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Genetica I

Appunti di genetica su: Genetica mendeliana, alleli, genotipo e fenotipo. Genetica nei batteri e nei virus. Mutazioni geniche e genomiche, inversione, delezione, traslocazione. Genetica di popolazione. Appunti basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Riva.

Esame di Genetica generale docente Prof. P. Riva

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EFFETTO DELL’AMBIENTE SUL FENOTIPO

Lo sviluppo di un organismo multicellulare a partire da uno zigote è il processo di crescita e differenziamento

regolati, risultato dell’interazione del genoma dell0irganismo con l0ambienete interno ed esterno alla cellula.

Lo sviluppo è un intreccio di vie metaboliche complesse. L’ambiente interno o esterno può influenzare cia-

scuna di queste vie, modificando i prodotti dei geni che le controllano. Il grado della manifestazione degli

effetti di un gene può essere misurato in diverse condizioni ambientali.

I geni determinano solo il potenziale per lo sviluppo di un certo fenotipo e la realizzazione di questo poten-

ziale dipende dall’interazione con altri geni e con i loro prodotti e dalle influenze ambientali e da eventi ca-

suali nel processo di sviluppo.

PENETRANZA ED ESPRESSIVITÀ

In alcuni casi, non tutti gli individui con un particolare genotipo manifestano il fenotipo atteso. La percentuale

di individui con un certo genotipo che mostrano il fenotipo corrispondete è detta penetranza del genotipo.

La penetranza dipende sia dal genotipo sia dall’ambiente.

La penetranza è completa (100%) quando tutti gli omozigoti recessivi manifestano un fenotipo, tutti gli omo-

zigoti dominanti mostrano un altro fenotipo e tutti gli eterozigoti sono simili. Molti geni mostrano penetranza

completa, come per esempio gli alleli del sistema del gruppo sanguigno AB0 dell’uomo.

Se meno del 100% degli individui con un particolare genotipo manifesta il fenotipo atteso, la penetranza è

incompleta. Se l’80% degli individui portatori di un certo allele manifesta il fenotipo corrispondente, vi è

l’80% di penetranza. Nell’uomo, molti geni manifestano una penetranza incompleta; per esempio la brachi-

dattilia, un carattere dominante autosomico che comporta accorciamento e malformazioni delle dita, mani-

festa dal 50% all’80% di penetranza.

I geni possono influenzare a diversi livelli. L’espressività è il grado in cui un gene o un genotipo penetrante è

espresso fenotipicamente in un individuo. Come la penetranza, l’espressività dipende sia dal genotipo sia

dall’ambiente e può essere costante o variabile. Un esempio di variabilità dell’espressività si osserva

nell’uomo nella condizione patologica chiamata osteogenesi imperfetta. Le tre principali caratteristiche di

questa malattia sono: colore blu delle sclere (il bianco dell’occhio), ossa molto fragili e sordità. L’osteogenesi

imperfetta è ereditata come carattere autosomico dominante con quasi il 100% di penetranza. Il carattere

mostra un’espressività variabile: un portatore dell’allele mutato può manifestare una qualsiasi delle caratte-

ristiche della malattia o qualsiasi combinazione delle tre. Anche il grado di fragilità delle ossa in chi manifesta

la malattia è molto variabile. 46

L’EFFETTO DELL’AMBIENTE

ETÀ DI INSORGENZA

L’età dell’organismo determina variazioni dell’ambiente interno che possono influenzare l’espressione feno-

tipica associata ad un allele. Non tutti i geni sono attivi contemporaneamente. Nel tempo, l’organismo si

sviluppa, si verificano un’attivazione e una disattivazione programmata di geni. Per esempio, la calvizie soli-

tamente compare nei maschi tra i 20 e 30 anni e i sintomi della distrofia muscolare di Duchenne si manife-

stano nei bambini tra i 2 e i 5 anni. Nella maggior parte dei casi non è nota la natura della dipendenza dall’età.

SESSO

L’espressione fenotipica associata ad un allele può essere influenzata dal sesso dell’individuo. Nel caso dei

geni legati al sesso le differenze tra i fenotipi dei due sessi sono in relazione ai diversi assetti genici dei cro-

mosomi sessuali. In alcuni casi, geni localizzati sugli autosomi controllano un particolare carattere che si ma-

nifesta in un sesso e non nell’altro. Caratteri di questo tipo sono definiti caratteri limitati al sesso. Esempi di

caratteri limitati al sesso sono la produzione di latte nel bestiame e la comparsa delle corna in alcune specie

di pecore.

Una situazione diversa si osserva nei caratteri influenzati dal sesso che sono spesso controllati da geni auto-

somici. Tali caratteri si manifestano in entrambi i sessi, ma lo fanno con una differente frequenza di comparsa

o con una diversa relazione tra genotipo e fenotipo. Un esempio di carattere influenzato dal sesso è la mani-

festazione della calvizie: questo carattere è controllato da un gene autosomico con un allele per la calvizie b

che si comporta da dominante nei maschi e da recessivo nelle femmine. Vale a dire che il genotipo b/b de-

+ +

termina la calvizie sia nei maschi sia nelle femmine, e il genotipo b /b determina un fenotipo non calvo in

+

entrambi i sessi. La differenza risiede nell’eterozigote b /b: nei maschi si ha un fenotipo calvo e nelle femmine

uno non calvo. Altri esempi sono il labbro leporino e la palatoschisi (fusione incompleta del labbro superiore

e del palato), il piede equino, la gotta, l’artrite reumatoide, l’osteoporosi e il lupus eritematoso sistemico

(malattia autoimmune).

TEMPERATURA

Le reazioni biochimiche nelle cellule sono catalizzate dagli enzimi. Gli enzimi non sono influenzati da cambia-

menti di temperatura che si verifichino entro un ambito ragionevole. Alcuni alleli di un gene che codifica per

un enzima possono determinare un enzima sensibile alla temperatura; vale a dire che l’enzima può funzio-

nare correttamente ad una temperatura, ma può non funzionare ad un’altra. Un esempio è il colore della

s

pelliccia nei gatti siamesi: i gatti siamesi sono omozigoti per l’allele recessivo c , siamese, allele del locus C,

s s

che codifica per la tirosinasi. Nel genotipo c /c , la sintesi della melanina nella pelliccia del corpo è bloccata a

causa della presenza di una tirosinasi mutata che, per la sua natura termosensibile, assume una conforma-

zione funzionale a basse temperature. Alla nascita, i gatti siamesi sono color crema o bianchi a causa della

temperatura uniforme dei loro corpi. Appena crescono, le loro estremità (orecchie, naso, zampe e coda) di-

ventano relativamente più fredde in relazione all’aumento della distanza dal centro del corpo. La tempera-

tura più bassa permette l’attività della tirosinasi, cosicché viene sintetizzata la melanina e le estremità diven-

tano più scure. Il resto del corpo conserva un colore più chiaro dovuto al minor livello di attività della tirosi-

nasi. Una situazione simile si verifica anche nei conigli himalayani.

SOSTANZE CHIMICHE

Alcune sostanze chimiche possono avere effetti significativi sull’espressione fenotipica di un determinato

genotipo. Per esempio, la malattia dell’uomo fenilchetonuria (PKU) è un carattere autosomico recessivo, che

comporta un difetto nella via biochimica del metabolismo dell’aminoacido fenilalanina.

GENETICA QUANTITATIVA

CARATTERI DISCONTINUI

Le differenze fenotipiche possono essere classificate in classi alternative ben definite e a numero limitato:

caratteri qualitativi ereditati secondo meccanismi mendeliani semplici. Le mutazioni utilizzate negli studi di

Mendel sono caratterizzati dalla presenza di pochi fenotipi ben distinti. Per esempio, gli involucri dei semi

delle piante di pisello erano grigi o bianchi, i baccelli gialli o verdi e le piante erano alte o basse. Per ciascun

47

carattere i fenotipi erano chiaramente distinti e facilmente distinguibili da tutti gli altri. Caratteri come questi,

con solo pochi fenotipi distinti, sono definiti caratteri discontinui. Per questi caratteri esiste una relazione tra

il genotipo e il fenotipo.

CARATTERI CONTINUI

Molti caratteri, come il peso alla nascita e la statura nell’adulto, mostrano un’ampia varietà di possibili feno-

tipi. Caratteri come questi, che presentano una distribuzione continua di fenotipi, vengono definiti caratteri

continui. Dato che i fenotipi dei caratteri continui devono essere descritti in termini quantitativi, tali caratteri

sono anche denominati caratteri quantitativi, e lo studio della loro trasmissione ereditaria costituisce il

campo di studi della genetica quantitativa.

CARATTERI QUANTITATIVI

Le differenze tra gli individui dipendono dal grado di espressione del carattere e sono rilevabili mediante

misure: Gli individui non sono raggruppabili in classi distinte

Ø Quanto maggiore è il numero delle osservazioni, tanto più la distribuzione delle frequenze si av-

Ø vicina alla distribuzione normale

NB: il sistema di misurazione deve essere accurato

CARATTERI MULTIFATTORIALI

Ampia gamma di fenotipi

Ø Assenza di relazione semplice tra fenotipo e genotipo

Ø All’aumentare del numero di geni aumenta il numero di genotipi possibili

Ø A seconda delle condizioni ambientali, un singolo genotipo può avere svariati fenotipi e un singolo

Ø fenotipo può essere dovuto a diversi genotipi

Un esempio di carattere multifattoriale è l’altezza.

All’aumentare del numero dei geni che controllano un carattere multifattoriale, il numero delle classi fenoti-

piche in F aumenta.

2

CARATTERISTICHE DI UN SISTEMA POLIGENICO

1. Numero di geni elevato

2. Piccolo contributo di ogni gene

3. Effetti fenotipici simili e additivi

4. Espressione sensibile agli effetti ambientali

5. Geni associati o indipendenti

Il colore della pelle è un carattere poligenico: 3 o 4 sono i geni responsabili di un ampio spettro di fenotipi.

Poiché i fattori ambientali (esposizione al sole e a diverse condizioni atmosferiche) possono contribuire alla

variazione del fenotipo, il colore della pelle è anche un carattere multifattoriale.

EREDITÀ MULTIFATTORIALE NELL’UOMO

1. Caratteri a variazione continua: statura, peso, IQ, colore della pelle, pressione arteriosa, livello del

colesterolo, numero creste delle impronte digitali

2. Caratteri a variazione discontinua: caratteri con effetto soglia. La distribuzione normale dipende dal

numero dei fattori predisponenti → manifestano la malattia gli individui che ereditano un numero di

fattori predisponenti superiore al valore soglia (spesso omozigosi di alleli recessivi)

3. Malformazioni congenite: palatoschisi, labioschisi, lussazione congenita dell’anca, stenosi pilorica,

difetti cardiaci congeniti, difetti del tubo neurale (anencefalia, spina bifida)

4. Malattie comuni in età adulta: malattie coronariche, ipertensione, obesità, diabete

ANALISI DEI CARATTERI QUANTITATIVI

1. Effetto del genotipo e dell’ambiente

2. Previsioni sulla trasmissibilità di alcune caratteristiche alla progenie 48

GENETICA DEI BATTERI

I batteri si dividono per scissione binaria (→ eredità verticale). Il materiale genetico può anche essere tra-

sferito tra batteri per: trasformazione, coniugazione e trasduzione, che costituiscono l’eredità orizzontale.

È possibile mappare i geni batterici utilizzando uno qualsiasi di questi metodi, ma in tutti i casi: il trasferi-

mento è unidirezionale e non si forma un completo stadio diploide.

Il batterio più usato è Escherichia Coli che può essere coltivato in un terreno semplice e definito e può essere

manipolato con semplici tecniche microbiologiche; E. coli è un organismo di forma cilindrica di circa 1-3µm

di lunghezza e 0,5µm di diametro. Contiene un singolo DNA cromosomico circolare.

TRASFORMAZIONE BATTERICA

La trasformazione è il trasferimento di materiale genetico tra batteri mediato da frammenti di DNA extracel-

lulare., che porta ad un cambiamento fenotipico del ricevente. In questo processo non c’è un contatto fisico

diretto tra cellule batteriche ma il batterio ricevente assume il DNA presente nell’ambiente esterno.

In esperimenti di mappatura mediante trasformazione si estrae e si purifica il DNA, spezzato in piccoli fram-

menti, del ceppo donatore. Questo DNA viene aggiunto ad una sospensione di batteri riceventi con genotipo

differente. Il DNA del donatore che viene assunto dalla cellula ricevente può ricombinare con la regione omo-

loga del cromosoma del ricevente dando luogo ad un cromosoma ricombinante. I riceventi che in seguito alla

trasformazione presentano un nuovo fenotipo vengono detti trasformanti.

Le specie batteriche variano nella loro capacità di assumere il DNA dall’esterno. Per aumentare l’efficienza di

trasformazione, le cellule in laboratorio vengono trattate chimicamente o sono esposte ad un forte campo

elettrico in un processo chiamato elettroporazione, che rende le membrane cellulari più permeabili al DNA.

Le cellule preparate per assume il DNA con la trasformazione sono dette cellule competenti.

Vi sono due tipi di trasformazione batterica: la trasformazione na-

turale, nella quale i batteri sono naturalmente in grado di assu-

mere il DNA e di essere trasformati, e la trasformazione ingegne-

rizzata, nella quale i batteri sono stati modificati per permettere

l’assunzione del DNA extracellulare e la successiva trasformazione

genetica.

