Genetica ed epigenetica

MECCANISMI EPIGENETICI DELLA REGOLAZIONE DEL GENOMA

Nelle cellule eucariotiche la molecola di DNA è strutturata in cromatina, per contenere grandi

quantità di DNA in un piccolo spazio e per consentire la regolazione del genoma stesso mediante

meccanismi che alterino la struttura della cromatina stessa.

La cromatina è costituita da DNA associato a proteine istoniche che interagiscono in maniera

elettrostatica con il DNA. La massima condensazione della cromatina la si osserva in mitosi

(distinzione centromero e telomeri del cromosoma).

L’unità di base della cromatina è il nucleosoma: 2 istoni H2A, 2 istoni H2B, 2 istoni H3 e 2 istoni

H4, per un totale di 146 le bp associate all’ottamero istonico.

Gli istoni:

 

sono proteine basiche con aa a carica positiva l’interazione elettrostatica con il DNA

carico negativamente.

 

le code N-terminali degli istoni sono maggiormente arricchite in aa basici soggette a

modificazioni post-traduzionali che possono alterarne la carica positiva.

 

Modificazioni istoniche consentono di alterare la struttura della cromatina passando da

stati maggiormente aperti, accessibili a fattori di trascrizione e proteine che possono

regolare il metabolismo del DNA, a strutture maggiormente compatte e quindi

inaccessibili a proteine che regolano il metabolismo.

Il termine epigenetica deriva dalla fusione delle parole epi, che in greco significa sopra, e della

parola genetica, e definisce come i tratti ereditabili del genoma non siano solo codificati dalla

sequenza del DNA, ma siano anche depositati in fattori che sono posizionati sopra la sequenza di

DNA. (1942 Waddington definì termine epigenetica)

L’informazione epigenetica è coinvolta:

 Modulare in maniera differenziale il pattern di espressione genica, molto importante

durante il differenziamento di lineage specifici cellulari

 Propagare essenziali strutture architettoniche, come nei centromeri e nei telomeri.

La definizione più accettata è che l’epigenetica è lo studio dei cambiamenti ereditabili della funzione

del genoma che avvengono senza che vi siano alterazioni della sequenza del DNA e quindi essa è in

grado di registrare segnalare e trasmettere attività e stati alterati della cromatina anche in seguito

a condizioni ambientali sia interne che esterne.

I meccanismi epigenetici del DNA sono:

 Rimodellamento della cromatina, che può consentire o meno l’accesso a fattori di

trascrizione in grado di legare sequenze bersaglio presenti nel DNA

 Modificazioni istoniche che hanno un ruolo dinamico per consentire il passaggio da

eucromatina ad eterocromatina e viceversa

 Varianti istoniche che possono essere sostituite a varianti canoniche ed alterare la struttura

della cromatina

 Sequenze di RNA regolative non codificanti che possono essere coinvolte nel reclutamento

di altri fattori che rimodellano la cromatina

 Strutture 3D della cromatina tra cui i territori nucleari

 Metilazione del DNA che è connessa al silenziamento genico

Nonostante l’epigenetica non sia codificata nella sequenza di DNA stesso, i marcatori epigenetici

sono ereditabili, quindi il termine genetica rappresenta bene questo concetto all’interno della

parola epigenetica.

Tuttavia ha un grado plasticità e reversibilità, diversamente dalla genetica che è codificata nella

sequenza di basi ed è stabile.

Lo stato della cromatina è osservabile attraverso microscopi elettronici:

 

Eterocromatinastati maggiormente condensati DNA relativamente compatto, non

trascritto perché non accessibile ai fattori di trascrizione

 Eucromatinazone più rilassate, meno dense per gli elettroni della microscopia elettronica

 DNA relativamente aperto, accessibile ai fattori di trascrizione e quindi trascrivibile.

La cromatina è composta da diversi domini, caratterizzati da particolari stati:

 nell’arricchimento delle modificazioni post-traduzionali

 nelle varianti istoniche

 nella metilazione del DNA

 nello stato di occupazione dei nucleosomi sulla cromatina stessa

 nei territori nucleari

Le modificazioni post-traduzionali avvengono sulle code N-term degli aa basici (lisine, arginine,

serine, proline) degli istoni ed ognuna ha un ruolo diverso.

La scelta delle modificazioni post-traduzionali è molto importante perché possono cambiare la

proprietà funzionale dell’aa ed avere un ruolo sulla struttura cromatinica e quindi sulla trascrizione.

