Enzimi in Biochimica

Sostanze tossiche e inibizione enzimatica

Diverse sostanze tossiche, come i metalli pesanti (mercurio, piombo), agiscono come inibitori non competitivi di enzimi. Questi metalli pesanti inibiscono numerosi enzimi agendo sui gruppi -SH di residui di cisteina dell'enzima o di cofattori enzimatici. Ciò comporta una riduzione della velocità massima, mentre la Km rimane invariata, indicando che non cambia l'affinità dell'enzima per il substrato. La cisteina è un amminoacido polare non carico che stabilizza le strutture terziarie e quaternarie attraverso ponti disolfuro (reazione di ossidazione).

Inibizione irreversibile

Gli inibitori irreversibili possono formare legami covalenti, eliminando i gruppi funzionali essenziali per l'attività degli enzimi, o stabilire associazioni non covalenti stabili. Tra questi, gli inattivatori suicidi costituiscono una classe significativa. Questi composti sono relativamente stabili fino a quando si legano al sito attivo di uno specifico enzima.

enzima.Gli inattivatori suicidi attraversano una serie di passaggi chimici, e anziché essere convertiti nel normaleprodotto inattivatore, si trasformano in composti altamente reattivi che si legano irreversibilmente all'en-zima.

Gli inattivatori suicidi sono cruciali nella progettazione di farmaci, poiché devono essere specifici per un sin-golo enzima e diventare reattivi solo una volta raggiunto il sito attivo dell'enzima. Questi farmaci offrono ilvantaggio di limitare gli effetti collaterali.

Tuttavia, un inibitore irreversibile può agire senza formare un legame covalente. Molecole simili allo stato ditransizione di una reazione specifica possono legarsi all'enzima con un'alta affinità. Queste molecole, deno-minate analoghi dello stato di transizione, si legano in modo più stretto all'enzima rispetto al substrato nelcomplesso enzima-substrato (ES). Una volta legati, questi analoghi dello stato di transizione non si

disso-ciano più.Ci sono diverse categorie di inibitori irreversibili, tra cui reagenti gruppo-specifici che si legano a specificigruppi funzionali, analoghi del substrato e analoghi dello stato di transizione. Gli inibitori suicidi sono com-posti che si legano al sito di legame per il substrato e vengono trasformati dall'enzima in un composto cheblocca irreversibilmente l'enzima stesso.

Inibitori suicidiQuando si lega all'enzima, subisce una serie di reazioni chimiche che costituiscono parte del meccanismod'azione dell'enzima. Tuttavia, anziché essere trasformato in prodotto, viene convertito in un composto chesi lega irreversibilmente all'enzima, bloccandone l'attività. Un esempio di questo processo è la penicillina,che inattiva irreversibilmente la glicoproteina transpeptidasi, un enzima batterico coinvolto nella sintesidella parete batterica.

Enzimi allostericiVariazioni nella conformazione dell'enzima, indotte da

Uno o più modulatori, determinano la transizione tra forme meno attive e più attive. I modulatori degli enzimi allosterici possono fungere sia da attivatori che da inibitori, e in molte situazioni, il modulatore coincide con il substrato stesso. Gli enzimi regolatori, in cui substrato e modulatore coincidono, sono noti come omotropici. Ad esempio, nell'emoglobina, il legame dell'ossigeno (ligando o substrato) provoca cambiamenti conformazionali che convertono una conformazione relativamente inattiva (stato T) in una conformazione attiva (stato R). Il sito attivo dell'enzima in questo caso svolge anche il ruolo di regolatore. Quando il modulatore è una molecola diversa dal substrato, l'enzima è definito eterotropico. Gli enzimi eterotropici possono agire come attivatori o inibitori, regolando l'attività enzimatica da alta a bassa. Gli effettori eterotropici si legano a siti differenti rispetto a quelli del substrato.

Importante distinguere i modulatori dagli inibitori incompetitivi e misti, poiché gli inibitori non causano necessariamente variazioni conformazionali tra forme attive e inattive, sebbene anch'essi si leghino a siti diversi dal sito attivo. Gli enzimi allosterici sono dotati di siti regolatori specifici per i modulatori, che possono essere omotropici o eterotropici.

Nel caso della modulazione positiva, la seconda subunità, in cui si trova il sito di legame per il substrato, si lega al modulatore, consentendo all'enzima di svolgere la sua funzione. Invece, nella modulazione negativa, gli effettori si legano al sito regolatore, causando cambiamenti conformazionali che impediscono al substrato di legarsi e, di conseguenza, l'enzima non può esercitare la sua funzione.