Il filamento di DNA a doppio filamento del donatore è selvatico

+

(a ), mentre la cellula ricevente porta l’allele mutato a. Durante

l’assunzione del DNA, uno dei due filamenti viene degradato, co-

sicché nella cellula se ne ritrova solo uno intatto (b). Questo sin-

golo filamento lineare si appaia con il DNA omologo presente sul

cromosoma circolare della cellula ricevente, formando una re-

gione a tripla elica (c). a questo punto può avvenire ricombina-

zione, mediante due eventi di ricombinazione tra il singolo fila-

mento e il DNA a doppia elica del ricevente (d). il risultato è un

cromosoma ricevente ricombinante: nella regione compresa tra i

+

due eventi di scambio, un’elica del DNA porta il segmento a .

Una regione di DNA che porta una diversa informazione nella se-

quenza dei due filamenti si definisce un eteroduplex di DNA. L’al-

tro prodotto del doppio evento di ricombinazione è un fram-

mento di DNA a singolo filamento che porta l’allele a e che viene

degradato.

Dopo la replicazione del cromosoma del ricevente, un cromosoma

della progenie porterà l’informazione genetica del donatore su

+

entrambi i filamenti del DNA e sarà un trasformante a (e). L’altro

cromosoma formatosi porterà l’informazione genetica del rice-

vente su entrambi i filamenti e sarà non-trasformante a. 49

Usando la trasformazione è possibile determinare se due geni sono associati, l’ordine dei geni nella mappa

genetica e la loro distanza. Il principio per determinare se due geni sono associati è il seguente: una trasfor-

mazione efficiente coinvolge frammenti con una dimensione sufficiente ad includere soltanto pochi geni. Se

+ +

due geni, x e y , sono molto lontani sul cromosoma del donatore, si troveranno sempre su frammenti diversi

+ +

di DNA. Quindi, dato un certo donatore x y e un ricevente xy, la probabilità di trasformazione simultanea

+ +

(cotrasformazione) del ricevente in x y sarà data dal prodotto delle probabilità di trasformazione per ciascun

gene preso singolarmente. Invece, se due geni sono sufficientemente vicini da potersi trovare frequente-

mente su uno stesso frammento di DNA, la frequenza di cotrasformazione darà simile alla frequenza di tra-

sformazione per un singolo marcatore. I risultati di cotrasforma-

zione permettono anche di determinare l’ordine dei geni. Se i geni

p e q sono trasmessi frequentemente insieme, dovranno essere

abbastanza strettamente associati. Analogamente, se i geni q e o

vengono cotrasmessi con alta frequenza, devono trovarsi vicini.

Per determinare l’ordine dei geni bisogna avere informazioni ri-

guardo ai geni p e o. vi sono due possibili ordini: p-o-q e p-q-o. se

l’ordine corretto è p-o-q, allora p e o devono essere trasmessi in-

sieme perché sono più strettamente associati di p e q; se invece

l’ordine è p-q-o, allora p e o potrebbero essere trasmessi insieme

raramente o mai, perché potrebbero trovarsi relativamente di-

stanti. I risultati indicano che non ci sono cotrasformanti per p e

o, quindi l’ordine dei geni deve essere p-q-o.

CONIUGAZIONE BATTERICA

La coniugazione è un processo nel quale avviene il trasferimento unidirezionale di informazione genetica

attraverso il contatto diretto tra una cellula batterica donatrice e una ricevente. Il contatto è seguito dalla

formazione di un ponte citoplasmatico che connette fisicamente le cellule. In seguito, un segmento del DNA

del donatore può essere trasferito nel ricevente e può andare incontro a ricombinazione con la regione omo-

loga del cromosoma del ricevente. I riceventi che hanno incorporato un pezzo del donatore nel loro cromo-

soma sono chiamati transconiuganti.

La coniugazione fu scoperta nel 1946 da Joshua Lederberg ed Edward Tatum. Essi studiarono due ceppi di E.

+ + +

coli che differivano per le richieste nutrizionali. Il ceppo A aveva genotipo met-bio-thr -leu -thi , quindi poteva

crescere solo in un terreno addizionato con l’aminoacido metionina (met) e la vitamina biotina (bio), ma non

necessitava degli aminoacidi treonina (thr) e leucina (leu) né della vitamina tiamina (thi). Il ceppo B aveva il

+ +

genotipo met -bio -thr-leu-thi, quindi poteva crescere solo in un terreno addizionato con treonina, leucina e

tiamina, ma non richiedeva metionina né biotina.

Lederberg e Tatum mescolarono i ceppi A e B e li seminarono su

piastre di terreno minimo. Le colture miste diedero origine ad al-

+ + + + +

cune colonie prototrofe (met -bio -thr -leu -thi ) con una fre-

quenza di 1 su 10 milioni di cellule. Dato che nessuna colonia era

comparsa quando ciascun ceppo era stato piastrato singolar-

mente su terreno minimo, fu escluso che l’origine delle colonie

prototrofe fosse dovuta a mutazione. Il mescolamento dei due

ceppi favoriva un incrocio

genetico capace di dare ori-

gine ai ricombinanti.

In un diverso esperimento,

Bernard Davi pose i ceppi A

e B in terreno liquido ai due

lati di un tubo ad U, separati

da un filtro poroso i cui pori

erano troppo piccoli per 50

permettere il passaggio dei batteri. Il terreno veniva mosso tra i due scomparti alternando aspirazione e

pressione. Infine, le cellule vennero piastrate su terreno minimo per verificare la comparsa di colonie proto-

trofe. Non comparve alcuna colonia prototrofa, suggerendo che il contatto cellula-cellula era necessario per-

ché potesse avvenire lo scambio genetico.

IL FATTORE SESSUALE F

Nel 1953 William Hayes dimostrò che lo scambio genetico in E. coli è unidirezionali, con una cellula che agisce

come donatore e l’altra cellula che agisce da ricevente. Hayes propose che il trasferimento del materiale

genetico tra i ceppi fossi mediato da un fattore sessuale, chiamato fattore F, che la cellula donatrice possiede

+ -

F e del quale la cellula ricevente è priva F . Il fattore F trovato in E. coli è un episoma, cioè un frammento di

DNA circolare, capace di replicazione autonoma, indipendente dal cromosoma batterico mai in grado di in-

tegrarsi in esso. Questo fattore è una lunghezza pari a circa 1/40 del cromosoma batterico e contiene una

regione in DNA, chiamata origine O, che è il punto dal quale ha inizio il trasferimento del DNA al ricevente.

Esso contiene inoltre altri geni, inclusi quelli che determinano la formazione di specifiche strutture filiformi,

+ -

chiamate pili sessuali o pili F, sulla superficie cellulare, che permette l’unione fisica tra le cellule F e F .

+ -

Quando cellule F e F vengono messe a contatto, esse possono coniugare. La

coniugazione non avviene se le due cellule sono dello stesso sesso (entrambe

+ - + -

F o entrambe F ). Durante la coniugazione, una cellula F contatta una cellula F

connettendovisi attraverso un lungo pilo F tubolare. Quindi le due cellule si av-

vicinano e si forma un ponte citoplasmatico che le mette in contatto diretto.

Durante la coniugazione, il materiale genetico viene trasferito dal donatore al

ricevente dopo che un filamento del DNA del fattore F, è stato tagliato all’ori-

gine. La replicazione del DNA circolare procede da quel punto (2). Cominciando

-

dall’origine, un singolo filamento di DNA viene trasferito alla cellula F , mentre

la replicazione mantiene il fattore F in forma circolare a doppio filamento (3).

Una volta che il DNA a singolo filamento del fattore F entra nella cellula rice-

-

vente F , la DNA polimerasi sintetizza nel ricevente quello complementare (4).

- +

Quando tutto il fattore F è trasferito e circolarizzato, la cellula F diventa F (5).

Per ottenere ricombinazione di geni cromoso-

mici attraverso la coniugazione, sono necessari

particolari ceppi derivati dai ceppi F+, chiamati

Hfr (High frequency of recombination, ad alta

frequenza di ricombinazione). I ceppi Hfr hanno

origine per un raro evento di ricombinazione

mediante il quale il fattore F si integra nel cro-

mosoma batterico (1-2). Quando il fattore F è in-

tegrato, non replica più in modo indipendente,

ma viene replicato come parte del cromosoma

ospite. A causa dei geni del fattore F, le cellule

Hfr sono capaci di coniugarsi con cellule F- (3). Durante l’incrocio, il fattore F

integrato viene tagliato in corrispondenza dell’origine e la replicazione inizia

(4). Durante la replicazione, una parte del fattore F, che inizia con l’origine di

replicazione, si trasferisce all’interno della cellula ricevente, dove il filamento

trasferito viene copiato ( = il cromosoma del donatore inizia ad essere trasfe-

rito nel ricevente). Se ci sono differenze alleliche tra i geni del donatore e

quelli del ricevente, è possibile isolare dei ricombinanti (5). Il processo di ri-

combinazione avviene attraverso una doppia ricombinazione tra il DNA li-

-

neare del donatore e quello circolare del ricevente. Negli incroci Hfr x F , la

-

cellula F non acquisisce quasi mai il fenotipo Hfr, deve ricevere una copia

completa del fattore F. 51

È possibile il fenomeno dell’escissione del fattore F, ovvero il fattore F si

ripiega all’esterno del cromosoma del ceppo Hfr e vengono generati un

cromosoma circolare dell’ospite e un fattore F circolare extracromoso-

mico.

Dato che il fattore F si può integrare in molti punto del cromosoma, diversi

segmenti del cromosoma batterico possono essere portati via in questo

modo. Si consideri un ceppo di E. coli nel quale il fattore F si sia integrato

+

vicino alla regione lac , una serie di geni richiesti per il catabolismo del lat-

+

tosio (a). Se l’escissione non avviene in modo preciso, i geni lac dell’ospite

possono trovarsi inclusi nell’ansa di DNA ripiegato (b). Quando, con un sin-

golo crossing-over, il DNA che ha formato l’ansa verrà separato dal cromo-

soma dell’ospite (c), il nuovo plasmide generato conterrà, oltre al fattore

+

F, anche i geni lac del cromosoma dell’ospite. I fattori F che contengono

geni batterici sono chiamati F’ e prendono il nome dai geni che hanno pre-

levato (F’ (lac)). Le cellule che contengono un fattore F’ possono coniugarsi

-

con cellule F .

MAPPATURA GENICA BATTERICA

Alla fine degli anni cinquanta del secolo scorso, Francois Jacob ed Elie Wol-

lman hanno studiato il trasferimento di geni cromosomici da ceppi Hfr a

-

cellule F , che differivano per diversi marcatori. L’esperimento consisteva

-

nel realizzare un incrocio Hfr x F e nel separare, agitando le cellule con un frullino a vari intervalli di tempo

dall’inizio della coniugazione, i batteri coniuganti per analizzare i transconiuganti e determinare quali geni

del donatore erano stati acquisiti dal ricevente. Questo esperimento viene chiamato coniugazione interrotta.

L’uso dell’interruzione dell’incrocio per mappare geni batte-

rici può essere illustrato dal seguente incrocio:

Donatore: + + R R + + S

HfrH thr -leu -azi -ton -lac -gal -str

Ricevente:

- S S + R

F thr-leu-azi -ton -lac-gal -str

L’apice S significa “sensibile” e la R indica “resistente”.

Il ceppo HfrH è prototrofo, resistente all’inibizione della cre-

R

scita provocata dalla sodio azide (azi ) e all’infezione con il

R

batteriofago T1 (ton ); è invece sensibile all’inibizione

S -

dell’antibiotico streptomicina (str ). Il ceppo F è auxotrofo

per treonina (thr) e leucina (lea), sensibile alla sodio azide

S S

(azi ) e all’infezione con il batteriofago TI (ton ), incapace di

fermentare il lattosio (lac) o il galattosio (gal) e resistente

all’inibizione della crescita provocata dalla streptomicina

R

(str ).

In questo esperimento di coniugazione, i due tipi di cellule

vengono mescolati in un terreno liquido a 37 °C. A vari

tempi, vengono prelevati campioni dei batteri coniuganti

che vengono agitati per interrompere gli accoppiamenti.

Piastrando su terreni selettivi, vengono cercati i ricombi-

nanti e viene stabilito il tempo di ingresso nella cellula dei

primi geni del donatore che hanno prodotto ricombinanti.

In questo particolare incrocio, il terreno contiene streptomi-

-

cina per uccidere il ceppo HfrH e manca di treonina e leucina, cosicché il parentale F non può crescere. l geni

+ + -

treonina (thf ) e leucina (leu ) sono i primi geni del donatore trasferiti alla cellula F , producendo un merodi-

ploide, quindi i ricombinanti che si formeranno per scambio tra questi geni e i geni thr e leu della cellula

-

ricevente F potranno crescere sul terreno selettivo. 52

+

La figura (b) mostra i risultati. I geni per la treonina (thr ) e la leucina

+ -

(leu ) sono i primi geni del donatore trasferiti alla cellula F , dopo 8

R

minuti. Il successivo gene trasferito è azi e i ricombinanti per questo

gene vengono osservati dopo circa 9 minuti, cioè circa un minuto

+ + R

dopo che sono entrati thr e leu . l ricombinanti ton compaiono

+

dopo 10 minuti, seguiti da quelli lac dopo circa 16 minuti e da quelli

+

gal dopo circa 25 minuti. La massima frequenza di ricombinanti si

abbassa man mano che i geni entrano nel ricevente; questo perché,

col passare del tempo, un certo numero di coniugazioni si interrompe

spontaneamente.

