Folding proteico e cristallografia a raggi X

Il processo di folding è molto veloce e inizia insieme alla sintesi della

catena lineare all interno del ribosoma.

Prima si formano le s. secondarie che sono legami a corto raggio. Poi

si forma la s. terziaria per le interazioni a lungo raggio.

Tutti gli amminoacidi idrofobici interagiscono formando un core

idrofobico perché il citoplasma non è compatibile in quanto è una

soluzione acquosa quindi compatibile con gli aa idrofilici polari o

carichi che si dispongono all esterno, quindi le prime interazioni sono

di tipo idrofobico.

Dopo di che la proteina prova diverse configurazioni intermedie di

interazioni deboli che però sono transienti, non sono quelle native,

essendo instabili cambiano e convergono verso quella nativa.

Questo è un processo + lento. Il parametro + impo qui è l energia, gli

intermedi hanno energia troppo alta ancora, solo quando si arriva all

energia minima si è raggiunta la struttura nativa.

Alla fine si formano leg stabilizzatori come il ponte disolfuro.

Durante il folding alcune molecole d acqua potrebbero essere catturate

all interno, poi o vengono trattenute o vengono espulse.

Nel passare dalla configuraz unfolded agli intermedi parzialmente

foldati fino alla config folded, l energia del processo diminuisce

seguendo uno schema ad imbuto, secondo la termodinamica.

Le proteine potrebbero fermarsi a uno stato intermedio, allora

intervengono delle proteine ausiliarie che sono i chaperoni e

chaperonine che guidano il folding e riconoscono una struttura

non natia e idrolizzano i leg sbagliati.

Poi c è la PDI (protein disulfide isomerasi) che è in grado di vedere

errori specifici nei leg disolfuro e li corregge. In particolare,

riconosce una coppia di cys sbagliata, rompe il leg e forma un leg tra il

proprio gruppo SH e quello di una delle due cys, nel frattempo l altra va a

rompere il secondo leg sbagliato e a legarsi alla cys giusta, poi la PDI si

stacca e l altra coppia di cys giusta si forma.

Le proteine errate possono anche subire degradazione da parte dei

proteosomi.

Ci sono però alcuni casi in cui gli errori non vengono riconosciuti e

corretti e vanno a generare stati patologici, quando ci sono strutture

3d erronee ma stabili.

C è del movimento negli amminoacidi, molto piccolo, la proteina respira.

Ogni aa possiede 3 conformazioni stabili, in teoria tutte e tre

dovrebbero essere provate durante il folding, ma in questo modo il

processo diventerebbe troppo lungo ma si sa che è un processo molto

veloce. Ciò significa che durante il folding la proteina non passa per

tutte le conformazioni possibili ma il processo è guidato da parametri

cinetici e termodinamici, ovvero segue un percorso diretto e

unidirezionale che porta ad abbassare progressivamente l

energia libera degli stati intermedi aumentandone la stabilità

verso la conformaz nativa e che velocizza il processo che così

avviene in pochi secondi. Questo è il paradosso di Levinthal.

Le prot +complesse, che possiedono una s quaternaria, esistono in due

strutture natie possibili entrambe stabili, ovvero lo stato R e lo stato T.

Lo stato R ovvero relaxed è quello +attivo e +affine al suo substrato,

mentre lo stato T ovvero tight è quello -attivo e -affine. Il passaggio

da uno stato all altro è controllato da specifici cofattori che si legano

alla proteina, cambiando le interazioni tra le sue subunità, che sono i

regolatori allosterici. Tra R e T esiste un equilibrio dinamico e questo

equilibrio può essere spostato verso R o verso T dai reg all.

La cristallografia a raggi X è una delle tecniche convenzionali per

ricavare la struttura 2d 3d e 4d della proteina:

1. Isolamento o produzione della prot.

2. purificazione attraverso delle tecniche apposite es cromatografia

3. cristallizzazione, ovvero la prot forma dei cristalli che sono

strutture compatte

4. selezione dei cristalli migliori, che devono essere

sufficientemente puri regolari e grandi

5. bombardamento dei cristalli attraverso un fascio monocromatico

a raggi x

6. il fascio verrà deviato dal cristallo a seconda della sua struttura

molecolare e produrrà dei pattern di diffrazione che vengono

rilevati

7. i pattern di diffrazione vengono convertiti in mappe di densità

elettronica, ovvero viene ricostruita la struttura molecolare e

atomica del cristallo. L analisi del pattern di diffrazione permette

la ricostruzione di un modello 2d, con il metodo della trasformata di

Fourier si riesce a ricostruire il modello 3d.

Casi problematici per l applicazione di questa tecnica sono molecole

troppo piccole e molecole troppo grosse es prot di membrana.

Questo perché risulta difficile isolarle e poi cristallizzarle. Ad esempio

prot molto idrofobiche come quelle di membrana integrali. Ad influenzare

l efficacia della tecnica è anche l efficacia dell isolamento e della

purificazione precedenti.