Introduzione alla biochimica clinica e tecniche diagnostiche di laboratorio

L’ANTIDISPENSA

Appunti del corso di Medicina di Laboratorio

Biochimica e Patologia Clinica

Cap 1 – introduzione alla biochimica clinica

Cap 2:

Curva di taratura

o Tecniche immunoanalitiche, immunoenzimatiche, ottiche,

o elettroforetiche, cromatografiche

Cap 3 – enzimologia clinica ed enzimi del siero

Cap 4 – proteine del plasma

Cap 5 – valutazione assetto lipidico

Cap 6 – omeostasi glucidica

Cap7 – valutazione dell’uricemia

Cap 8 – valutazione funzionalità renale:

Esame urine

o Equilibrio acido-base

o Emogasanalisi

o Azotemia, uremia, creatinemia, creatininemia

o Equilibrio idro-elettrico

o

Cap 9 – valutazione ipertensione arteriosa

Cap 10 – esami di laboratorio nelle malattie allergiche

Cap 11 – la costellazione antigenica dei tumori, i markers tumorali

Antigeni oncofetali tumorali

o Antigeni associati a tumori e markers di turn-over

o Ormoni e recettori

o Proteine

o Enzimi

o Marcatori immunitari

o Marcatori immunoematologici

o Acidi nucleici

o Metabolici urinari

o Risposte immunitarie

o

Cap 12 – esame emocromocitometrico

Cap 12.1 – anemie

Cap 13 - emostasi ed emocoagulazione

Sistema e fattori della coagulazione

o

o Sistema fibrinolitico

o Esami di laboratorio nello studio dell’emostasi (I e II livello)

o Screening della fase fibrinolitica

Cap 14 – valutazione funzionalità ormonale

Cap 15 – valutazione funzionalità epatica

redatta sulla base di quella che circola dai fotocopiatori

Introduzione alla biochimica clinica – cap 1

La biochimica clinica è una scienza applicata che studia l’effetto delle patologie sui

processi biochimici dell’organismo, prendendo in esame qualsiasi tessuto o fluido

biologico e misurandone sostanze o proprietà indicative.

Il fine della biochimica clinica è quello di prevenire, diagnostica ed, eventualmente,

curare uno stato di malattia.

Questa scienza offre diversi contributi importanti:

1: offre spiegazioni su base puramente biochimica (enzimatica, proteica,

dislipidemica etc…).

2: offre una classificazione nosografica ezio-patologica che affianca quella clinica.

3: offre reperti statisticamente significativi.

4: controlla i fattori di rischio ambientali e di lavoro.

Caratteristiche generali delle misurazioni

Attendibilità

L’attendibilità o bontà di una misurazione è il grado di concordanza tra il valore

“vero” oggetto della misura, e la stima che l’analisi biochimica determina. Questo,

ovviamente, può essere influenzato dal metodo, che rappresenta l’insieme dei metodi

di misura, dell’esperienza del personale, delle influenze ambientali etc…

Precisione

La precisione è il grado di concordanza tra misure replicate effettuate sullo stesso

campione; questo è un valore non esprimibile in termini numerici, ma lo è il suo

reciproco, definita imprecisione; quest’ultima è una misura del grado di discordanza

tra più misure replicate, ed è espressa dal valore della deviazione standard (DS),

espressa nella stessa unità di misura in cui è espresso il valore della singola misura.

L’imprecisione può essere calcolata, inoltre, come DS relativa, anche definta

oefficiente di variazione, calcolata come segue:

CV = (DS/media) x 100

Che cos’è la deviazione standard DS?

La media è un indicatore di tendenza centrale. Dà, infatti, una misura del valore del centro

dei dati. È molto importante avere anche una misura di quanto i dati siano distanti dalla

2 .

media. Si utilizza la varianza indicata con

2

La sua radice = è la deviazione standard o scarto quadratico medio. Questo nome

indica l'operazione per calcolarla: lo scarto dalla media è la distanza tra il dato e la media |

- < > |; lo scarto quadratico è il

i

quadrato dello scarto; dei numeri così ottenuti si considera la media (si sommano e il totale

si divide per il numero dei dati); la radice quadrata di questo numero dà una misura (in

media) di quanto i dati si discostino dalla media.

É già stato detto che fonti di variazione sono presenti in ogni misurazione di un

carattere biologico. Tale variabilità non è tuttavia del tutto imprevedibile: infatti,

molti fenomeni naturali seguono un modello teorico definito «curva di distribuzione

normale» o «gaussiana».

Questo modello è particolarmente utile, in quanto possiamo impiegarlo conoscendo

soltanto la media e la deviazione standard. Infatti, in una gaussiana il 95% dei dati

cade nell'intervallo media ± 2 volte la deviazione standard.

Più precisamente, si può dimostrare che l'intervallo (media ± deviazione standard)

comprende il 68% circa dei dati; l'intervallo (media ± 2 deviazioni standard) ne

comprende il 95% e l'intervallo (media ± 3 deviazioni standard) comprende pressoché

tutti i dati (99.7%).

Ripetibilità

È la misura della deviazione dei risultati dal valore medio.

Riproducibilità

È la misura della deviazione dei dati dal valore medio nel corso di più settimane

effettuata da tecnici che non conoscono l’identità del campione.