In questo esperimento ciascun gene del ceppo Hfr compare nei ri-

combinanti a un tempo diverso, ma riproducibile, dopo l’inizio della

coniugazione. In questo modo, sulla base degli intervalli di tempo

dell’esperimento, può essere costruita la mappa (c), dove le unità di

mappa sono espresse in minuti. l’intero cromosoma di E. coli richiede

circa 100 minuti per il suo trasferimento.

CIRCOLARITÀ DELLA MAPPA DI E. COLI

Un solo fattore F è integrato in ciascun ceppo Hfr. Diversi ceppi Hfr hanno un fattore F integrato nel cromo-

soma in posizioni diverse e in orientamenti diversi. Quindi, i ceppi Hfr differiscono l’uno dall’altro riguardo al

punto dal quale ha inizio il trasferimento e all’ordine dei geni trasferiti.

La (a) illustra l’ordine di trasferimento dei geni cromoso-

mici per quattro diversi ceppi Hfr: H, 1, 2 e 3. In ciascun

caso, un solo ceppo Hfr è stato incrociato con un ricevente

e sono stati determinati l’ordine dei geni trasferiti e il

tempo di comparsa nella cellula ricevente. La distanza ge-

netica in unità di tempo tra una particolare coppia di geni

è costante, qualunque sia il ceppo Hfr utilizzato come do-

natore.

In base a questo tipo di dati viene costruita una mappa ge-

netica del cromosoma allineando i geni trasferiti da ciascun

ceppo Hfr (b). Data la sovrapposizione dei geni nei diversi

incroci, la mappa più semplice che si possa costruire è una

mappa circolare (c). La mappa è quindi composta sulla base

dei risultati di diversi incroci singoli.

TRASDUZIONE BATTERICA

La trasduzione è un processo nel quale batteriofagi (virus batterici, chiamati anche fagi) trasferiscono geni da

un batterio (donatore) ad un altro (ricevente); questi fagi sono chiamati vettori fagici. Dato che la quantità

di DNA che un fago può assemblare e trasportare nel suo capside è limitata, la quantità di materiale genetico

che può essere trasferita è di solito meno dell’1% dell’intero cromosoma batterico. Una volta introdotto nella

cellula ricevente, il materiale genetico può andare incontro a ricombinazione con la regione omologa del

cromosoma del ricevente. I riceventi ricombinanti sono chiamati trasduttanti. 53

VIRUS

4 tipi principali di particelle virali classificabili per la forma:

Simmetria cubica

Ø Simmetria elicoidale

Ø Simmetria complessa

Ø Sferica

Ø

Sono meno complessi rispetto ai procarioti ed eucarioti, hanno una natura non cellulare. Si replicano all’in-

terno di una cellula ospite.

All’esterno della cellula si presenta come una particella, virione: presenta un involucro proteico in cui di trova

il materiale genetico (DNA a singolo filamento o doppio filamento, RNA). I virioni non sono in grado di meta-

bolizzare e di riprodursi, attaccano l’ospite dando origine all’infezione.

I batteriofagi (o fagi) sono dei virus che infettano i batteri. Un fago ha una struttura semplice, consiste in un

singolo cromosoma di DNA o RNA circondato da un involucro proteico. Il fago inietta il proprio cromosoma

nella cellula e i geni virali dirigono le funzioni cellulari per produrre una progenie di particelle fagiche che

l.

verranno rilasciate dal batterio in seguito alla sua lisi. Esempi di fagi sono: i fagi T2 e T4, il fago

Il ciclo vitale di un fago si

chiama ciclo litico. l

Il ciclo vitale del fago è più

complesso di quello del fago

T2. Quando il DNA del fago

l viene iniettato in E. coli,

possono verificarsi due cicli

alternatici. Uno è il ciclo litico

e l’altro è il ciclo lisogeno.

Nel ciclo lisogeno, il cromo-

l

soma di non si replica, e

viene inserito (integrato) in

una specifica regione del cro-

mosoma della cellula ospite.

In questo stato integrato, il

genoma del fago viene chia-

mato profago. Ogni volta che

il cromosoma della cellula

l

ospite replica, il cromosoma di integrato replica con esso. Il batterio che contiene un fago allo stato di

profago viene chiamato lisogeno per questo fago; il fenomeno dell’inserzione del cromosoma del fago nel

cromosoma batterico viene chiamato lisogenia. I fagi che possono scegliere tra il ciclo litico e il ciclo lisogeno

vengono chiamati fagi temperati.

MAPPATURA DEL CROMOSOMA BATTERICO MEDIANTE TRASDUZIONE

La trasduzione può essere usata per mappare i geni batterici. Possono avvenire due diversi tipi di trasduzione:

nella trasduzione generalizzata, qualsiasi gene può essere trasferito da un batterio all’altro; nella traduzione

specializzata vengono trasferiti solo determinati geni. 54

TRASDUZIONE GENERALIZZATA

Nell’immagine viene mostrato il meccanismo di trasduzione generalizzata operata dal fago temperato P1 in

E. coli. Normalmente il fago P1 entra nello stato lisogeno dopo aver infettato il batterio E. coli (1). Se lo stato

lisogeno non viene mantenuto, il fago entra nel ciclo litico e produce una progenie fagica (2). Durante il ciclo

litico, il DNA batterico viene degradato e, in rare occasioni, frammenti di DNA batterico possono essere im-

pacchettati nella testa del fago al posto del DNA del fago (3). Questi fagi sono chiamati fagi trasducenti, dato

che essi fungono da veicoli per il trasporto di materiale genetico da un batterio all’altro. Nell’immagine i fagi

+ + +

trasducenti sono quelli rappresentati con a , b e c . La popolazione di fagi presente nel lisato (4) consiste per

5

la maggior parte di fagi normali, ma tra questi è presente circa una particella fagica trasducente ogni 10

elementi normali. Questo lisato può essere usato per infettare una nuova popolazione di batteri (5). I batteri

+

riceventi hanno genotipo a. Se un fago trasducente che porta l’allele a infetta il batterio, può avvenire scam-

+

bio genetico tra il gene a del donatore e il gene a del ricevente mediante un doppio evento di ricombinazione

(6). Il risultato è un batterio trasdotto stabile, detto trasduttante.

Il processo appena descritto viene chiamato trasduzione generalizzata perché il pezzo di DNA batterico che

il fago assume erroneamente e trasporta nel batterio ricevente, è un pezzo casuale del cromosoma batterico

frammentato. Quindi, qualsiasi gene può essere trasdotto. Attraverso la trasduzione generalizzata è possibile

stabilire l’ordine e la distanza di mappa tra geni che vengono cotrasdotti.

TRASDUZIONE SPECIALIZZATA Alcuni batteriofagi temperati

possono trasdurre solo determi-

nate parti del cromosoma batte-

rico. Un esempio di fago che

opera la trasduzione specializ-

l,

zata è che infetta E. coli. Nel

l

ciclo lisogeno, il genoma di si

integra nel cromosoma batterico

in un sito specifico tra le regioni

gal e bio, producendo quello che

viene chiamato un lisogeno (a).

Questo sito sul cromosoma di E.

coli viene chiamato attl ed è

l

l’omologo di un sito nel DNA di l

chiamato att. Il cromosoma di

si integra con un singolo evento

di ricombinazione. Il fago, che

viene chiamato profago, si man-

tiene allo stato integrato per

l’azione di una proteina repres-

sore codificata dal fago stesso.

Solo alcuni geni batterici pos-

sono essere trasferiti, quelli vi-

cino al punto di inserzione, poi-

ché i fagi temperati si inseri-

scono nel cromosoma batterico.

55

MUTAZIONI

GENICHE: cambiamenti che riguardano una o poche basi. Mutazioni puntiformi. Mutazioni

• geniche che alterano il fenotipo di una proteina, ne cambiano la funzione. Possono essere

causate da:

o Errori nella replicazione

o Cambiamenti chimici spontanei

o Cambiamenti causati da sostanze chimiche o agenti fisici

o Mancanza di riparazione dei meccanismi che riconoscono e riparano gli errori

GENOMICHE: mutazioni che coinvolgono interi genomi, quindi implicano variazioni

• nell’intero assetto cromosomico (sono cambiamenti riguardanti uno o più cromosomi o

regioni cromosomiche).

Nel 1900 “Teoria Lamarkiana”: l’ambiente induce cambiamenti che poi possono essere ereditati.

L’organismo viene sottoposto a selezione naturale che può essere favorevole se la mutazione

migliora l’adattamento e contraria se la peggiora.

Diverse erano le scuole di pensiero: da un lato i genetisti credevano che la variabilità tra organismi

fosse dovuta a mutazioni spontanee e casuali che a volte avevano carattere adattativo, dall’altra

(teoria lamarkiana) credevano che la variabilità fosse conseguente ad un adattamento, cioè che

l’ambiente inducesse un cambiamento ereditabile.

Esperimento: prendo una coltura di derivata da una singola cellula di E. coli, la infetto con grandi

quantità del batteriofago T1 virulento: la maggior parte muore lisata. Alcune cellule sopravvivono e

trasmettono il carattere alle cellule figlie generando una coltura di cellule resistenti al T1.

I sostenitori della teoria dell’adattamento sostenevano che il carattere della resistenza fosse

• comparso come conseguenza della presenza del fago nell’ambiente.

Quelli della teoria della mutazione spontanea ritenevano che le mutazioni avvengono

• casualmente cosicché in una popolazione di cellule, alcune possono in qualsiasi momento

andare incontro a mutazioni diventando resistenti al fago T1 pur senza essere state messe in

contatto con questo.

Per vedere quale teoria risultasse corretta S. Luria e M. Delbruck utilizzano il test di fluttuazione:

aggiungono il fago T1 alla quarta generazione pertanto se fosse corretta la prima si avrebbe la

mutazione in quel momento e la frazione di cellule resistenti sarebbe uguale per tutte le colture

dello stesso tipo perché l’adattamento non ha inizio prima del T1. Se fosse corretta la seconda si

avrebbe una fluttuazione del numero di cellule resistenti a T1 in quarta generazione perché dipende

da quando è insorta la mutazione casuale.

Viene dimostrato che questo tipo di mutazioni sorge casualmente.

DEFINIZIONI DI MUTAZIONI

FREQUENZA DI MUTAZIONE: è il numero di casi di una particolare mutazione espresso come

proporzione di cellule o individui nella popolazione.

TASSO DI MUTAZIONE: è la probabilità che si verifichi un particolare tipo di mutazione in

funzione del tempo.

MUTAZIONE SOMATICA: avviene nella cellula somatica. Le caratteristiche mutanti si

manifestano solo nell’individuo in cui è avvenuta la mutazione, ma non vengono trasmesse alle

generazioni successive.

MUTAZIONE GERMINALE: avviene nella cellula germinale. Questa può essere trasmessa alla

progenie attraverso i gameti dando origine ad un individuo mutato sia nelle cellule germinali sia

somatiche. In questo caso viene definita costituzionale perché tutte le cellule dell’organismo

portano appunto la mutazione: la cellula somatica presenta il fenotipo mutato e quella germinale

trasmette la mutazione alla progenie.

TIPI DI MUTAZIONI PUNTIFORMI

1. Mutazioni per sostituzione di una coppia di basi:

a. Transizione: 63% delle sostituzioni. Sostituisce una coppia di basi purina-

pirimidina con un’altra coppia per esempio A-T con C-G.

b. Transversione: 37% delle sostituzioni. Sostituisce una coppia pirimidina-purina

con una purina-pirimidina come C-G con G-C o A-T con C-G.

c. Missenso: è una mutazione nella quale una sostituzione di una coppia di basi nel DNA

causa un cambiamento nel codone dell’mRNA con la conseguenza che il polipeptide

presenta un aminoacido differente.

d. Nonsenso: mutazione nella quale un cambiamento in una coppia di basi altera un

codone di mRNA in un codone di stop dando origine ala terminazione prematura

della catena polipeptidica. Il prodotto polipeptidico rilasciato spesso è non

funzionale.

e. Neutra: sostituzione di una coppia di basi che cambia un codone nell’mRNA, ma non

va a modificare la funzione della proteina. È un tipo di mutazione missenso perché il

codone mutato codifica per un aminoacido diverso che chimicamente equivale a

quello di partenza.

f. Silente: a livello di sequenze non codificanti o in regioni prive di geni, non hanno

effetto sul fenotipo. Possono insorgere per cambiamento di una coppia di basi, ma il

codone alterato dell’mRNA codifica per lo stesso aminoacido nella proteina.

2. Mutazioni per inserzione/delezione: Sono mutazioni che subentrano per aggiunta

(inserzione) o eliminazione (delezione) di una base. In questo modo vengono incorporati

(inserzione) o eliminazione (delezione) di una base. In questo modo vengono incorporati

aminoacidi sbagliati dal punto della mutazione in poi. Questo tipo di mutazioni si chiama

anche frameshift o scivolamento della cornice di lettura e rende non funzionale la proteina.

Si chiama così perché si tratta di un appaiamento scorretto per scivolamento dei due

filamenti durante la replicazione. Quello che succede è che durante la replicazione si ripiega

dove ci sono le sequenze ripetute. Può ripiegarsi il filamento stampo e quindi si parla di

delezione, altrimenti se la protrusione è sul filamento di nuova sintesi si parla di inserzione.

