Genetica forense - Mutazioni geniche

GENOTIPI

E' necessario correlare la presenza di una variante con l'espressione fenotipica.

Nello studio del significato delle varianti per comprendere le basi molecolari delle malattie, si

deve fare una distinzione tra perdita di funzione e acquisizione di funzione (del prodotto).

Perdita di funzione (totale o parziale): viene a mancare una funzione che la normale

• controparte ha.

Infatti la variante fa perdere alla proteina mutata una funzione che prima tale proteina aveva.

Ad esempio, una variante può far perdere la capacità di una proteina di interagire con

un'altra proteina.

L'eccesso di perdita di funzione è rappresentato dalla delezione

Acquisizione di funzione: viene acquisita una nuova funzione dalla proteina.

• Raramente corrisponde all’acquisizione di una funzione completamente nuova.

Nella maggior parte dei casi, come conseguenza della presenza di una variante, si ha:

1. espressione nel momento sbagliato (es un gene espresso nel feto continua ad essere espresso

nell'adulto)

2. espressione nel posto sbagliato (in un tessuto dove normalmente non è espresso)

3. risposta al segnale sbagliato: può acquisire la possibilità di interagire con una molecola con

la quale normalmente non era in grado di interagire

PERDITA DI FUNZIONE

Quali sono le varianti che causano perdita di funzione?

Le mutazioni loss of function (LOF; per perdita di funzione) causano la perdita della funzione del

prodotto genico che è invece posseduta dalla controparte wildtype dello stesso.

I principali tipi di cambiamento che possono portare alla perdita di funzione di un prodotto genico

sono due.

Consideriamoli nel dettaglio.

1. Cambiamenti che possono avvenire se il prodotto genico è una proteina o un RNA

funzionale

I cambiamenti che possono avvenire se il prodotto genico è una proteina o un RNA funzionale sono:

Delezione di parte o di tutto il gene

• Rottura del gene a causa di un riarrangiamento cromosomico: il riarrangiamento può

• causare la rottura della sequenza di un gene e quindi causare la perdita di funzione del gene

stesso

Blocco o riduzione della trascrizione di un gene per delezione o alterazione del promotore:

• quindi si assiste alla produzione di minor quantità (perdita di funzione dell'allele)

Rimozione dell’accesso a un enhancer a causa di un riarrangiamento cromosomico o per

• attivazione di un elemento insulator (sequenze di DNA che impediscono l’interazione tra

promotori ed enhancer).

La sequenza enhancer, a differenza del promotore, può essere lontana anche migliaia di bp

rispetto ai geni che regola; essa regola l'espressione di un gene mediante la formazione di

un'ansa.

Se si sposta la posizione dell'enhacer per la presenza di riarrangiamento cromosomico, allora

esso non può più controllare l'espressione di un gene quindi si riduce la sua espressione.

Inoltre, l'alterazione della sequenza insulator può alterare la produzione di un prodotto

genico

Abolizione del corretto splicing del trascritto primario o di una specifica isoforma di

• splicing: un danno nelle sequenze di splicing (accettore/donatore) può causare un'alterazione

dello splicing stesso che può portare alla formazione di un codone di stop prematuro con

conseguente degradazione dell'mRNA alterato

Tutte queste varianti danno una perdita di funzioni sia in geni codificanti per proteine sia in geni ad

RNA.

2. Cambiamenti che possono avvenire se il prodotto genico è una proteina

I cambiamenti che possono avvenire se il prodotto genico è una proteina sono (oltre a quelli vista

prima): Delezione o cambiamento del codone AUG di inizio della traduzione: in questo caso il

• codone non viene più riconosciuto come codone di inizio della traduzione.

Quindi o non inizia la traduzione della proteina oppure la traduzione inizia più a valle (con

un altro codone di inizio)

Inserimento o delezione di nucleotidi che causano uno scivolamento del frame di lettura:

• questo causa solitamente la formazione di un codone di stop prematuro che nella maggior

parte dei casi causa la degradazione dell'mRNA (con conseguente riduzione del prodotto

proteico)

Cambiamento del codone che codifica per un aminoacido nei codoni di stop

• (cambiamento non senso): si forma un codone di stop prematuro che causa l'attivazione del

sistema mRNA decay che degrada l'mRNA presentante il codone di stop prematuro

Cambiamento del codone che codifica per un aminoacido in un codone che codifica per

• un aminoacido diverso (ha proprietà biochimiche diverse): in questo caso può essere

alterata la funzione di un dominio conservato della proteina che quindi causa la perdita della

funzione della proteina stessa.

Ad esempio, nel caso di una proteina transmembrana, se una variante causa un'alterazione

del dominio transmembrana della stessa, tale proteina NON può più inserirsi nella

membrana plasmatica e quindi non può più svolgere la sua funzione

Consideriamo alcuni di questi meccanismi (1-2) più nel dettaglio.

Delezione o rottura di un gene

In alcuni casi la rottura di un gene può portare alla perdita di funzione.

Delezione o rottura di un gene portano ad una perdita di funzione del prodotto genico.

Consideriamo, come esempio, il caso dell'emofilia A.

L'emofilia è un carattere X-linked recessivo; il gene responsabile dell'emofilia è il gene F8A.