Accuratezza

È il grado di concordanza tra la migliore stima (grado medio trovato) ed il valore

1 Questo è un concetto astratto e si considera come

vero (conosciuto) della grandezza.

il più probabile valore ottenibile con metodi differenti che richiedono apparecchiature

complicate, che danno, però, risultati complicati.

(fi)

Specificità -

È la caratteristica del metodo di dosare solo ed interamente la sostanza studiata senza

subire interferenza positive e negative da parte di altre sostanza presenti nel

1 Si osservi che precisione e accuratezza sono due caratteristiche tra loro indipendenti.

materiale; non ha valore numerico. Le tecniche radioimmunologiche hanno, ad

esempio, alta specificità perché le reazioni Ag-Ab sono altamente specifiche.

La specificità diagnostica è usato per indicare l’incidenza di risultati negativi che si

ottengono applicando il test a soggetti non portatori di malattia. Se il test applicato a

100 persone sane offre 100 risultati negativi, la specificità sarà del 100%.

Specificità = VN / (VN + FP) x100

Limite di Rivelabilità

È la più piccola sostanza che il metodo riesce a dosare.

(psi)

Sensibilità -

È l’attitudine del metodo a dosare piccole quantità del componente studiato; non ha

valore numerico. -4 -6

a 10 , cioè dai mg ai g.

Le tecniche ottiche hanno una sensibilità che va da 10 -10 , cioè

Le tecniche radioimmunologiche hanno una sensibilità nell’orgine di 10

degli Å.

La sensibiltà diagnostica indica l’incidenza di risposte positive che si ottengono

applicando il test a pazienti affetti da una malattia. Se un test ha sensibilità del 100%,

2

fornisce 100 risposte positive se effettuato su 100 persone malate.

Sensibilità diagnostica = VP / (VP + FN) x 100

Prevalenza

Rappresenta il numero di pazienti su 100.000 affetti da una malattia in un

determinato momento.

Incidenza 3

È il numero di pazienti su 100.000 che in un anno contraggono la malattia.

Valore Predittivo

Il valore predittivo di un risultato positivo è la percentuale di veri positivi, rispetto ai

positivi totali, che si ottengono quando il test è applicato ad una popolazione mista

(malati + sani). Valore predittivo = VP / (VP + FP) x 100

Analogamente il valore predittivo di un risultato negativo è la percentuale di veri

negativi rispetto ai negativi totali. (veri negativi + falsi negativi)

2 Un buon test deve essere molto sensibile e poco specifico. Si deve tener presente, però, che sensibilità e specificità

sono interdipendenti ed inversamente proporzionali.

3 Risulta chiaro che per le patologie croniche la prevalenza è alta e l’incidenza è bassa, mentre vale il contrario per le

forme acute. Curva di taratura

È la premessa a qualsiasi metodica di laboratorio, perché ne permette

l’interpretazione.

È la rappresentazione grafica della densità ottica in funzione della concentrazione

della sostanza in esame.

Si costruisce effettuando una serie di misurazioni con concentrazioni note della

sostanza e, conoscendo le corrispondenti densità ottiche, si ottiene, in un sistema di

assi cartesiani, una retta, definita retta di interpolazione; questa è una risposta

lineare. Qualora non fosse possibile ottenere una linearità della risposta, significa che

la reazione chimica non segue la legge di Lambert-Beer; in questo caso occorre

tracciare una curva di taratura, da preparare eseguendo un maggior numero di

concentrazioni.

Una volta stabilite la retta o curva di interpolazione, è possibile misurare tutti i

campioni con concentrazioni comprese tra i due limiti, mediante il metodo grafico,

ovvero tracciando rette perpendicolari, e mediante il metodo algebrico.

Cc : Cst = DOc : Dost

Cc = (Cst x DOc) / DOst

Dove:

Cc: concentrazione del campione.

Cst: concentrazione standard.

DOc: densità del campione.

DOst: densità standard.

Se la densità ottica del campione in esame cade al di fuori dei limiti, si possono

operare concentrazioni o diluizioni; in tal caso, però, il risultato dovrà essere per

quanto è stato concentrato, o moltiplicato per quanto è stato diviso.

La curva di taratura definisce, pertanto, i limiti di utilizzazione, ovvero il range di

valori a noi più utili; per esempio le proteine sieriche, in concentrazione media di 7

grammi/100 ml, avrà un range da 1 a 10 grammi/100 ml, corrispondente ai valori

minimi e massimi compatibili con la vita.

È chiaro, inoltre, che il range di concentrazione deve essere quanto più ristretto

possibile per minimizzare al massimo il margine d’errore.

Tecniche immunoanalitiche

L’Immunometria comprende tutte le tecniche che utilizzano una reazione Ab-Ag

per misurare la concentrazione di un dato analita. Tra di esse alcune utilizzano isotopi

radioattivi, altre utilizzano reazioni colorimetriche o reazioni enzimatiche. Il

complessi Ab-Ag possono essere sia in fase liquida che su supporto; gli Ab, a loro

volta, possono essere monoclonali o policlonali.

RIA – Dosaggio Radioimmunologico (Radio Immuno Assay)

È di largo impiego per il dosaggio di ormoni ed altre sostanze di interesse (ferritina,

antigeni virali, CEA). La condizione essenziale