In base ai loro effetti sul fenotipo:

Mutazioni in avanti: cambiamento dal gene selvatico al mutante.

• Mutazioni per reversione: agiscono sul gene mutato nello stesso sito (viene coinvolta la stessa

• coppia di basi) cosicché si ha un cambiamento genotipico da mutante a selvatico.

o Vera reversione: se viene codificato l’aminoacido originale

o Reversione parziale: se l’aminoacido è diverso, ma può restaurare parzialmente o

completamente la funzionalità della proteina.

Mutazione di tipo soppressore: maschera o compensa gli effetti della mutazione, ma non la fa

• revertire. Possono avvenire all’interno del gene di partenza, ma non nello stesso sito e

quindi si parla di soppressori intragenici oppure se avviene in un gene diverso si parla di

soppressori intergenici. I primi agiscono alterando un nucleotide diverso dallo stesso

codone in cui c’è la mutazione o un nucleotide di un codone diverso. Per quanto riguarda i

soppressori intergenici, si ha un gene soppressore che sopprime la mutazione in modo

specifico. Si tratta di geni per tRNA. ​

Soppressione frameshift in un punto

diverso della mutazione in un codone

diverso. Si tratta di una sostituzione di un

nucleotide diverso nello stesso codone

(soppressione intragenica).

soppressore intergenico

ANEMIA FALCIFORME: malattia

genetica a trasmissione autosomico-

recessiva. Deriva da una mutazione allo

stato omozigote che porta al

cambiamento di un aminoacido

nell’emoglobina (mutazione del

gene per la catena beta).

à

Mutazione GAA (glu) GUA

(val). Per presentare la malattia

è necessario essere omozigoti

per l’allele recessivo.

MUTAZIONI SPONTANEE:

Tutti i tipi di mutazioni

puntiformi possono avvenire

spontaneamente. Una

mutazione spontanea può

avvenire durante la replicazione

del DNA o in fase G1/G2 del ciclo cellulare. Nell’uomo/eucarioti il tasso di mutazione spontanea di

un gene è 10 alla meno 4 – 10 alla meno 6 per gene per generazione. Nei batteri/fagi il tasso di

mutazione spontanea di un gene è 10 alla meno 5 – 10 alla meno 7 per gene per generazione. Il

tasso di mutazione è influenzato dalla costituzione genetica dell’organismo, è riferito alle mutazioni

non corrette dai sistemi di riparo del DNA. Possono avvenire anche per cambiamenti chimici

spontanei oltre che errori nella replicazione.

Cause:

Errori durante la replicazione

• o Appaiamento vacillante delle basi: ogni base può esistere in stati alternativi detti

tautomeri, quando una base cambia stato si dice che ha cambiato forma tautomerica.

Nel DNA la forma usuale è quella chetonica che è responsabile del normale

appaiamento. Se la base si trova in forma tautomerica errata che prende il nome di

enolica o chetoenolica si ha un appaiamento errato.

o Scivolamento e misappaiamento in sequenze ripetute: avvengono generalmente in

regioni che presentano sequenze ripetute dove il filamento si può avvolgere in modo

anomalo. Se l’avvolgimento avviene sul filamento stampo si parla di delezione (la

DNApol salta la o le basi coinvolte), se coinvolge il filamento di nuova sintesi si

parla di inserzione. Se avvengono sul filamento di un gene strutturale si parla di

mutazioni frameshift.

Cambiamenti chimici spontanei del DNA I più comuni eventi chimici che si realizzano sulle

• basi sono la depurinazione e la deamminazione.

o Nella depurinazione una purina viene persa per rottura del legame con il

desossiribosio, pertanto si genera un sito apurinico. Normalmente in un mammifero

vengono perse molte purine, ma interviene un meccanismo che ripara. Se non viene

ripristinata la base, manca lo stampo e si ha un buco, quindi la DNApol si arresta o si

dissocia dal DNA. Ci sono meccanismi che possono riparare in modo fedele tipo la

DNA polimerasi, dopo ci sono altri meccanismi che sono in grado di risolvere i

mismatch se la DNA polimerasi non interviene in modo corretto. Ci sono altri

meccanismi che riparano inserendo una base a caso, si ha una mutazione del tipo

sostituzione, ma la cellula non muore.

o Per quanto riguarda la deaminazione si ha la rimozione di un gruppo amminico da

una base. Quando la citosina perde un gruppo amminico si ha un uracile, se la base

(che viene riconosciuta come estranea) non viene rimossa, si appaia con l’adenina.

Questo si chiama deaminazione e prevede la transizione da C-G a T-A. Il DNA degli

m

eucarioti contiene una piccola quantità della base modificata 5-metilcitosina (5 C).

Se la deaminazione coinvolge il carbonio 5 di una citosina metilata si ha la

transizione da citosina a timina, ma la timina non viene riconosciuta come estranea e

rimossa dal DNA. Se la timina rimane nell’elica stampo si inserirà un’adenina e non

m

una guanina per complementarietà. I punti del genoma dove si trovano 5 C vengono

chiamati punti caldi mutazionali o hot spots. Geni housekeeping sono espressi in

tutte le cellule. Il 30% delle mutazioni avviene proprio in queste regioni.

Cambiamenti chimici spontanei delle basi. Ci sono meccanismi chiamati epigenetici che sono in

grado di regolare un gene modificando le basi. MUTAZIONI INDOTTE

Possono essere indotte da

mutageni fisici:

Raggi UV: questi interagiscono con

• la molecola di DNA e la possono

danneggiare. Si fermano a colpire

le cellule epidermiche. Le basi del

DNA assorbono lunghezze d’onda

con spettro UV (250-260 nm). Uno

degli effetti frequenti è la

formazione di legami anormali tra

pirimidine adiacenti (spesso

timine). Questi appaiamenti fanno

in modo che sia difficoltoso il

legame con l’A e che la

replicazione non riesca a procedere

oltre la lesione (se i dimeri di T non

vengono riparati si ha morte della

cellula). Gli UV a bassa energia

sono poco penetranti quindi

lesionano i tessuti epidermici.

Raggi X: sono ionizzanti, molto più

• dannosi, tutti i tipi di radiazioni

ionizzanti portano ad una

mutazione. Non si

fermano alle cellule

epidermiche, ma possono

penetrare. Producono ioni

e radicali liberi che

rompono i legami chimici

(rompono i legami

covalenti, inclusi quelli

zucchero-fosfato dello

scheletro del DNA) e

possono interagire con il

DNA o altre molecole

biologiche. Possono rompere i cromosomi

(mutazioni cromosomiche) oppure causare

mutazioni geniche o puntiformi. Individuo colpito

da raggi X ad alta energia muore, mentre se si è

colpiti da raggi X a bassa energia si possono avere mutazioni puntiformi. C’è

una relazione tra la dose di

esposizione e la frequenza

della mutazione. Le

radiazioni ionizzanti hanno

effetto cumulativo

Possono essere indotte da

mutageni chimici:

Analoghi delle basi: molecole

• che assomigliano alle basi e

le sostituiscono. L’analogo

delle basi si appaia con una

diversa base normale del

DNA. Un mutageno analogo delle basi è il 5-bromouracile (5BU) che ha un residuo di

bromo al posto del gruppo metilico della timina. Nel suo stato raro il 5BU si appaia con la

guanina (il 5BU induce mutazioni perché può cambiare forma tautomerica una volta

incorporato nel DNA). Non tutti gli analoghi sono mutageni; ad esempio l’AZT

(azidotimina) è un analogo della timina, ma non è mutageno. Questo farmaco è usato per la

cura dei pazienti che hanno contratto l’AIDS. L’incorporazione di AZT blocca

l’allungamento del DNA prodotto da trascrittasi inversa. Il virus HIV è, infatti, un retrovirus

(genoma a RNA). Quando entra nella cellula l’RNA viene copiato a DNA grazie all’enzima

trascrittasi inversa (il DNA prodotto da RNA dalla trascrittasi prende il nome di DNA

complementare o cDNA). L’AZT non è un buon substrato per la DNApol eucariota.

Modificatori delle basi: modificano la struttura delle basi (sostituzione). Si tratta di molecole

• che agiscono come mutageni modificando direttamente la struttura chimica e le proprietà

delle basi. Questi agiscono su gruppi amminici, introducono gruppi idrossilici o gruppi

alchilici.

Agenti intercalanti: si inseriscono tra le basi del DNA, dilatano l’elica stampo e portano a

• introdurre una base a caso. Alcuni di questi agenti sono la proflavina, l’acridina e il bromuro

d’etidio che si inseriscono tra le basi adiacenti in uno o entrambi i filamenti causando un

rilassamento dell’elica. Se l’intercalante si inserisce in un filamento stampo, nel nuovo

filamento verrà inserita una base in più e si parla di inserzione; se l’intercalante si inserisce

al posto di una base del filamento neosintetizzato, si avrà una delezione di una coppia di

basi.

MECCANISMI DI RIPARAZIONE DEL DNA:

o RIPARAZIONE DIRETTA:

o riparazione conseguente all’attività di correzione di bozze della DNApol. Attività

esonucleasica di correzione di bozze in direzione 3’à5’.

o Riparazione dei dimeri di timina prodotti da UV tramite fotoriattivazione o

riparazione mediante luce grazie ad un enzima chiamato fotoliasi che scinde il

dimero attivato da un fotone di luce.

o Riparazione dei danni da alchilazione per rimozione del gruppo metilico tramite

enzima metiltransferasi.

o RIPARAZIONE PER EXCISIONE: molte lezioni interessano solo un filamento quindi

l’altro può essere usato come stampo.

o Riparazione per escissione di nucleotidi: questo sistema richiede quattro proteine

(UvrA, UvrB, UvrC, UvrD) codificate dai geni uvrA, uvrB, uvrC, uvrD. Un

complesso formato da due proteine UvrA e una UvrB scorre lungo il DNA, quando

riconosce un dimero di pirimidina altre distorsioni del DNA, le subunità UvrA si

dissociano e UvrC si lega a UvrB nella sede della lesione. Il complesso UvrBC opera

due tagli: uno quattro nucleotidi dopo l’errore in direzione 3’ e uno 7 nucleotidi

prima in direzione 5’. UvrB viene rilasciata e UvrD si lega al taglio 5’ (questa

proteina è un’elicasi che svolge la regione tra i tagli, rilasciando un corto segmento a

singolo filamento). La DNApol riempie la regione mancante e la ligasi salda il

filamento.

o Riparazione degli errori di appaiamento diretta dalla metilazione: riconosce gli

appaiamenti errati sfuggiti alla DNApol, elimina le basi appaiate scorrettamente e

procede con la sintesi-riparativa. In E. coli sono coinvolti tre geni che sono mutH,

mutL, mutS. La proteina codificata da mutS (MutS) si lega alle basi appaiate in

modo sbagliato. MutS forma un complesso con le altre due proteine in modo da

portare la sequenza GATC non metilata vicino all’appaiamento errato. MutH taglia il

filamento di DNA non metilato, viene eliminato l’appaiamento errato da

un’esonucleasi e la discontinuità riparata dalla DNApol e dalla ligasi. Nell’uomo

avviene ad opera di quattro geni hMSH2, hMLH1, hPMS1, hPML2.

o Sintesi translesionale del DNA e risposta SOS: identifica i “buchi” nell’elica che

rappresentano un danno letale, i “buchi” vengono riempiti da basi andando incontro

a mutazioni. Il sistema SOS è costituito da due geni lexA e recA. La proteina LexA

legata al DNA reprime la trascrizione di 17 geni implicati nella riparazione del

DNA. In prossimità del danno viene attivata la proteina RecA, la quale stimola LexA

ad autoscindersi che a sua volta elimina la repressione dei geni per la riparazione.

Questi 17 geni vengono espressi e si ha la riparazione del DNA. Una volta riparato il

danno RecA si inattiva e LexA attiva reprime i geni per la riparazione.

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI

I geni che codificano per proteine coinvolte nello stesso processo metabolico sono di solito disposti

uno adiacente all’altro e vengono trascritto in un mRNA policistronico o poligenico. La regolazione

di questo mRNA dipende dall’interazione tra sequenze regolatrici e proteine regolatrici che si

trovano adiacenti alla sequenza di geni. I geni trascritti insieme e le sequenze regolatrici prendono il

nome di operoni.

Geni costitutivi: geni che codificano per proteine essenziali per la vita della cellula, sono geni

sempre attivi, sono chiamati housekeeping.

Geni regolati: geni la cui espressione è condizionata a seconda delle necessità, l’espressione dei

geni è regolata. Ci sono meccanismi che regolano se un gene venga attivato o meno a seconda della

necessità della cellula.

Nel caso di induzione di geni che vengono espressi se mancano alcuni nutrienti (es alcuni

amminoacidi essenziali) sono presenti dei fattori che si chiamano induttori che vanno a regolare il

fattore trascrizionale e quindi l’espressione di alcuni geni.

Operone lattosio: operone inducibile

L’aggiunta di una molecola di lattosio al terreno di

crescita dei batteri attiva l’espressione di specifici

geni chiamati inducibili. La molecola che

determina l’attivazione di questi si chiama

induttore che appartiene alla classe degli effettori.

Se il lattosio non è presente, non è presente

nemmeno l’allolattosio che è il suo isomero, gli

enzimi non vengono espressi e l’operone è inattivo.

Questi operoni prendono il nome di inducibili

perché si attivano solo in presenza di quella fonte di

carbonio, altrimenti rimangono inattivi.

carbonio, altrimenti rimangono inattivi.