L'emofilia A può essere causata da un'inversione che spezza (rompe) il gene F8A, localizzato sul

cromosoma X.

Nello specifico, all'interno dell'introne numero 22 del gene F8A c'è una sequenza ripetitiva che

viene indicata dalla barra rossa verticale e che prende il nome di F8A1.

A monte del gene F8A si identificano due copie aggiuntive della sequenza ripetitiva, indicate con il

nome F8A2-3 (hanno omologia di sequenza con F8A1).

Durante la meiosi maschile, questa parte del cromosoma X non ha un omologo con cui appaiarsi

poiché il maschio possiede l'Y; pertanto, le sequenze ripetute possono appaiarsi formando un'ansa.

Un fenomeno di crossing-over tra le sequenze ripetute appaiate causa l'inversione di un segmento

del gene F8A che quindi viene spezzato e non è funzionale.

Nello specifico, gli esoni 1-22 (che sono stati separati) si trovano in orientamento opposto rispetto

agli esoni rimanenti, causando una completa perdita della funzione.

Nonostante il gene F8A sia spezzato e non funzionale, i singoli esoni individuali e le sequenze

introniche fiancheggianti rimangono intatti.

Dal momento che gli esoni del gene F8A sono presenti con la sequenza corretta, il sequenziamento

dell’esoma non riuscirebbe a identificare il riarrangiamento.

Quindi tramite un normale processo di sequenziamento NON sono in grado di identificare queste

alterazioni.

Per poterle identificare:

posso agire a livello della sequenza del DNA effettuando un sequenziamento genomico (non

• un sequenziamento dei singoli esoni).

Con questa tecnica, infatti, si vede che la sequenza è invertita e che c'è una parte a monte

rispetto al suo sito normale

posso agire a livello dell'espressione, sequenziando i cDNA o gli mRNA in un soggetto di

• sesso maschile: in questo caso, tali cDNA/mRNA NON ci sono

Quindi non è facile identificare queste varianti particolari.

Delezione o alterazione del promotore

Delezione o alterazione del promotore portano a perdita di funzione; infatti varianti presenti negli

elementi regolativi del promotore ne alterano la funzione.

Pazienti con malattie legate a perdita della funzione hanno una sostituzione nucleotidica in un sito

per il legame di un fattore di trascrizione a monte del sito di inizio della trascrizione del gene

malattia.

Studi funzionali sono necessari per sapere se queste varianti causano una perdita di funzione.

Le varianti del promotore sono più rare.

Per essere sicuro che le varianti nei promotori causino perdita di funzione è necessario condurre uno

studio funzionale; bisogna infatti essere sicuri che queste varianti promotoriali causino la perdita di

espressione del gene (poiché queste varianti hanno una maggiore variabilità rispetto alle varianti

presenti nelle sequenze codificanti).

Quindi solitamente si effettua un esperimento in vitro.

Nello specifico, si clona il promotore con la variante e lo si posiziona a monte di un gene reporter in

modo da valutare se si ha o meno espressione di questo gene; questo permette di capire se la

variante nel promotore altera l'espressione del gene all'interno dell'organismo.

Se il gene reporter viene espresso allora la variante non altera l'espressione; viceversa, se il gene

reporter è poco espresso o ha espressione nulla, allora la variante promotoriale altera l'espressione

genica.

Si conducono questi studi funzionali per evitare di richiedere un campione patologico di un

paziente (biopsia) per testare se una variante promotoriale è o meno patogena.

Le varianti nei promotori hanno una nomenclatura diversa rispetto alle varianti negli esoni (che

sono considerate dall'inizio della trascirizone).

Le varianti del promotore, che si trovano a monte rispetto al sito di inizio della trascrizione, sono

indicate con il segno – (meno).

Rimozione dell'accesso ad un enhancer

La rimozione dell’accesso ad un enhancer può causare una perdita di funzione tessuto-specifica.

Infatti gli enhancer possono avere un'azione tessuto-specifica ovvero modificare l'espressione di un

gene in un tessuto piuttosto che in un altro.

Gli enhancer sono sequenze di regolazione che legano i fattori di trascrizione e altre proteine, e

formano anse per entrare in stretta vicinanza del promotore che controllano.

In questo modo aumentano l'espressione del gene che controllano.

La delezione o la mutazione di un enhancer può abolire o cambiare (alterata specifciità)

l’espressione di un gene (perché si abolisce la funzione dell'enchancer).

Sono state descritte mutazioni a carico degli enhancer in diverse malattie genetiche.

Inoltre diverse varianti dell'enhancer dello stesso gene possono dare origine a diverse malattie

genetiche.

Nel caso del gene SHH:

una mutazione nella sequenza codificante da oloprosencefalia

• una mutazione nell'enhacer (che ha espressione arto-specifica) può dare polidattilia

• una mutazione nell'enhacer (che ha espressione cervello-specifica) può dare

• oloprosencefalia

Splicing aberrante

Lo splicing aberrante causa frequentemente la perdita di funzione.

Lo splicing è un meccanismo essenziale per formare la sequenza corretta di un trascritto.

Lo splicing è un processo estramemente regolato; infatti devono essere rimossi correttamente gli