Immunologia (variabilità recettori BCR e TCR)

CATENA PESANTE):

2. Modifiche epigenetiche e reclutamento degli enzimi RAG

Un marcatore epigenetico importante è la metilazione della lisina 4 sull’istone 3

• (H3K4me3).

Questo marcatore richiama RAG2, che a sua volta attiva RAG1.

• RAG1 è l’endonucleasi che taglia il DNA, ma funziona solo insieme a RAG2.

• Il complesso RAG1-RAG2 riconosce delle sequenze chiamate RSS (Recombination Signal

• Sequences):

RSS = eptamero (7nt) + spaziatore (12 o 23nt) + nonamero (9nt).

o Le RSS si trovano:

o al 5’ di ogni J,

▪ al 3’ e al 5’ di ogni D,

▪ al 3’ di ogni V.

▪

- Regola 12-23

Le RSS possono essere unite solo se hanno spaziatori diversi: uno da 12 e uno da 23

• nucleotidi → “regola del 12/23”.

Questo impedisce che si uniscano direttamente V e J, costringendo ad includere il segmento

• D, fondamentale nella catena pesante.

Contesto: la regola del 12/23

Le RSS (Recombination Signal Sequences) guidano la ricombinazione, e ogni segmento (V, D, J) è

affiancato da una di queste sequenze. Le RSS sono di due tipi:

RSS-12: con un “spacer” di 12 nucleotidi.

• RSS-23: con un “spacer” di 23 nucleotidi.

•

La ricombinasi RAG può tagliare e unire solo un segmento con RSS-12 e uno con RSS-23 → è la

regola del 12/23.

Applicazione nella catena pesante

Nella catena pesante delle immunoglobuline:

Il segmento V ha una RSS-23.

• Il segmento J ha una RSS-23.

• Il segmento D ha una RSS-12 da ciascun lato.

•

RISULTATO: V (23) non può unirsi direttamente a J (23) → violerebbe la regola 12/23.

L’unico modo valido per fare la ricombinazione è:

prima D-J (12–23),

• poi V-DJ (23–12).

•

Quindi, la regola 12/23 obbliga a includere il segmento D, che è essenziale nella catena pesante.

La regola 12/23 impedisce che il segmento V si unisca direttamente al segmento J, e così costringe il sistema a

includere il segmento D nella catena pesante — cosa necessaria per produrre un BCR funzionante.

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3. Taglio

Le RAG tagliano il DNA tra i segmenti V e J e le RSS, creando:

• un anello eliminato (contenente il DNA non ricombinato),

o termini tagliati che si ripiegano su sé stessi formando delle strutture a forcina

o (hairpin) all’estremità dei segmenti codificanti.

4. Apertura degli hairpin

Un altro enzima (Artemis) taglia l’hairpin in modo impreciso → crea estremità “appiccicose”

• e asimmetriche.

Durante l’apertura si formano:

• nucleotidi P (palindromici, derivanti dalla forcina),

o nucleotidi N (aggiunti casualmente da TdT).

o

Dopo che il DNA è stato tagliato e sono stati formati gli hairpin (le forcine di DNA che chiudono le

estremità), serve un ulteriore intervento per riaprire queste estremità e collegare i segmenti V-D-J. E

qui entrano in gioco Artemis e TdT:

- Artemis: apertura delle forcine

L’enzima Artemis apre le forcine di DNA che si erano formate alle estremità dei segmenti da

• unire.

Questo taglio non è perfettamente centrale, ma asimmetrico, e quindi crea delle estremità

• sporgenti con sequenze palindromiche (cioè uguali se lette avanti o indietro).

Questi nucleotidi generati in questo modo si chiamano nucleotidi P.

•

Esempio semplice: se la forcina è formata dalla sequenza A-T, Artemis può tagliarla in modo che

una parte sporga con T-A, che è palindromica rispetto all’altra.

- TdT (Terminal deoxynucleotidyl Transferase): aggiunta casuale

Dopo il taglio da parte di Artemis, entra in azione TdT, un enzima che aggiunge nucleotidi a

• caso (non presenti nel genoma originale).

Questi si chiamano nucleotidi N (“N” sta per “Non template”, cioè non copiati da uno stampo).

• Questa aggiunta casuale crea ancora più variabilità nei punti di giunzione tra V, D e J.

•

Importanza: anche se due linfociti usano gli stessi segmenti V, D e J, grazie a questi tagli e

aggiunte casuali, possono avere una sequenza finale diversa → quindi producono anticorpi diversi!

Conseguenza: frame shift

⚠️ Se TdT aggiunge troppi (o troppo pochi) nucleotidi, può rompere la cornice di lettura del gene

• (il “frame” della proteina).

In questi casi, il gene non produce un anticorpo funzionale → il linfocita viene eliminato.

•

In sintesi:

Artemis apre gli hairpin → crea nucleotidi P

TdT aggiunge nucleotidi casuali → nucleotidi N

Questo genera una grande diversità nei punti di unione tra i segmenti V-D-J, aumentando la

varietà di anticorpi che possiamo produrre.

5. Unione delle estremità

Le estremità V-D-J vengono infine riunite da enzimi riparatori (es. DNA ligasi IV).

• Si forma così un gene riorganizzato con:

• Segmento V + D + J uniti in modo unico.

o

Sistemi di riparazione e legame del DNA (NHEJ)

Quando le sequenze V, D e J vengono tagliate per essere unite (ricombinate), si generano rotture a

doppio filamento nel DNA. Queste rotture devono essere riparate e cucite per ottenere una sequenza

continua e stabile. NHEJ

SISTEMA

Quali sono i protagonisti?