Modificazioni ad oggi identificate:

 

acetilazione iston-acetiltransferasi

(HAT)

 Deacetilazioneiston-deacetilasi

 metilazione sulle lisine e sulle arginine

 lys/arg metilasi

 

fosforilazione chinasi

 

ubiquitilazione ubiquitilasi

 sumoelazione

 ADPribosilazione

 Deaminazione

 Isomerizzazione delle proline

I ruoli principali di queste modificazioni si

hanno nella trascrizione, replicazione, riparo del DNA o condensazione della cromatina.

 Istone H2AZprincipalmente a livello del promotorelivelli di trascrizione bassi

 Acetilazione istoni H3 e H4apre la cromatina, soprattutto a livello dei promotorilivelli

di trascrizione alti

 Metilazionelungo tutto il corpo del geneposti in regioni di regolazione o su tutto il

corpo del genea seconda del livello di metilazione, anche di uno stesso residuo (H3

metilato in K4mono/di/tri metilato) si avranno diversi livelli di trascrizione

In conclusione, la cromatina è uno stato molto dinamico, che può essere altamente condensato o

aperto; l’apertura della cromatina necessita di modificazioni post-traduzionali sugli istoni:

 regioni trascrizionalmente aperte sono quelle con istoni fortemente acetilati e dove viene

rilasciato l’istone H1 importante per condensare i nucleosomi tra di loro

 regioni trascrizionalmente chiuse, che formano il solenoide, sono regioni meno accessibili ai

fattori di trascrizione perché gli istoni sono più condensati al DNA grazie a una riduzione dei

livelli di acetilazione sugli istoni del nucleosoma e grazie al reclutamento di alti livelli

dell’istone H1 MODIFICAZIONI ISTONICHE

L’eucromatina è una struttura più rilassata che permette ai fattori di trascrizione di accedere alle



sequenze target ed attivare la trascrizione stessa. Acetilazione degli istoni

Nell’eterocromatina le code N-terminali sono fortemente deacetilate, ma è possibile osservare

metilazione degli istoni e del DNA soprattutto nelle regioni definite isole CPG.

Esiste un forte equilibrio tra acetilazione e deacetilazione che consente di mantenere lo stato

cromatinico correttamente regolato per la regolazione dell’espressione genica.

Le HATs sono suddivise in due famiglie:

 Tipo A: localizzazione nucleare, acetilano gli istoni condensati nel nucleosoma, in reazioni

strettamente associate all’attività trascrizionale

 Tipo B: localizzazione citoplasmatica, acetilano gli istoni che sono stati appena sintetizzati,

prima che questi vengano incorporati durante la replicazione del DNA. Marcatori tipici degli

istoni appena sintetizzati sono acetilazione K4 e K12 dell’H4

Le HDACs sono suddivise in diverse classi:

 Classi I, II, IV comunemente chiamate solo HDACs

 Classe III, costituita da enzimi NAD-dipendenti, chiamate sirtuine

Le HDACs hanno una bassa specificità per il substrato, quindi un singolo enzima è in grado di

deacetilare diversi siti nello stesso istone. La specificità può essere attribuita nel complesso di HDACs

da altre proteine.

Per quanto riguarda l’acetilazione delle

lisine, target delle HATs, possono creare

una piattaforma di aggancio per altre

proteine, ad esempio riconoscono lisine

acetile i bromodomini.

È possibile ottenere una cascata di eventi

dove la modificazione delle HATs sulle

lisine crea un segnale per il reclutamento

di proteine con un bromodominio che

molto spesso sono HATs stesse, che

quindi riescono successivamente ad

apportare modifiche sugli istoni



fiancheggianti. Ad e. dominio PHD fingers.

La metilazione degli istoni può avvenire sia sulle lisine che sulle arginine; gli enzimi in questione

vengono chiamati iston-metiltransferasi (KMTslisina, PRMTsarginina)

 Metilazione delle lisine: avviene attraverso step successivi, dapprima la mono, poi la di e la

tri metilazione. Gli effetti sulla cromatina sono diversi a seconda del residuo metilato.

o K9, K27 su istone H3silenziamento genico e formazione di eterocromatina

o K4, K79, K36 su istone H3apertura della cromatina

Metilazione delle arginine: avviene prima attraverso una monometilazione e successivamente può

seguire una dimetilazione che può essere simmetrica o asimmetrica. I siti tipicamente modificati

sono costituiti dalle sequenze RGG o RXR (R=arginina, G=glicina, X=qualunque aa). Gli enzimi

coinvolti sono PRMT1 e PRMT5; nei modelli murini KO si è osservato che la perdita di funzione di

entrambi i geni non è compatibile con la vita.

