Farmacologia clinica e monitoraggio farmaci

PRE-TRATTAMENTO DEI CAMPIONI

Il pre-trattamento dei campioni è fondamentale prima della fase cromatografica. Migliora la

specificità, la selettività, la precisione e l'accuratezza, contribuendo al miglioramento del limite

inferiore di quantificazione (LLOQ)→ è il punto più basso della nostra curva in cui quantifichiamo

l’analita nella sua concentrazione più bassa. La lunghezza della colonna di separazione è misurata.

PREPARAZIONE CAMPIONI

La preparazione dei campioni coinvolge tecniche come centrifugazione, omogeneizzazione,

sonicazione (nel caso di tessuti), evaporazione, cromatografia, precipitazione, ultrafiltrazione. La

denaturazione delle proteine nel siero può essere ottenuta tramite centrifugazione per ottenere un

precipitato proteico e un supernatante, ma può comportare il rischio che parte del farmaco può

rimanere legato alle proteine.

Per l'estrazione liquido-liquido, il pH è regolato per rendere il farmaco estraibile da acqua e

cloroformio. Dopo l'agitazione, le fasi si separano, il farmaco si separa e può essere concentrato nel

cloroformio. Questo può essere portato a secco e quindi ridissolto in un nuovo solvente. Due delle

procedure possibili, ma il metanolo non è raccomandato per la fase inversa.

Nel pre-trattamento dei campioni, due tecniche sempre utilizzate sono la centrifugazione e la

concentrazione per evaporazione. Le tecniche estrattive includono:

1.Diluizione:

•Il campione può essere diluito con acqua, includendo sia le sostanze interferenti che l'analita.

•La soluzione diluita può essere iniettata per l'analisi.

2.Precipitazione:

•Aggiunta di un solvente denaturante al campione.

•Le proteine precipitano al fondo della provetta.

•Centrifugazione e separazione del surnatante dal fondo.

•Iniezione della soluzione ottenuta, considerando il rischio di legame del farmaco alle proteine.

3.Ultrafiltrazione:

•Utilizzata per dosare la frazione libera del farmaco (es. fenitoina libera)

•2 provette→ Provetta interna piccola entra in quella più grande. Il fondo della provetta piccola ha una

membrana con cut off di Pm., 5000-10000.

•Il campione è nella provetta ggrande poi si inserisce la provetta piccola inserita.

•La centrifugazione spinge la provetta interna verso il fondo, ottenendo l'ultrafiltrato con solo il

farmaco libero.

•Estrazione della provetta interna per misurare la concentrazione del farmaco libero.

•L'ultrafiltrato viene recuperato con una Pasteur o una pinzetta.

La temperatura è mantenuta costante durante il processo per garantire la ripetibilità dei risultati.

Queste tecniche estrattive consentono di determinare la concentrazione totale o la frazione libera del

farmaco nei campioni biologici.

ESTRAZIONE LIQUIDO-LIQUIDO

L'estrazione liquido-liquido implica la conoscenza delle caratteristiche chimiche della molecola da

estrarre e delle proprietà dei solventi. Sfrutta la capacità della molecola di ripartire tra due solventi

non miscibili. Tuttavia, presenta svantaggi come laboriosità, tempi lunghi, possibile formazione di

emulsioni e maggior rischio di errori manuali.

Per questa estrazione, comunemente si utilizzano provette in pirex da 10 ml con tappo a tenuta,

mentre per urine a volte si impiegano piccoli imbuti separatori. Le provette in pirex possono essere

scure per proteggere molecole fotosensibili, come alcuni calcioantagonisti.

La procedura include:

La procedura di analisi comprende l'aggiunta di tamponi o soluzioni acide/basiche al volume di

matrice nella provetta, seguita da vortex. Successivamente, si aggiunge uno standard interno e si

esegue nuovamente il vortex. Dopo l'aggiunta del solvente e la chiusura ermetica, si procede

all'agitazione su rulli per una separazione più delicata. La centrifugazione separa le fasi, e si recupera

la fase contenente le molecole da analizzare. Questa fase viene inserita in una nuova provetta, e il

processo di estrazione viene ripetuto per aumentare l'efficienza.

Dopo unire i volumi estratti, si procede a portare a secco il campione con azoto o evaporatore

centrifugo rotante. Successivamente, il campione viene risospeso con un piccolo volume di fase

mobile HPLC attraverso vortex, centrifugato brevemente, e infine è pronto per l'iniezione.

Per molecole con adsorbimento sul vetro, è necessaria la silanizzazione della vetreria. La ripetizione

dell'estrazione con un volume di solvente diviso può aumentare l'efficienza. Inoltre, viene menzionata

la diluizione 1:1 delle urine con acqua, seguita dalla centrifugazione per evitare la formazione di

precipitati.

L'estrazione liquido-liquido su supporto solido, utilizzando colonne Extrelut, impiega colonne di vetro

con impaccatura di silice inerte da terra di diatomee, caratterizzate da ampia porosità. Queste

colonne sono chimicamente inerti e possono essere impiegate in un intervallo di pH da 1 a 13.

Rispetto alla separazione liquido-liquido convenzionale, questa tecnica offre vantaggi come l'assenza

di emulsioni, una migliore separazione tra le fasi, riduzione del consumo di solventi e dei tempi di

analisi. La procedura è automatizzabile, ma la sua implementazione è costosa.