L’evento regolativo di solito coinvolge un induttore

e una proteina regolatrice.

L’operone lattosio è

un gruppo di geni la

cui espressione è

guidata da un

singolo promotore e

da interazione della

proteina regolatrice

con il sito operatore.

Il singolo promotore consente la trascrizione di tutti e tre i geni su un’unica molecola di RNA. I

geni dell’operone in presenza dell’allolattosio vengono trascritti simultaneamente, si parla quindi di

induzione coordinata (hanno un sito regolatore e un sito promotore comune). I prodotti genici

devono essere sintetizzati in proporzioni simili perché la metabolizzazione possa avvenire

efficientemente. LacI codifica per una proteina repressore ed è regolato indipendentemente

dall’operone lattosio. Se subentrano delle mutazioni non senso polari vengono prodotti 1 o 2

enzimi in base alla posizione in cui si ha la mutazione. Ad esempio se si ha una mutazione

nonsenso sul gene lacZ viene rilasciata una proteina beta-galattosidasi incompleta, inoltre i

ribosomi non scivolano oltre a quel punto quindi non viene prodotta permeasi e nemmeno

transacetilasi.

LacI produce il repressore che ha un’alta affinità per il sito operatore e rimane attaccato al sito

operatore. Quindi anche se si lega la RNApol, la trascrizione non inizia. La molecola allolattosio ha

un’alta affinità per il repressore. L’allolattosio lega la molecola proteica del repressore facendolo

cambiare di conformazione in modo che non possa più legarsi al sito operatore. A questo punto la

RNApol può legarsi all’operatore e far iniziare la trascrizione. È l’allolattosio che ha alta affinità

per il repressore, non il lattosio.

Escherichia coli cresce in terreno minimo nella quale ci deve essere almeno uno zucchero semplice

(glucosio), altrimenti viene fornito lattosio e devono quindi essere espressi enzimi per il

metabolismo del lattosio tra cui:

Beta-galattosidasi: scinde il lattosio in glucosio e galattosio e isomerizza il lattosio ad

• allolattosio, un compost importante nella regolazione dell’espressione dei geni dell’operone

lac.

Lattosio permeasi: si trova nella membrana plasmatica di E. coli e serve per il trasporto attivo

• del lattosio all’interno della cellula.

del lattosio all’interno della cellula.

Transacetilasi: enzima che trasferisce un gruppo acetilico dell’acetil-CoA ai beta-galattosidi.

Struttura operone Lac Il gene per la beta-

galattosidasi

vengono chiamato

lacZ, quello per la

permeasi lacY e

quello per la

transacetasi lacA.

Gli esperimenti

mostrano che i tre

geni sono

strettamente

associati in

quest’ordine.

Questi tre geni

contigui vengono

trascritti in una singola molecola di mRNA policistronico, l’RNApol inizia la trascrizione da un

singolo promotore.

In E. coli selvatico, i prodotti dei tre geni vengono indotti in modo coordinato quando è presente il

lattosio. LacO è una regione che si trova a monte del gene lacZ e prende il nome di operatore. LacI

prende il nome di gene per il repressore lac perché codifica per il repressore. L’OPERONE LAC È

COSTITUITO DA PROMOTORE-OPERATORE-lacZ-lacY-lacA mentre il gene lacI è localizzato

vicino ai geni strutturali, a monte del promotore.

REPRESSIONE OPERONE LAC: EFFETTO GLUCOSIO

È presente anche un sistema di regolazione positiva quando è presente il lattosio, ma è assente il

glucosio. È un sistema che assicura che l’operone lac sia espresso ad alti livelli solo se il lattosio è

l’unica fonte di carbonio. Innanzitutto una proteina chiamata CAP (catabolite activator protein) si

lega al cAMP a formare un complesso CAP-cAMP. Questo complesso si lega ad un sito specifico

(sito CAP) posto a monte del sito promotore a cui si lega l’RNApol per iniziare la trascrizione. Il

sito di legame per l’RNA polimerasi viene destabilizzato e ciò permette l’attacco della polimerasi.

Quando è presente glucosio oltre al lattosio, esso viene utilizzato per un fenomeno definito

repressione da cataboliti o effetto glucosio. La presenza di glucosio riduce il livello cellulare di

AMP ciclico quindi il complesso risulta in quantità insufficiente a permettere all’RNApol di legarsi

al promotore anche se il repressore viene rimosso dalla presenza dell’allolattosio.

Operone triptofano: operone reprimibile

È attivo quando il triptofano manca, è un operone reprimibile (biosintesi). Si tratta di un operone

specifico che permette di sintetizzare gli aminoacidi che mancano nel terreno, vi è una repressione

dell’attività genica quando viene aggiunta una sostanza. Operone reprimibile sta a indicare

quell’operone per le vie anaboliche di biosintesi che in generale è spento (represso) quando il

prodotto finale è presente.

Struttura operone

trp

L’operone trp è

costituito da 5 geni

strutturali (A-E) al

posto di 3 del lac.

Il promotore e

l’operatore sono a

l’operatore sono a

monte del gene

trpE. Tra la regione

promotore-

operatore e trpE

c’è una regione

chiamata trpL

(regione leader)

che al suo interno

ospita un sito

attenuatore (att).

Come nel caso

dell’operone lac,

anche qua c’è un

gene regolatore che

produce una proteina aporepressore.

Espressione dell’operone trp in presenza di triptofano: Il gene regolatore trpR produce una

• proteina chiamata aporepressore (repressore inattivo incapace di legarsi da solo

all’operatore). Il triptofano presente si lega all’aporepressore, gli fa cambiare la

conformazione e lo rende attivo in modo tale da farlo legare all’operatore e impedire la

trascrizione.

Espressione dell’operone trp in presenza di basse concentrazioni di triptofano: esiste un altro

• meccanismo che fa regolare i livelli di trp in modo più fine, quando si ha trp a bassi livelli o

manca del tutto. Ci sono dei meccanismi che controllano l’entità dei trascritti completi, i

trascritti brevi vengono terminati da un processo che prende il nome di attenuazione. Quindi

se il trp è presente in basse quantità vengono espressi i geni in modo più fine, a basso

livello. La regolazione attraverso regione leader (trpL) in corrispondenza del sito attenuatore

dove viene troncata la trascrizione. ATTENUAZIONE: riduce il trascritto dell’operone da 8

a 10 volte. REPRESSIONE: riduce il trascritto dell’operone di 70 volte. Nell’mRNA del

peptide leader vi sono 4 regioni che possono ripiegarsi e formare strutture secondarie per

appaiamento di basi complementari. L’appaiamento della regione 1 e 2 da luogo a un

segnale di pausa della trascrizione, mentre l’appaiamento di 3 e 4 indica un segnale di

terminazione e l’appaiamento di 2 e 3 è un segnale di antiterminazione. In assenza di

triptofano (ribosoma occupa la regione 1) la regione 2 e 3 si appaiano facendo sì che la 3

non possa appaiarsi con la 4 permettendo all’RNApol di proseguire oltre l’attenuatore e

continuare la trascrizione dei geni strutturali. Se il triptofano è presente il ribosoma può

tradurre i codoni Trp e continuare fino al codone di terminazione del peptide leader

(ribosoma occupa la regione 2) quindi la 3 si può appaiare con la 4 (struttura 3-4 è il segnale

di terminazione e viene chiamata attenuatore).

La sintesi

di trp viene

attenuata

anche da

un

meccanismo di inibizione a feedback o di retroinibizione: il prodotto finale (trp) viene riconosciuto

dal primo enzima della catena biosintetica.

Riassunto breve operone trp:

• Trp presente attiva l’apoproteina repressoreà si lega all’operatore e reprime la trascrizione

• Trp presente a bassi livellià traduzione trascritto leader: formazione strutture secondarie

à à

dell’mRNA produzione di trascritti lunghi attenuazione per il livello di tRNA

carico/scarico

à

• Trp presente cambiamento allosterico primo enzima della catena: inattivazione a feedback

àveloce

• Emivita breve dell’mRNA turn over della molecolaà se c’è trp viene attenuata la

trascrizione anche perché l’mRNA nella cellula viene degradato.

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI

Le somiglianze a livello di regolazione genica tra procarioti ed eucarioti sono a livello di sequenze

promotrici variabili che determinano l’inizio della trascrizione, sequenze regolatrici che

determinano la risposta del gene a molecole effettrici e proteine di regolazione (sia attivatori, sia

repressori) che interagiscono con le sequenze regolatrici per il controllo della trascrizione. La

quantità complessiva di DNA che costituisce il genoma aploide di una specie viene indicato con C

espresso in coppie di basi (bp).

Batteri: presentano geni senza interruzioni.

• Lieviti: (eucarioti primordiali) iniziano a presentare piccole interruzioni. Hanno il 95% di geni

• con un esone.

Drosofila: la maggior parte dei geni inizia a presentare esoni ed introni. Inizia ad avere geni

• molto complessi con 40 esoni.

Uomo: aumenta il livello di complessità, geni sempre più distanti e più grandi e complessi per

• la presenza di esoni ed introni.

I mammiferi sono gli organismi più evoluti e complessi. Ci sono anfibi anche molto complessi che

hanno genoma maggiore di 10 alla 9. L’uomo ha quantità di genoma aploide 3x10 alla 6 kilobasi.

Hanno geni molto complessi con molti esoni che presentano delle proteine con delle funzioni

particolari per l’evoluzione.

Le sequenze uniche sono sequenze presenti nel genoma aploide come singole copie. Sono geni che

codificano per proteine (nell’uomo rappresentano il 55-60% del genoma circa). Poi ci sono

sequenze che si ripetono all’interno del genoma e costituiscono il DNA ripetuto che si divide in

3 6

moderatamente ripetuto (da poche fino a 10 copie) e altamente ripetuto (fino a 10 copie). Nei

procarioti (tranne i geni per rRNA e tRNA) tutto il genoma è presente in sequenze uniche. Negli

eucarioti invece sono presenti sia le sequenze uniche, sia quelle ripetute.

Dna ripetuto:

Moderatamente ripetuto:

• o Ripetuto in tandem ovvero sequenze ripetute una di fila all’altra (geni rRNA, tRNA e

famiglie geniche come i geni per l’emoglobina).

o Ripetute sparse: famiglie multigeniche (istoni).

Altamente ripetuto:

• o Ripetuto in tandem: ha una diversa densità che è un diverso contenuto in CG quindi

possono essere separati su centrifugazioni su gradiente di densità (DNA satellite).

Dna associato ai centromeri e ai telomeri.

o Ripetute sparse: si possono trovare anche negli introni. Si riconoscono due tipi di

sequenze disperse: SINE (short interspread repeated sequences) e LINE (long

interspread repeated sequences). Le sequenze SINE sono lunghe da 100 a 400 bp,

interspread repeated sequences). Le sequenze SINE sono lunghe da 100 a 400 bp,

mentre le LINE sono più lunghe: 1000-7000 bp. Tutti gli eucarioti hanno sia le LINE

sia le SINE, l’uomo e le rane prevalentemente SINE, Drosophila e gli uccelli le

LINE.

ORIGINE DNA RIPETUTO:

DNA RIPETUTO IN TANDEM: espansione della sequenza progenitrice per slittamento

• durante la replicazione: unità ripetuta da una a poche centinaia di basi. Sono disposte una

dopo l’altra nel genoma in un’organizzazione testa-coda. I geni per rRNA sono geni ripetuti

in tandem spesso organizzati in raggruppamenti (cluster). La quantità di DNA ripetuto in

tandem è associato ai centromeri e ai telomeri. In ogni centromero si trovano migliaia di

corte sequenze ripetute in tandem.

DNA RIPETUTO DISPERSO:

• à à à à

o Retrotrasposizione: (trascrizione RNA retrotrascrizione DNA integrazione nel

genoma). Le LINE-SINE (SINE nell’uomo soprattutto). Tra le famiglie SINE ben

studiate c’è la famiglia Alu che consiste di sequenze di 200-300 bp ripetute fino ad

un milione di volte (9% del DNA aploide). Anche le SINE sono trasposoni, ma non

codificano per enzimi necessari al loro movimento, si possono muovere se gli enzimi

vengono forniti da qualche famiglia LINE attiva.

o Trasposoni a DNA: i trasposoni sono segmenti di DNA che si possono spostare da un

posto all’altro del genoma e che codificano per enzimi necessari al loro stesso

movimento.

▪ à

Copiatura da sito originario integrazione in un nuovo sito.

▪ à

Excisione reintegrazione in un nuovo sito.

La differenza fondamentale tra le sequenze moderatamente ripetute e altamente ripetute è che le

seconde sono per la maggior parte sequenze non codificanti, hanno soprattutto funzione strutturale.

Famiglie geniche sono famiglie di geni che derivano tutte dallo stesso gene ancestrale quindi

svolgono la stessa funzione, al massimo con piccole differenze.

MAPPE FISICHE:

Le mappe fisiche si basano su distanze molecolari (coppie di basi) a differenza delle mappe

genetiche che si basano sulla frequenza di ricombinazione che non è sempre proporzionale alle

distanze molecolari. Prime mappe fisiche eucariotiche ottenute dallo studio di cromosomi

politenici. Questi sono cromosomi particolari presenti in alcuni tessuti come le ghiandole salivari in

Drosophila, sono costituiti da un fascio di cromatidi che derivano da cicli ripetuti di duplicazioni

(anche 1000) senza divisioni cellulari. In ogni cromosoma politenico, i due cromosomi omologhi

sono strettamente appaiati; quindi è ridotto alla metà del numero diploide di cromosomi. Sono uniti

a livello dei centromeri in una struttura chiamata cromocentro. I cromosomi interfasici sono visibili

dopo la colorazione anche in interfase a microscopio. Nei 4 cromosomi politenici di Drosophila

possono essere osservate più di 5000 bande ognuna contenente 30000 bp e da 1 a 3 geni.