Il ruolo delle metiltransferasi su arginina è importante non solo per la regolazione della

trascrizione genica, essendo ubiquitariamente espresse, controllano anche la crescita cellulare, la

proliferazione, il differenziamento.

La metilazione degli istoni è in grado di reclutare proteine che contengono dei Tudor domains;

proteine che svolgono ruolo fondamentale nella trascrizione genica.

Esiste una interazione tra le modificazioni istoniche chiamato cross-talk che può essere di diverso

tipo:

 antagonismo competitivo, in cui lo stesso residuo di un istone può essere differenzialmente

modificato:

o acetilazione apertura della cromatina

o metilazione chiusura della cromatina

 il legame di una proteina ad una particolare modificazione può andare ad alterare

modificazioni adiacenti

 l’attività di un enzima può andare ad alterare la modificazione di un substrato

Ci può essere cooperazione tra le varie modificazioni

 la metilazione della lisina K4 dell’istone H3, che correla con un significato positivo e quindi

di apertura della cromatina, è in grado di attivare la successiva acetilazione non solo delle

lisine presenti nell’istone H3 stesso, ma anche nelle lisine dell’istone H4.

 la metilazione in lisina K9, che ha un significato di chiusura della cromatina, va ad inibire

l’acetilazione sia su H3 che su H4 attivando invece la deacetilazione.

 la fosforilazione in serina 10 dell’istone H3 attiva successivamente l’acetilazione delle lisine

presenti sullo stesso istone.

La teoria del codice istonico definisce che le modificazioni post-traduzionali possano creare dei siti

di aggancio per il reclutamento di altri fattori che rimodellano la cromatina.

 Qui ad esempio è indicato come i residui acetilati degli istoni possano reclutare proteine

contenenti dei bromodomains, che spesso sono esse stesse iston-acetiltransferasi (HAT)

in grado di attivare una serie di eventi a cascata che consentono l’acetilazione dei vari

istoni uno in seguito all’altro.

 Per quanto riguarda l’eterocromatina è

stato possibile osservare che la

metilazione degli istoni è in grado di

richiamare proteine contenenti dei

chromodomains, e questo è spesso

correlato a proteine che possono esse

stesse metilare gli istoni o reclutare

iston-metiltransferasi.

Possiamo distinguere diverse categorie di proteine che agiscono sulla cromatina:

 Writers, proteine in grado di apporre le modificazioni post-traduzionali, come HATs, HMTs,

PRMTs e chinasi

 

Readers contengono quei domini che possono essere reclutati tramite le modificazioni

post-traduzionali, bromodomains, chromodomains, PHD-fingers domains. Queste proteine

che “leggono” sono in grado di comunicare il segnale di trascrizione aperta o chiusa

 Erasers, proteine come HDACs, KDMs, fosfatasi che catalizzano la rimozione della

modificazione.

Il codice istonico interagisce con numerosi altri meccanismi epigenetici, come la metilazione del

DNA, la deposizione di nuove varianti istoniche, l’organizzazione nucleare, gli RNA non codificanti e

i rimodellatori della cromatina, per ottenere un risultato univoco a livello trascrizionale.

VARIANTI ISTONICHE

Per gli istoni H4 e H2B esiste solo la forma canonica mentre per H2A esistono 3 varianti definite

con H2AX, H2AZ, macroH2A e per H3 altre due: H3.3 e CENP-A.

Tali varanti conferiscono funzioni diverse alla cromatina:

 H2AZ provoca instabilità genomica

 H2AX attiva meccanismi di riparo del DNA

 MacroH2A è associato all’inattivazione del cromosoma X

 H3.3 è associato a zone trascrizionalmente attive

 CENP-A è associato ai centromeri (è la variante centromerica del canonico istone H3)

Istone H3

L’istone H3 ha due varianti canoniche che sono H3.1 e H3.2 diffuse durante la replicazione (fase S),

quindi sono istoni assemblati durante la replicazione del DNA. H3.3 invece viene assemblato fuori

dalla fase S cioè c’è un picco di espressione non correlata alla fase di replicazione.

La sequenza proteica di H3.1 rispetto ad H3.3 varia di 4 aminoacidi che possono subire

modificazioni post traduzionali molto diverse.

I marcatori maggiormente presenti sono di trimetilazione di lys4, acetilazione lys9, 18 e 23 e

metilazione in lisina k79.