La colonna Extrelut viene caricata con il campione acquoso, che si distribuisce intorno alle particelle

di silice. Le sostanze lipofile vengono eluite con un solvente organico immiscibile con l'acqua, come

un idrocarburo alogenato, etil acetato o dietil etere. Successivamente, l'eluato viene evaporato per

ulteriori procedimenti analitici.

L'estrazione in fase solida è essenzialmente una cromatografia preliminare prima dell'analisi

cromatografica effettiva. Si impiegano colonnine in polipropilene, riempite per circa un quarto con

diverse fasi e collegate a un'unità con rubinetti, dove viene creato il vuoto attraverso una pompa.

Le procedure variano a seconda che si operi in fase inversa, normale o a scambio ionico. Una pompa

collegata alla corrente genera il vuoto con due opzioni di regolazione. Un tubo resistente al vuoto si

connette a una beuta con ingresso e uscita, fondamentale quando si utilizza una pompa ad acqua per

evitare il risucchio dell'acqua nel sistema.

Vantaggi includono facilità d'uso, rapidità, possibilità di trattare più campioni contemporaneamente e

automatizzabilità. Tuttavia, gli svantaggi comprendono l'alto costo delle colonnine e la sfida

nell'evaporare il MeOH, talvolta utilizzato come solvente finale di eluizione.

La Cromatografia in Fase Liquida ad Elevate Prestazioni (HPLC) si basa sul principio di far scorrere un

liquido attraverso una colonna contenente una fase stazionaria, separando le sostanze introdotte allo

stato liquido. I composti separati in uscita dalla colonna possono essere successivamente

determinati. La risoluzione dei picchi richiede bande strette delle sostanze in uscita.

La separazione dipende dalle caratteristiche della fase stazionaria, dalle proprietà delle molecole da

separare, dal flusso costante, dal tipo e dalla concentrazione della fase mobile, e dalla temperatura,

che deve essere controllata in un laboratorio termostatato.

Elementi caratteristici della separazione includono il tempo di ritenzione (tR), che rappresenta il

tempo di permanenza di una sostanza nel sistema cromatografico, dipendente principalmente dalla

colonna e dall'affinità della sostanza verso le fasi mobile e stazionaria. Il tempo morto (t0) è la piccola

perturbazione iniziale, mentre il tempo di ritenzione corretto (t'R) è la differenza tra tR e t0. L'ampiezza

del picco (W) e l'ampiezza alla base (Wb), misurate a volte al 50% dell'altezza, sono altri parametri di

valutazione.

Fattore di capacità k'

Il fattore di capacità (k') è legato alla fase stazionaria e alla temperatura, influenzando il tempo di

ritenzione. Se k' = 0, il tempo di ritenzione (tR) è uguale a quello del solvente (t0), indicando che la

sostanza non viene trattenuta dalla colonna. Un k' più alto si traduce in un tR più lungo per la

sostanza. Il k' deve essere compreso tra 0 e 5-6 per evitare analisi eccessivamente lunghe, ed è

indipendente dal flusso e dal sistema, dipendendo invece dalle interazioni molecolari con una

specifica fase mobile e colonna.

Selettività

La selettività rappresenta la capacità della colonna e della fase mobile di produrre picchi differenziati,

mentre l'efficienza separativa indica la capacità della colonna di mantenere compatta la banda di

eluizione, generando picchi stretti. Il fattore di separazione relativa (α) è utilizzato per valutare la

selettività.

Il numero teorico di piatti (N) è legato alla larghezza alla base dei picchi (W) e al tempo di ritenzione

(tR), indicando l'efficienza della colonna. Una colonna è più efficace quanto minore è l'ampiezza alla

base (H) e maggiore è il numero teorico di piatti.

RISOLUZIONE DEI PICCHI: FATTORI DETERMINANTI

La risoluzione dei picchi in cromatografia è influenzata da diversi fattori determinanti, tra cui il

collegamento adeguato tra tubi e colonna senza spazi morti, tramite ferrule deformabili e raccordi di

Peak. Il trasferimento di massa tra le fasi mobile e stazionaria dipende dalle costanti di diffusione del

composto. La diffusione microvorticosa è causata dal flusso irregolare della fase mobile, mentre la

diffusione molecolare longitudinale rappresenta il movimento disordinato del soluto in tutte le

direzioni.

QUALITÀ’ DELLA RISPOSTA ANALITICA

Risoluzione

La qualità della risposta analitica è valutata attraverso la risoluzione, che dipende dall'efficienza,

selettività e fattore di capacità. La simmetria dei picchi è influenzata dalla fase stazionaria e

dall'introduzione lenta del campione. La capacità della colonna rappresenta la quantità massima di

campione iniettabile senza saturazione.

La riproducibilità è legata alla costanza del flusso della fase mobile, tempi di ritenzione, area, altezza

e simmetria dei picchi, dipendendo dallo stato della colonna. L'ottimizzazione dei diversi fattori (flussi,

fase stazionaria, tipo e concentrazione della fase mobile) è essenziale per ridurre i tempi di lavoro

senza influire negativamente sui risultati.

COLONNE

Le colonne cromatografiche presentano caratteristiche specifiche:

- Le particelle impaccate hanno dimensioni di 3-10 cm e sono impaccate con particelle di 3

micrometri.

- I tipi di supporto includono gel di silice microgranulare (1,3-20 micron), allumina (5-15 micron) o

polistirene reticolato. Il polistirene è generalmente resistente a pH più acidi (1-14), ma può produrre

picchi larghi.

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