Alcuni geni sono più spiralizzati e assumono una colorazione più intensa, altri geni sono

despiralizzati e assumono una colorazione meno intensa. I cromosomi assumono colorazione a

bande a seconda del grado di compattezza in interfase. Una banda in più in meno indica una

mutazione cromosomica, si fa il mappaggio del gene in corrispondenza di quella banda se si

osserva una variazione fenotipica. MAPPE FISICHE

La costruzione di mappe

fisiche si basa sulla

possibilità di stabilire una

distanza reale tra due loci

-ASSEGNAZIONE DI GENI A CROMOSOMI

-ASSEGNAZIONE DI GENI A REGIONI SUBCROMOSOMICHE

Prima mappa fisica del genoma umano: mappa citogenetica su cromosomi metafasici. Si prende

6

come riferimento la banda citogenetica (6x10 pb), i loci vengono riferiti alle bande citogenetiche.

Unità di mappa = paia di basi = unità di misura delle mappe fisiche

Misura sempre più precisa con l’affinarsi delle tecniche di mappaggio fisico: aumenta la risoluzione

di mappe fisiche. à

Mappa fisica a più alta risoluzione sequenza di una regione genomica: è possibile contare le basi

tra un locus genico e l’altro.

MAPPE GENICHE

La costruzione di mappe genetiche si basa sulla possibilità che due loci vengano separati dalla

ricombinazione meiotica.

La proporzione di figli ricombinanti tra i loci A e B corrisponde alla frazione di ricombinazione tra

A e B e questo indica la misura della distanza genetica: più alta e la frazione di ricombinanti,

maggiore è la distanza genetica.

Unità di mappa= u = cM (centimorgan)

La frequenza di ricombinazione lungo il cromosoma non è omogenea: è maggiore verso i telomeri e

minore verso i centromeri.

CARIOTIPO

I cromosomi sono visibili durante la metafase (fase in cui si trovano maggiormente condensati) il

che li rende facilmente osservabili dopo la colorazione. Un Insieme completo dei cromosomi

metafasici in una specie viene definito cariotipo. Il cariotipo è specie-specifico, infatti negli

organismi eucarioti è osservabile un’ampia gamma di numeri, dimensioni e forma dei cromosomi.

Cariotipo normale: 22 copie di autosomi più due cromosomi sessuali (XX o XY), se si osservano

delle variazioni al cariotipo si hanno mutazioni cromosomiche numeriche. Per quanto riguarda le

mutazioni cromosomiche strutturali si osservano cambiamenti della struttura rispetto al cromosoma

normale.

I cromosomi vengono disposti in ordine decrescente in base alla dimensione e alla posizione del

centromero accoppiando gli omologhi (eccezione per il cromosoma 21 che è più piccolo del 22).

Metacentrico: ha il centromero localizzato al centro

• che risulta diviso in due bracci di stessa lunghezza.

Submetacentrico: hanno un braccio più lungo

• dell’altro.

Acrocentrico: mostrano un braccio con un breve

• appendice che spesso mostra un rigonfiamento

(satellite).

Telocentrico: hanno soltanto un braccio perché il

• centromero non è situato all’estremità.

centromero non è situato all’estremità.

Quello che sta sopra il centromero viene chiamato braccio p, quello che sta sotto è il braccio q. Nei

cromosomi acrocentrici non c’è DNA codificante nei bracci p. Nell’uomo si trovano i metacentrici,

i sub-metacentrici e gli acrocentrici, ma non ci sono i telocentrici che sono specifici nel topo.

Nell’ambito del cariotipo umano si trovano dei gruppi che vanno dalla A alla G (gruppi con

morfologia simile). All’interno dei cromatidi fratelli si ha la stessa sequenza quindi lo stesso allele.

Colorazione

Se coloro i cromosomi con colorante acidofilo ottengo colorazione omogenea perché tutto il DNA è

compresso, è tutto condensato per minimizzare rotture di DNA durante la formazione di cromosomi

in metafase. Si usa il colorante GIEMSA che colora i cromosomi omogeneamente in viola. Il

problema è che risulta difficile riconoscere i cromosomi e ordinarli in modo corretto. I citogenetisti

per cercare di identificare meglio i cromosomi hanno messo a punto delle tecniche specifiche che

permettono di ottenere determinate bande codificate come bande dei cromosomi politenici. È stato

quindi possibile suddividere i cromosomi in determinate regioni (a colorazione più debole e altre a

colorazione più intensa) e quindi ottenere sempre quel numero di bande tali per essere identificati. I

bandeggi sono specifici per ogni cromosoma e questo permette di identificare univocamente ogni

cromosoma del cariotipo. Uno dei bandeggi più usati è il bandeggio G: si ottiene trattando i

cromosomi metafasici con enzimi proteolitici (enzimi che digeriscono le proteine) che intaccano

alcune proteine del cromosoma. In seguito si colora con colorante GIEMSA per produrre delle

bande scure chiamate bande G.

Il bandeggio Q è più veloce da fare, ma meno preciso quindi si preferisce usare il bandeggio G. Nel

bandeggio Q i cromosomi vengono colorati con Quinacrina che è un colorante che si lega a regioni

ricche di AT. Le bande Q sono chiare e si possono visualizzare con il microscopio a fluorescenza.

Colorazione GIEMSA

(omogenea)

Nel cromosoma, la regione a contatto con il centromero è privo di nucleosomi. È la regione che va

a formare il centromero e contiene proteine che danno origine al cinetocore a cui si attaccano le

fibre del fuso. Un’alterazione a livello delle proteine del fuso non permettono di attaccarsi al fuso e

si hanno gameti sbilanciati.

Per quanto riguarda gli autosomi, un’anomalia compatibile con la vita è la sindrome di Down o

trisomia del cromosoma 21. à

ERRORE DI FUNZIONAMENTO CENTROMERO non disgiunzione: nell’uomo sono vitali

solo quelle legate all’X, Y e al cromosoma 13,18,21. Bambini che nascono con la trisomia del 13 o

18 muoiono dopo poco. Se manca il centromero si ha un cromosoma acentrico che viene perso.

TELOMERO

Regione all’estremità di un cromosoma eucariote che è lineare. Se si rompe, rende il cromosoma

aberrante ovvero instabile. Tutti i telomeri sono costituiti da estremità che si ripetono in tandem

(sequenze telomeriche semplici) e che sono importanti per la stabilità del cromosoma e altre vicino

alle estremità che sono costituite da sequenze di DNA ripetute e complesse.

MUTAZIONI CROMOSOMICHE

MUTAZIONI CROMOSOMICHE

Sono variazioni rispetto alla normale situazione della struttura o del numero di cromosomi. Il

numero cromosomico e l’organizzazione dei geni sui cromosomi vengono mantenuti in tutte le

cellule degli organismi nell’ambito di una medesima specie; se vengono variati si va incontro ad

una mutazione cromosomica. Se viene evidenziato un cambiamento del numero di cromosomi si ha

una mutazione cromosomica numerica; se l’analisi del cariotipo mostra un cambiamento della

struttura rispetto ad un cromosoma normale si parla di mutazione cromosomica strutturale.

Mutazioni cromosomiche:

- 50% degli aborti spontanei. 1/7 fecondazioni è un aborto spontaneo.

- 6/1000 nati vivi

- 15% dei concepimenti

- 11% dei maschi con problemi di fertilità porta una mutazione cromosomica

- 6% degli affetti da ritardo mentale hanno mutazione cromosomica.

MUTAZIONI CROMOSOMICHE STRUTTURALI

Possono essere indotte da radiazioni ionizzanti, virus, sostanze chimiche o errori di ricombinazione.

Possono essere delezione, duplicazione, inversione, traslocazione.

Delezioni

Perdita di materiale cromosomico (ipodosaggio genico). Una

delezione è prodotta da rotture nei cromosomi, le rotture possono

essere indotte da temperatura, radiazioni, virus, sostanze

chimiche o agenti trasponibili. Negli organismi diploidi, un

individuo eterozigote per una delezione può essere normale. La

delezione di un allele dominante in un eterozigote ha come

conseguenza la manifestazione del fenotipo recessivo

(pseudodominanza). Se la delezione implica la perdita del

centromero, il risultato è la perdita del cromosoma durante la

meiosi che può avere conseguenze molto gravi. Le delezioni

possono essere utilizzate per determinare la localizzazione fisica

di un gene su un cromosoma quindi sono un metodo di

mappatura fisica. Normalmente gli omozigoti per delezione

muoiono, mentre le anomalie sono presenti negli eterozigoti.

Una malattia umana determinata da delezione è la sindrome del

cri-du-chat dovuta a una delezione di una parte del braccio corto

del cromosoma 5. I bambini affetti hanno ritardo mentale, pianto

simile al miagolio di un gatto e altre anomalie fisiche. Delezione

5p 15.2 pter (vedi immagine a lato).

Duplicazioni

eccesso di materiale cromosomico (iperdosaggio genico). Consiste nel raddoppiamento di un tratto

di cromosoma. Quando la mutazione genera segmenti duplicati adiacenti l’un l’altro (si conserva

l’ordine dei geni) si ha duplicazione in tandem invertita, se sono disposti all’estremità di un

cromosoma si ha duplicazione in tandem terminale. Ci sono geni che se si trovano in iperdosaggio

portano a dei cambiamenti fenotipici e svolgono un ruolo chiave nell’evoluzione delle famiglie

geniche. Nel genoma si trovano regioni duplicate che hanno portato a vantaggi. EMOGLOBINAà i

geni globinici sono derivati da mutazioni da duplicazione. Geni per alfa-beta-globina sono derivati

da un gene ancestrale

duplicato. Se si ha una

mutazione vantaggiosa,

questa si fissa nella specie. Se

invece la duplicazione è

deleteria, solitamente non

importa perché c’è l’altra

copia non mutata. I geni

globinici sono tutti regolati

da un’unica regione di

controllo chiamata LCR.

Pseudogeni: sono molto

simili ai geni funzionali, ma

hanno delle mutazioni che

fanno cambiare la loro

fanno cambiare la loro

funzione. Hanno fissato delle

mutazioni negative. Sono una

traccia dell’accumulo di

mutazioni. Esempio: varianti funzionali delle globine,

queste globine hanno affinità diversa per l’ossigeno e

queste vengono espresse ed utilizzate nei vari stadi di

sviluppo in base all’esigenza di legare o rilasciare

ossigeno.

Inversioni

Mutazione in cui il cromosoma viene escisso, fa una

rotazione di 180 gradi e viene reintegrato nel

cromosoma (rottura in due punti). Si possono avere

due tipi di inversioni: inversione paracentrica (non

comprende il centromero) e inversione pericentrica

(comprende il centromero). Non ci sono grosse

perdite di materiale genetico, ci possono essere

conseguenze fenotipiche nel caso in cui i punti di

rottura sono all’interno di un gene o entro regioni che

regolano l’espressione di un gene. Se l’inversione è in

omozigosi la meiosi è normale, se l’inversione è in

eterozigosi si verificano gravi conseguenze se il C.O.

avviene all’interno dell’inversione.

o Inversione paracentrica: Durante la

prima anafase meiotica i due

centromeri migrano ai poli opposti

della cellula e, a causa del C.O, un

cromatidio ricombinante migra con

formazione di un ponte dicentrico;

vale a dire un cromosoma con due

centromeri (cromosoma dicentrico). Il

ponte dicentrico andrà incontro a

rottura. L’altro prodotto ricombinante

è un cromosoma senza centromero (cromosoma acentrico) che viene genericamente

perduto perché incapace di proseguire la meiosi. Nella seconda meiosi ogni cellula

figlia riceve una copia di ciascun cromosoma. Due gameti sono vitali (quello con la

sequenza di geni normali e quello con il segmento invertito), gli altri due non sono

vitali perché sono sbilanciati. Solo i gameti che non sono coinvolti nell’evento di

C.O sono quelli che possono dare origine ad una progenie vitale. Alcuni eventi di

C.O entro un’ansa di inversione producono gameti vitali: esempio un evento di

doppio C.O sullo stesso cromatidio.

o Inversione pericentrica: il risultato sono due gameti vitali con i cromosomi non

ricombinante (normale) e con inversione e due gameti ricombinanti non vitali

ciascuno con delezione di alcuni geni e duplicazione di altri.

Traslocazione

una mutazione in conseguenza della quale vi è un cambiamento della posizione e quindi diversa

localizzazione nel genoma di segmenti cromosomici e delle sequenze geniche contenute. Si ha la

rottura in un punto del cromosoma, questo pezzo trasloca su un altro cromosoma o sullo stesso da

altre parti. Non vi sono né aumento né perdita di materiale genetico. Se cambia di posizione

all’interno dello stesso cromosoma (traslocazione intracromosomica non-reciproca), se il segmento

cromosomico va in un altro cromosoma (traslocazione non-reciproca), se c’è scambio di segmenti

tra due cromosomi (traslocazione intercromosomica reciproca).