Avendo significato funzionale completamente diverso H3.3 non può essere incorporato in un

nucleosoma in cui troviamo H3.1. C’è un picco di espressione di H3.3 nel differenziamento

cellulare perché non c’è replicazione.

CENP-A

È la variante centromerica, si trova solo nei centromeri.

Se over espresso, può diffondersi lungo il cromosoma.

Nonostante non sia ancora chiara la funzione di CENP-A, i meccanismi alla base del reclutamento

ci fanno capire che è la struttura della cromatina che consente a CENP-A di essere integrato.

E’ fondamentale per la corretta segregazione: CENP-A ha un picco in fase G2 dopo la replicazione

del DNA e prima che avvenga la divisione mitotica per consentire una corretta segregazione dei



cromosomi. (Le mutazioni omozigote nei topi KO per CENP-A danno la mortalità nel topo).

I nucleosomi che hanno H3.3 sono molto meno stabili rispetto a quelli che hanno H3.1 e ciò è

importante perché durante la trascrizione i nucleosomi devono essere maggiormente dinamici e

devono essere rilasciati dalla cromatina per consentire l’accesso ai fattori di trascrizione.

 H3.3 non viene ereditato perché durante la replicazione sono ereditati solo H3.1 e H3.2.

Quindi partendo da una regione trascrizionalmente attiva dove c’è H3.3 con le sue

modificazioni post traduzionali, dopo la replicazione H3.3 viene sostituito da H3.1 così non

preserviamo l’info che quel gene deve essere trascritto ma succede che ad opera di

chaperonine (es HIRA) l’istone H3.1 viene sostituito da H3.3 e gli istoni H3.3, già assemblati

con le modificazioni post traduzionali, comunicano l’informazione epigenetica agli istoni

H3.3 neo assemblati.

La modificazione post traduzionale già presente riesce a reclutare proteine che modificano

l’istone fiancheggiante appena incorporato che trasmette l’informazione epigenetica.

H2AZ

Viene sintetizzato lungo tutto il ciclo cellulare ed incorporato nella cromatina al di fuori della

replicazione del DNA (fase S).

 Definisce quali sono le regioni di confine tra domini cromosomici con funzioni diverse.

 Nella corretta segregazione dei cromosomi

 Nella replicazione

 Nel riparo del DNA

 Si trova spesso nelle regioni regolatrici di un gene, viene sostituito ad H2A soprattutto nel

promotore.

 Nella regione codificante non è cosi tanto sostituito ad H2A.



Ha un picco nei promotori ed è correlato a silenziamento genico. KO morte durante

gastrulazione.

Nelle cellule di mammifero è possibile vedere che non c’è una corretta segregazione dei

cromosomi e c’è un’interruzione della distribuzione della proteina HP1alpha, specifica per

l’eterocromatina.

Questo indica che, negli eucarioti superiori, H2AZ è coinvolto nel confinare HP1alpha in regioni

specifiche e, quindi, nel mantenimento dell’eterocromatina.

H2AX

Possiede nella regione C terminale che contiene una serie di aa tra cui la serina.

La serina 139 è l’unico aminoacido che può essere fosforilato su questo istone dopo danno al DNA

a doppia elica grazie alla chinasi ATM.

La fosforilazione della serina 139, quindi di H2AX, porta ad una cascata di eventi che attiva una

serie di proteine che attivano il riparo del DNA stesso.

MacroH2A

È formato da due domini: un istone che è simile al canonico H2A ed uno che non è omologo a

nessuno degli istoni.

Questa variante è più grande dell’istone normale e viene assemblato nel cromosoma X inattivo. La

sua incorporazione non inattiva il cromosoma X ma è fondamentale per il mantenimento

dell’inattivazione dell’X. ETEROCROMATINA

L’eterocromatina si trova in regioni strutturali dei cromosomi come centromeri e telomeri ma

anche in domini interdispersi, infatti stabilizza le sequenze di DNA altamente ripetute per evitare

fenomeni di ricombinazione che avvengono tra regioni omologhe di DNA.

L’eterocromatina ha un ruolo nell’espressione genica, durante il differenziamento cellulare nello

sviluppo.

Questo tipo di condensazione della cromatina viene ereditato stabilmente attraverso cicli di

divisione cellulare.

In genere in quasi tutti gli organismi passando da una regione attiva trascrizionalmente si vede la

metilazione in lisina K4 e acetilazione in lisina K9, queste modifiche devono esserci tutte.

Nell’eterocromatina c’è la mancanza di lisina K9: ciò consente attraverso il codice istonico di

reclutare proteine che marcano esse stesse la cromatina