️

1. Ku70 / Ku80

Sono proteine che si legano alle estremità rotte del DNA.

o Funzionano come una pinza molecolare: riconoscono le estremità tagliate e le

o mantengono vicine.

2. Sistema NHEJ (Non-Homologous End Joining)

È il meccanismo principale di riparazione del DNA in questo contesto.

o Non richiede omologia (cioè non ha bisogno di una sequenza simile da usare come

o stampo).

Il suo compito è unire direttamente i due capi del DNA.

o

I 3. Artemis

Dopo che Ku ha legato le estremità, Artemis apre le forcine (hairpin) che si erano

o formate, creando estremità più “lavorabili”.

Taglia in modo asimmetrico → questo contribuisce alla diversità giunzionale (P-

o nucleotidi).

4. TdT (Terminal deoxynucleotidyl Transferase)

i Aggiunge nucleotidi casuali (N-nucleotidi) tra le estremità, aumentando la diversità

o degli anticorpi.

5. DNA ligasi IV (con XRCC4)

Infine, “incolla” definitivamente le estremità tra loro → chiude il DNA.

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rumma

Perché è importante?

✅ Senza questo sistema, i segmenti V, D e J non si potrebbero unire correttamente.

• È grazie al NHEJ che le cellule B possono creare un recettore per l’antigene stabile e

• funzionale.

Contribuisce anche alla diversità degli anticorpi, che è fondamentale per il sistema

• immunitario.

→ Dopo la RICOMBINAZIONE SOMATICA:

Trascrizione e traduzione

Il gene riorganizzato viene trascritto in RNA, processato (splicing), e tradotto in una catena

• proteica → la parte variabile della catena pesante o leggera di un anticorpo.

6. Trascrizione

Il DNA viene trascritto in RNA primario, che include anche il segmento Cμ.

•

7. Processamento dell’RNA (splicing)

I segmenti non necessari vengono rimossi (introni) e si ottiene l’mRNA maturo.

•

8. Traduzione

L’mRNA viene tradotto per produrre la catena μ (catena pesante) dell’anticorpo.

• i

momento

La regione CDR3, molto variabile, è formata dai punti di giunzione tra V, D e J → è

• fondamentale per il legame con l’antigene.

→ Dopo la produzione della CATENA PESANTE:

. Verifica se il riarrangiamento è produttivo

Controllo della cornice di lettura (frame)

✅ Quando vengono uniti i segmenti V-D-J, ci può essere una perdita o aggiunta di nucleotidi (es.

• da TdT).

Se il numero totale di nucleotidi mantenuti tra i segmenti è un multiplo di 3, la cornice di

• lettura del gene viene mantenuta → si può produrre una catena pesante funzionale.

Se non è un multiplo di 3 → il frame si rompe → si forma una proteina non funzionale.

•

Associazione con la catena leggera sostitutiva

La catena pesante appena sintetizzata non si lega subito a una catena leggera vera, perché

• quella verrà prodotta più tardi.

In questa fase, si lega invece a una catena leggera sostitutiva, formata da due componenti:

• VpreB

o λ5

o

Insieme, catena pesante + catena leggera sostitutiva formano un recettore pre-B (pre-BCR).

•

Test funzionale: il pre-BCR si esprime in superficie

Se il pre-BCR riesce ad arrivare alla superficie della cellula, significa che:

• La catena pesante è funzionale.

o Può proseguire lo sviluppo → diventa una cellula pre-B.

o

Se il riarrangiamento NON è produttivo

❌ Se la catena pesante:

• È troppo corta o troppo lunga,

o Ha uno stop prematuro,

o Non riesce ad associarsi a VpreB/λ5,

o Non arriva in superficie…

o

Allora la cellula non supera il test → entra in apoptosi (morte cellulare programmata).

•

In sintesi:

Questo passaggio serve per selezionare solo le cellule B che riescono a produrre una catena pesante

corretta e funzionante. Le altre vengono eliminate per evitare linfociti disfunzionali.

. Esclusione allelica

È un meccanismo di controllo durante la maturazione dei linfociti B che serve a garantire che ogni

cellula B produca UN SOLO tipo di recettore per l’antigene (BCR).

Perché è importante?

Ogni cellula B ha due copie (alleli) del gene per la catena pesante dell’anticorpo: una da mamma,

una da papà.

Se entrambe funzionassero contemporaneamente, la cellula potrebbe produrre due diversi BCR,

rischiando di:

riconoscere antigeni diversi,

• diventare autoreattiva (pericolosa),

• perdere l’efficienza del sistema immunitario.

•

Cosa succede nel dettaglio?

1. La cellula inizia la ricombinazione V-D-J su un solo allele della catena pesante.

2. Se il riarrangiamento funziona (cioè produce una catena μ corretta):

Si ferma subito il secondo allele → bloccato.

La cellula esprime un solo tipo di BCR.

3. Se non funziona (es. frame shift, codone di stop):

Prova con il secondo allele.

Se fallisce anche lì → apoptosi (la cellula muore).

Quindi, in sintesi:

La esclusione allelica assicura che ogni linfocita B esprima un solo tipo di anticorpo, con

• una sola specificità.

È un controllo di qualità cruciale per un sistema immunitario efficace e sicuro.

•

Nello specifico il p