Nei ceppi omozigoti per una traslocazione reciproca la meiosi avviene normalmente. Nei ceppi

eterozigoti, invece, le diverse parti dei cromosomi omologhi si appaiano come meglio possono. Si

ha un assetto di cromosomi traslocati e un assetto di cromosomi normali. Il risultato è una

configurazione a croce nella profase della meiosi I. La segregazione all’anafase I può avvenire in

tre mod diversi:

- Segregazione alternata: i centromeri migrano allo stesso polo in modo alternato generando due

gameti vitali (uno con cromosomi normali e uno traslocati).

- Segregazione adiacente-1: centromeri adiacenti non omologhi migrano alo stesso polo con

produzione di due gameti che contengono delezioni e duplicazioni geniche e spesso sono

non vitali.

- Segregazione adiacente-2: coppie diverse di centromeri adiacenti omologhi migrano allo

stesso polo. Entrambi i prodotti hanno duplicazioni e delezioni di geni e non sono vitali. Si

verifica raramente. Traslocazione

9-22

(cromosoma

philadelphia)

CML (leucemia mieloide cronica) è un esempio di malattia associata a traslocazione reciproca. Se

non trattata, implica la crescita incontrollata dei mieloblasti. Il 90% dei pazienti con CML presenta

una mutazione nelle cellule leucemiche, chiamata cromosoma philadelphia: comporta uno

spostamento di una parte del braccio lungo del cromosoma 22 sul 9 e lo spostamento di una piccola

parte dell’estremità del 9 sul 22. Questa traslocazione sembra trasformare un proto-oncogene in un

oncogene. Il proto-oncogene (ABL) viene posizionato all’interno del gene BCR (breakpoint cluster

region) con formazione del gene chimerico BCR-ABL. Questo gene ibrido esprime una

tirosinchinasi sempre attiva che continua a stimolare le cellule a crescere e inibisce il riparo del

DNA, pertanto si genera instabilità genomica.

VARIAZIONE DEL NUMERO CROMOSOMICO

Quando un organismo ha un assetto aploide completo o un multiplo esatto di un assetto completo di

cromosomi viene definito euploide. In natura avvengono mutazioni cromosomiche che portano ad

un numero di interi assetti cromosomici. Mutazioni cromosomiche che portano a variazioni nel

numero di singoli cromosomi sono dette aneuploidie in quanto il numero di cromosomi non è un

multiplo esatto. La causa principale delle aneuploidie degli organismi è la non-disgiunzione di uno

o più cromosomi omologhi in meiosi I o dei cromatidi fratelli in meiosi II. Una non-disgiunzione in

meiosi I produce 4 gameti anomali: due con cromosoma duplicato e due senza quel cromosoma.

Una fusione di un gamete con cromosoma duplicato con uno normale genera una trisomia.

Negli animali l’aneuploidia di un autosoma è quasi sempre letale.

Tipi di aneuploidia:

Nullisomia: implica la perdita di una coppia di

• omologhi (la cellula è 2N – 2). Può

verificarsi ad esempio se la non disgiunzione

avviene in entrambi i genitori con la

produzione di gameti privi di quel

cromosoma.

Monosomia: consiste nella perdita di un

• singolo cromosoma (la cellula è 2N – 1).

Trisomia: implica un singolo cromosoma in

• più, la cellula ha tre copie di un singolo

cromosoma (2N + 1).

Tetrasomia: sono presenti quattro copie di un

• certo cromosoma (2N + 2). Può avvenire se

entrambi i gameti derivano da una non-

disgiunzione e presentano quel cromosoma

duplicato.

Nell’uomo la monosomia non è tollerata e si

riscontra in feti abortiti. Viene tollerata le

aneuploidie dell’X per effetto del

meccanismo denominato lyonizzazione

mediante il quale i cromosomi X in eccesso

vengono inattivati.

Solo poche trisomie degli autosomi sono

presenti in bambini nati vivi:

Trisomia 8: si trova allo stato di

• mosaico quindi non tutte le cellule

hanno la trisomia. Causa ritardo

mentale, malformazioni varie.

Trisomia 13: sindrome di Patau:

• labioschisi e palatoschisi, occhi

piccoli, polidattilia, ritardo mentale e

dello sviluppo e anomalie cardiache.

La maggior parte muore prima di 3

mesi.

Trisomia 18: sindrome di Edwards:

• l’80% sono femmine che hanno

malformazioni congenite multiple che

interessano tutti gli organi del corpo.

Dita flesse, cranio allungato, ritardo

mentale. Il 90% dei nati con trisomia

di E. muore entro 6 mesi.

Solo una trisomia permette la sopravvivenza

fino ad età adulta:

Trisomia 21: sindrome di Down: basso

• IQ, pieghe cutanee all’interno

dell’occhio, mani corte e tozze e

statura sotto alla media. La causa

principale è una non-disgiunzione

nella meiosi I nella madre (75% dei

casi) e nella meiosi II (25% dei casi).

Gli oogoni entrano in meiosi prima

della nascita della femmina con

arresto in profasi I. Ogni mese

all’ovulazione l’oocita secondario

inizia la meiosi II arrestandosi in

metafase e, solo a fecondazione

avvenuta, si completa la meiosi II. La

probabilità di non disgiunzione aumenta con la permanenza dell’oocita nell’ovaio quindi è

molto più probabile avere un figlio con sindrome di Down in età più avanzata. La sindrome

di Down può anche derivare nel 5% dei casi da un tipo diverso di mutazione cromosomica

che definisco fusione centrica o traslocazione robertsoniana che porta alla presenza di tre

copie del braccio destro del cromosoma 21. Si tratta di un tipo di traslocazione reciproca in

cui due cromosomi (t21-14, t21-15) acrocentrici non omologhi si rompono a livello dei

centromeri e i bracci lunghi si trovano attaccati a un unico centromero. Il genitore portatore

eterozigote può produrre tre coppie reciproche di gameti dove ogni coppia è il risultato di

una diversa segregazione dei tre cromosomi coinvolti. Gli zigoti sono prodotti dalla fusione

di questi gameti con gameti normali 14 e 21 prodotti dall’altro genitore. Con la

traslocazione si producono 2/6 gameti bilanciati (cromosomi normali 1/6 e traslocazione

bilanciate 1/6) e 4/6 gameti sbilanciati (1/6 trisomia 21 e 3/6 non vitali).

Monoploidia (presente un solo assetto

cromosomico) e poliploidia (presenti assetti

cromosomici multipli) implicano variazioni rispetto

alle condizioni normali del numero di interi assetti

cromosomici. Siccome è interessato il numero di

assetti cromosomici interi, si parla di euploidia.

Sono letali per animali, ma hanno minori

conseguenze sulle piante. Queste variazioni possono

derivare quando la prima o la seconda divisione

meiotica è abortiva (assenza di citogenesi) o quando

avviene una non-disgiunzione meiotica che

coinvolge tutti i cromosomi.

Monoploidia: evento provocato da alterazioni nella

formazione del fuso mitotico. Non bisogna

confonderlo con l’aploidia che è riferita ai gameti,

nel caso di monoploidia si ha un solo assetto

cromosomico. Si osserva raramente negli organismi

diploidi (mutazioni letali recessive). Alcuni insetti (api, vespe, formiche) sono monoploidi per una

parte del ciclo vitale, si sviluppano da uova non fecondate. Cellule aploidi gametiche di alcune

piante possono essere stimolate e mantenute in assetto cromosomico monoploide, ad esempio con

aggiunta di colchicina che non fa formare il fuso mitotico causando una duplicazione senza

divisione che si conclude con la formazione di diploidi omozigoti.

Poliploidia: è compatibile con la vita delle piante. È un evento provocato da alterazioni

dell’apparato del fuso per la quale non avviene divisione cellulare, ma avvengono una serie di

duplicazioni ripetute che possono essere pari (possibilità di appaiamento degli omologhi alla meiosi

à formazione di gameti) e dispari (presenta sempre un cromosoma spaiato, quindi instabilità alla

à

meiosi sterilità). Nell’uomo, il 15% degli aborti, è causa di una triploidia. Questo perché i

triploidi (dispari) sono molto instabili in meiosi, due dei tre cromosomi migrano a un palo e l’altro

n

migra all’altro polo. La probabilità che un triploide produca un gamete aploide è (1/2) dove n è il

numero dei cromosomi.

Autopoliploidia (piante): tutti gli assetti cromosomici derivano dalla stessa specie, è una

condizione che deriva da un difetto durante la meiosi che produce gameti diploidi o triploidi. Se un

gamete diploide fonde con uno aploide, lo zigote avrà tre corredi cromosomici (triploide). Esempio

è la banana (poliploidia dispari) quindi è senza semi. Data la condizione triploide e quindi la

mancanza di fertilità, la banana si riproduce per talea (per via vegetativa).

mancanza di fertilità, la banana si riproduce per talea (per via vegetativa).

Allopoliploidia (piante): gli assetti cromosomici derivano da specie diverse. Questa situazione può

verificarsi se due gameti aploidi provenienti da due specie diverse si uniscono per dare un

organismo con due assetti aploidi e, poi, entrambi gli assetti, vengono duplicati. Si producono

piante ibride N1+N2, ma, a causa delle differenze tra i due assetti cromosomici, non si ha

appaiamento in meiosi, quindi non si producono gameti vitali. Raramente, a causa di un errore nella

divisione, i due assetti cromosomici raddoppiano, producendo tessuti di genotipo 2N1+2N2

(diploidia per entrambi gli assetti). Ogni assetto diploide può funzionare in modo normale in meiosi

per cui può produrre gameti del tutto fertili del tipo N1+N2. La fusione dei due gameti può produrre

piante molto fertili, allelotetraploidi (2N1+2N2).

ALLELE LETALE: se è presente determina la morte dell’organismo. Se è presente questa variante

allelica in un gene essenziale (in tutti gli organismi diploidi ci sono geni chiamati essenziali) si ha

fenotipo letale.

L’allele letale può essere:

Dominante: è trasmesso difficilmente alla progenie e causa la morte sia di eterozigoti sia di

• omozigoti. È causa della malattia denominata Corea di Huntington (dominante ad esordio

tardivo).

Recessivo: viene trasmesso alla progenie attraverso portatori sani e causa la morte solo in

• individui omozigoti. Sono causa della malattia Tay Sach e della distrofia muscolare

Duchenne, entrambe letali.

DNA RICOMBINANTE

La tecnologia del DNA ricombinante consiste nel ricostruire in vitro molecole di DNA di origine

diversa per generare una singola molecola di DNA. L’ingegneria genetica si occupa di analisi del

DNA e clonaggio del DNA che comprende la costruzione di mappe fisiche, lo studio di espressione

di specifici geni, l’espressione di specifiche proteine e la modificazione genetica di cellule o

organismi. Per essere clonato, il DNA deve essere isolato, tagliato alle estremità e legato, a formare

una molecola ricombinante, in un vettore di clonaggio che, una volta inserito in cellule ospiti verrà

amplificato. Per quanto riguarda il taglio del DNA entrano in gioco una categoria specifica di

enzimi chiamati enzimi di restrizione che sono DNAasi capaci di riconoscere nel DNA una

specifica sequenza di coppie di basi (sito di restrizione) e taglia (digerisce) lo stesso DNA a livello

di tale sequenza idrolizzando l’ossatura zucchero-fosfato. Ogni enzima di restrizione taglia il DNA

nello specifico sito di restrizione, ogni enzima taglia in uno specifico punto. Questi enzimi tagliano

il DNA tra il carbonio in posizione 3’ e il gruppo fosfato del legame fosfodiesterico; quindi i

segmenti tagliati hanno 5’-fosfato e 3’-OH. La maggior parte degli enzimi di restrizione si trova nei

batteri e ne va a costituire il sistema immunitario, proteggendo la cellula batterica da organismi

virali penetrati all’interno. La cellula batterica metila i suoi siti di restrizione in modo tale che il

DNA sia protetto dall’azione di enzimi di restrizione. Le sequenze vengono tagliate in

corrispondenza di sequenze palindrome, quindi presentano una simmetria centrale. Il taglio può

avvenire a livello dell’asse centrale di simmetria lasciando estremità piatte (accoppiamento perfetto

a livello delle basi) oppure possono operare un taglio che lasci estremità protrudenti al 5’ o al 3’.

Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA in modi diversi:

SmaI: taglia entrambe le eliche di DNA fra le stesse copie di nucleotidi producendo frammenti

• con estremità piatte.

BamHI: opera tagli a zig zag nella sequenza nucleotidica simmetrica dando origine a

• frammenti con estremità coesive o sfalsate o sporgenti all’estremità 5’.

PstI: genera estremità sporgenti al 3’.

Una molecola di DNA ricombinante è un vettore.

Un modo per costruire una molecola ricombinante è clonare. È possibile ottenere milioni di copie

del vettore. Numerosi vettori specifici vengono impiegati per clonare il DNA tra cui plasmidi,

batteriofagi, cosmidi e cromosomi artificiali. Il DNA plasmidico contiene una sequenza di origine

necessaria per la replicazione (ori).

Caratteristiche di un vettore plasmidico:

Sequenza ori necessaria perché il plasmide si replichi nel batterio.

• Marcatore di selezione gene che permette di selezionare le cellule che hanno ricevuto il

• vettore clonaggio.

Uno o più siti unici di taglio per enzimi di restrizione siti presenti una sola volta nel vettore

• per l’inserimento dei frammenti da clonare. Un vettore possiede un certo numero di siti che

tendono ad essere uniti in un sito di clonaggio multiplo o polylinker (regione di DNA che

contiene numerosi siti unici di taglio e a livello della quale un frammento di DNA può

essere inserito il vettore).

