⁻³

5°) Semina per spatolamento: eseguire la semina in superficie (per spatolamento) su piastre Petri contenenti

terreno PEMBA (Polymyxin Egg Yolk Mannitol Bromothymol Blue Agar). Vol