ESEMPIO VETTORE DI CLONAGGIO PLASMIDICO

Vettore pBluescript II ha le seguenti caratteristiche:

Presente nella cellula in un numero elevato di copie (ori molto attiva).

• R

Presenta un marcatore selettivo per la resistenza all’ampicillina (amp ).

• Ha un sito di clonaggio multiplo che contiene 18 siti di restrizione.

• Il sito di clonaggio multiplo è inserito all’interno della sequenza del gene di E. coli che

• b-galattosidasi +

codifica per la (lacZ ). Questo vettore viene generalmente inserito in un

ceppo di E. coli contenente il gene lacZ mutato. L’inserimento di un frammento di DNA nel

b-galattosidasi +

polylinker interrompe parte del gene per la (lacZ ) che non risulta

funzionante in E. coli.

Come viene inserito un frammento di DNA in un vettore di clonaggio plasmidico

pBluescript II viene prima tagliato con l’enzima di restrizione che un sito nel polylinker. Poi viene

tagliato anche il DNA ad alto peso molecolare con lo stesso enzima di restrizione, così da ottenere il

frammento da clonare. I frammenti di DNA vengono mescolati con il vettore tagliato in presenza

della DNA ligasi che caratterizza la formazione di un legame covalente fra le due molecole. Il

plasmide ricombinante così ottenuto viene inserito in cellule ospiti di E. coli mediante

trasformazione. Al fine di aumentare la capacità del batterio di assumere DNA, viene trattato

chimicamente (CaCl ) o mediante elettroporazione. Le cellule trasformate vengono piastrate su

2

terreni di coltura contenenti ampicillina e X-gal. Le cellule che sono in grado di crescere devono

essere state trasformate da un plasmide. Le colonie possono essere identificate mediante un saggio

bianco-blu. Le colonie bianche rappresentano quelle ricombinanti e quelle blu sono quelle che

contengono il vettore senza l’inserimento di DNA.

Elettroforesi su gel

È una tecnica classicamente utilizzata per analizzare e separare acidi nucleici. Questa tecnica sfrutta

le cariche presenti nelle molecole di DNA o RNA (caricate negativamente) per farle migrare, in un

campo elettrico, attraverso un gel di agarosio. Il gel funge da setaccio, essendo costituito da una rete

di pori, i quali consentono di separare le molecole in base alla loro grandezza: quelle più piccole

attraversano più velocemente i pori rispetto a quelle più grandi quindi si avrà una separazione in

funzione della velocità.

Southern blotting

Questo metodo prevede:

Separazione di miscele complesse di

• frammenti di DNA in base alle loro

dimensioni mediante elettroforesi su

gel.

Trasferimento delle molecole su una

• membrana.

Identificazione di un DNA di interesse

• mediante l’utilizzo di una sonda

complementare ad esso.

La metodica:

Taglio del campione con enzimi di

• restrizione che produce frammenti di

differente lunghezza

Separazione dei frammenti mediante

• elettroforesi su gel di agarosio.

Il DNA viene trattato con bromuro di

• etidio in modo da essere visibile sotto

UV.

Trasferimento dei frammenti su un

• filtro. Il gel viene immerso in una

soluzione alcalina per denaturare i

filamenti, per poi essere posto sopra

un pezzo di carta assorbente che

copre la lastra di vetro. Le estremità

della carta contengono una soluzione

tampone che viene assorbita dalla

carta assorbente, passa attraverso il

gel e il filtro e nel pacco di carta

assorbente posto sopra al filtro. In

pratica i frammenti sono trasportati

dal flusso del tampone e vengono

trasferiti dal gel alla membrana

(mantengono le stesse posizioni che

avevano nel gel).

Il filtro viene immerso in un tampone

• contenente una sonda marcata che si

ibriderà a qualsiasi frammento

complementare.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Serve per ottenere quantità adeguata di DNA, quindi serve per amplificare il DNA. È una tecnica

che sfrutta la reazione di replicazione del DNA sottoponendolo a una serie di cambiamenti di

temperatura controllati.

Servono due primer che devono essere complementari alle due estremità della sequenza da

• amplificare.

I primer vengono aggiunti al DNA insieme a dNTP precursori.

• Riscaldo a 95 gradi circa in modo da aprire la doppia elica (denaturazione).

• Abbasso la temperatura in modo da permettere al primer di attaccarsi al filamento (questa

• temperatura è generalmente tra i 55 e i 65 gradi).

Viene aggiunta una DNA polimerasi termostabile (enzimi che funzionano e mantengono una

• struttura corretta a temperature elevate). Questi enzimi lavorano a temperature intorno ai 70

gradi.

Sequenziamento del DNA

Il metodo Sanger è un metodo cosiddetto enzimatico, poiché richiede l'utilizzo di un enzima; il

principio della tecnica sviluppata da Fred Sanger si basa sull'utilizzo di nucleotidi modificati

(dideossitrifosfato, ddNTPs) per interrompere la reazione di sintesi in posizioni specifiche. I

nucleotidi dideossitrifosfato sono molecole artificiali corrispondenti ai nucleotidi naturali, ma si

differenziano per l'assenza del gruppo idrossilico sul carbonio 2' e 3' della molecola.

I dideossinucleotidi, a causa della loro conformazione, impediscono che un altro nucleotide si leghi

ad essi, in quanto non si possono formare legami fosfodiesterici.

Confronto tra deossiadenosina (sopra) e dideossiadenosina (sotto). Notare la mancanza del gruppo -

OH che impedisce il legame di un altro nucleotide, provocando la terminazione della

polimerizzazione.

Il protocollo classico richiede un templato di DNA a singolo filamento, un primer per iniziare la

reazione di polimerizzazione, una DNA polimerasi, deossinucleotidi e dideossinucleotidi per

terminare la reazione di polimerizzazione.

I nucleotidi modificati (ddNTPs) o il primer devono essere marcati (radioattivamente o

per fluorescenza) in modo da poter visualizzare le bande dei frammenti di DNA neosintetizzato

dopo aver effettuato l'elettroforesi. Il campione di DNA da sequenziare viene diviso in quattro

reazioni separate, ognuna delle quali contiene la DNA polimerasi e tutti e 4

i deossiribonucleotidi (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Ad ognuna di queste reazioni viene poi aggiunto

solo uno dei quattro nucleotidi dideossi in quantità stechiometricamente inferiore per permettere

una elongazione del filamento sufficiente per l'analisi. L'incorporazione di un dideossinucleotide

lungo il filamento di DNA in estensione ne causa la terminazione prima del raggiungimento della

fine della sequenza di DNA stampo; questo dà origine ad una serie di frammenti di DNA di

lunghezza diversa interrotti in corrispondenza dell'incorporazione del dideossinucleotide, che

avviene casualmente quando esso è utilizzato dalla polimerasi in luogo di un nucleotide deossi.I

frammenti generati da queste reazioni vengono poi fatti correre su gel di poliacrilammide-urea che

permette la separazione dei vari frammenti con una risoluzione di un nucleotide. Ognuna delle 4

reazioni è corsa su pozzetti vicini, dopodiché le bande sono visualizzate su lastra autoradiografica o

sotto luce UV e la sequenza viene letta direttamente sulla lastra o sul gel. Attualmente è possibile

effettuare, anziché quattro reazioni distinte per ogni nucleotide modificato, una sola reazione

utilizzando i 4 ddNTPs marcati fluorescentemente in modo diverso tra loro ed utilizzando lettori

utilizzando i 4 ddNTPs marcati fluorescentemente in modo diverso tra loro ed utilizzando lettori

ottici appropriati. In questo modo ogni filamento di DNA emetterà una luce di colore diverso in

base al nucleotide (ddNTP) col quale terminerà.

La genetica può essere suddivisa in quattro categorie:

Genetica mendeliana: Studia le modalità di trasmissione alla progenie di singoli geni in

associazione a determinati fenotipi, o di pochi geni che determinano un fenotipo, attraverso l’analisi

del fenotipo trasmesso.

Genetica quantitativa: studia la modalità di eredità di caratteri determinati dall’azione simultanea di

più geni.

Genetica molecolare: studia i meccanismi alla base della funzione del materiale genetico:

duplicazione, trascrizione, traduzione e la loro regolazione (ingegneria genetica) quindi si concentra

sulla cellula.

Genetica di popolazioni: Permette di identificare la struttura genetica in generale delle popolazioni,

permette di capire se individui di una determinata popolazione hanno probabilità di sviluppare o

meno una determinata malattia. Studia la struttura genetica delle popolazioni attraverso la

determinazione del pool allelico di uno o pochi geni in una popolazione mendeliana e

l’identificazione delle forze che ne fanno variare le frequenze. Una popolazione mendeliana è

rappresentata da un gruppo di individui interfertili che condividono un insieme comune di geni,

questi geni costituiscono il pool genico.

Problematiche da affrontare:

• Variabilità genetica nelle popolazioni naturali (fattori che portano le popolazioni a

diversificarsi).

• Quali processi evolutivi selezionano determinati alleli che incidono sulla variabilità.

• La divergenza genetica tra le popolazioni da quali processi viene determinata

• Come possono il sistema di riproduzione, la fertilità, la struttura delle popolazioni in classi di

età/sesso, influenzarne il pool genico.

Si parte dando per scontato il meccanismo meiotico della produzione di gameti con frequenze che si

possono predire. Sono stati sviluppati anche modelli matematici predittivi della struttura genetica

delle popolazioni.

La prima possibilità per calcolare la genetica di una popolazione è il calcolo delle frequenze

genotipiche.

Frequenze genotipiche = n. individui con un dato genotipo

totale individui della popolazione

La frequenza dei genotipi è utile per analizzare la selezione naturale. È meglio calcolare la

frequenza degli alleli quando è possibile poiché, dato un numero X di alleli, ci sono meno alleli

à à

rispetto ai possibili genotipi (es 2 alleli 3 genotipi e 3 alleli 6 genotipi).

Il genitore trasmette i gameti, non trasmette i genotipi (il genotipo di un gamete è l’insieme dei

singoli alleli relativi ai loci di un genoma). Il pool genico si evolve grazie alle variazioni delle

frequenze alleliche.

Frequenze alleliche +

N° totale di alleli a N° individui a a X 2 N° individui a a

1 = 1 1 1 2

+

N° totale di alleli a N° individui a a X 2 N° individui a a

2 = 2 2 1 2

f(a1) = p = (tot a1a1 X 2 + tot a1 a2) / (tot individui X 2)

f(a2) = q = (tot a2a2 X 2 + tot a1 a2) / (tot individui X 2)

F(Xa1) = p = Tot femmine Xa1Xa1 x 2 + Tot femmine Xa1Xa2 + Tot maschi Xa1Y

​ Tot femmine X 2 + Tot maschi

F(Xa2) = q = Tot femmine Xa2Xa2 x 2 + Tot femmine Xa1Xa2 + Tot maschi Xa2Y

​ Tot femmine X 2 + Tot maschi

LEGGE DI HARDY- WEINBERG

Mette in relazione le frequenze alleliche e le

frequenze genotipiche. Dice che nelle popolazioni di

grandi dimensioni, le frequenze alleliche e

genotipiche sono casuali. Incrocio casuale è riferito al

gene che si sta studiando (ad esempio vale per i

gruppi sanguigni).

La legge contiene i principi mendeliani basati sulla meiosi e riproduzione sessuale applicati ai

concetti di frequenze alleliche e genotipiche di una popolazione.

ENUNCIATO: in una popolazione infinitamente grande, in cui avvengono incroci casuali (no

matrimoni predestinati), sulla quale non agiscono mutazioni, migrazioni, selezione naturale,

le frequenze alleliche non variano nel tempo, essendo p la frequenza allelica di A, q quella di

2 2

a. le frequenze genotipiche si stabilizzano nelle proporzioni p + 2pq + q = 1.

p + 2pq + q = (p + q) = 1

2 2 2

Se le condizioni della legge di H-W sono rispettate si dice che la popolazione è all’equilibrio,

quindi posso applicare questa legge solo se la popolazione è all’equilibrio. Le frequenze alleliche

avranno le proporzioni del quadrato di binomio per due alleli. Per loci con tre alleli, le frequenze

dei genotipi all’equilibrio rispettano il quadrato di trinomio:

(p + q + r) = p + 2pq + 2pr + 2qr + q + r = 1

2 2 2 2

Per gli alleli associati all’X:

Femmine: come per gli autosomi

• Maschi: frequenze genotipiche = frequenze alleliche

La frequenza massima dell’eterozigote per un locus a due alleli è 0,5 e questo viene raggiunto solo

quando sia la frequenza di A, sia quella di a sono 0,5. Se le frequenze sono comprese tra 0,33 e

0,66, il genotipo eterozigote rappresenta il più numeroso. Per frequenze basse di un allele (< 0,33),

genotipo omozigote per l’allele è il più raro.

Le malattie genetiche rare sono determinate da un genotipo poco frequente e sono solitamente

recessive. La frequenza dell’allele malato è maggiore della frequenza del genotipo malato perché ci

sono gli eterozigoti (portatori sani) quindi la malattia “sopravvive” grazie ai portatori sani.

ESEMPIO:

Frequenza malattia recessiva è 1/60000 =0,000016

• q = 0,004 (radice quadrata di 0,000016)


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8 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie mediche
SSD:
Docente: Riva Paolo
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher francescaputti di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica generale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Riva Paolo.

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