Gli enzimi allosterici non seguono il comportamento descritto dalla cinetica di Michaelis-Menten. L'andamento è sigmoidale. K0.5 rappresenta la variazione della velocità di una reazione.

catalizzata da un enzima allosterico in relazione alla concentrazione del substrato. Dalla curva sigmoidale, è possibile determinare il valore di [S] che corrisponde a una V0 pari alla metà della velocità massima. Tuttavia, questo valore non può essere assimilato a Km, poiché l'enzima segue un modello cinetico diverso da quello di Michaelis-Menten. Pertanto, viene utilizzato il simbolo K0.5 o [S]0.5 per indicare la concentrazione del substrato associata alla metà della velocità massima in una reazione catalizzata da un enzima allosterico.

La cinetica sigmoidale riflette l'esistenza di interazioni cooperative tra le subunità di una proteina enzimatica, mediate da interazioni non covalenti. La curva sigmoide di un enzima omotropico presenta somiglianze con la curva di saturazione dell'ossigeno nell'emoglobina. Questa curva rappresenta un ibrido, poiché a basse concentrazioni di substrato, l'enzima

predomina principalmente nello stato T, mentre, a concentra-zioni elevate di substrato, prevale principalmente lo stato R.

Andamento iperbolico

Questo è il tipico andamento cinetico di un enzima non regolatore. In presenza di un modulatore positivo, la curva si sposta verso sinistra, con una diminuzione del valore di K0.5; al contrario, in presenza di un mo-dulatore negativo, la curva si sposta verso destra, con un aumento della K0.5. La curva centrale rappresenta la relazione tra la velocità della reazione e la concentrazione del substrato in assenza di modulatori.

Inibizione a feedback o retroattiva (modulazione allosterica)

Nel contesto di una via metabolica multistep, l'enzima iniziale è di tipo allosterico e subisce un'inibizione allosterica da parte del prodotto generato nell'ultima fase della via metabolica. L'enzima A catalizza la trasformazione del substrato in B, successivamente B è convertito in C, e infine C viene trasformato in D.

Ogni singola reazione è mediata da un enzima specifico. In determinate circostanze, l'accumulo del prodotto finale D può agire come inibitore sull'enzima A, impedendo così al substrato di legarsi all'enzima e di iniziare il processo metabolico. Modulazione covalente reversibile In un'altra categoria di enzimi regolatori, l'attività è soggetta a modificazioni covalenti che coinvolgono uno o più residui amminoacidici nella molecola enzimatica. Gruppi fosforilici, acetilici, adenilici, uridilici, ossidrilici, solforici e adenosina difosfato ribosio vengono utilizzati per alterare le proteine. Anche proteine complete, come l'ubiquitina, possono essere impiegate per la modifica covalente di altre proteine con cui interagiscono. Quando un residuo amminoacidico subisce una modifica, l'enzima acquisisce un nuovo amminoacido con proprietà distintive. L'introduzione di una carica, ad esempio, può

modifi-care le caratteristiche dell'enzima e indurre un cambiamento nella sua conformazione, facilitando, ad esempio, l'associazione con una membrana.

Le modificazioni più comuni includono:

1. Fosforilazioni: Catalizzate dalle chinasi, coinvolgono il legame tra gruppo fosfato e l'enzima. I gruppi fosfato derivano dall'ATP e si legano a specifiche catene laterali di amminoacidi come Tyr, Ser, Thr, e His. Questa modifica è cruciale per numerose vie di regolazione.
2. Acetilazioni: Mediate dalle acetilasi, coinvolgono l'attacco di gruppi acetilici a residui di Lisina e am-mino-terminale. Circa l'80% delle proteine, inclusi molti enzimi, presenta il gruppo amminico terminale in forma acetilata.
3. Ubiquitazione: L'ubiquitina viene unita alle proteine per segnalare la loro degradazione proteolitica.
4. Metilazioni: Catalizzate dalle metilasi, coinvolgono l'attacco di gruppi metilici a residui di Lisina e Ar-ginina.
5. ADP-ribosilazione:

L'ADP-ribosio viene donato dal NAD (nicotinammide adenin dinucleotide) e regola processi come la fissazione dell'azoto. La tossina difterica e la tossina del colera catalizzano l'ADP-ribosilazione, causando l'inattivazione di enzimi essenziali per la cellula. Regolazione mediante fosforilazione/defosforilazione La fosforilazione o defosforilazione di residui di Ser coinvolge l'aggiunta o la rimozione di un gruppo fosfato. Questo processo introduce un residuo carico e ingombrante in una regione della proteina che originariamente era moderatamente polare. Gli atomi di ossigeno del gruppo fosforico possono stabilire legami idrogeno con gruppi specifici di una proteina, come il gruppo ammidico all'inizio di un'α-elica o il gruppo guanidico carico di un residuo di arginina. Le due cariche negative della catena fosforilata possono respingere residui adiacenti che presentano cariche negative, come acido aspartico (Asp) o glutammico (Glu). Quando la

La catena laterale modificata si trova in una regione critica per il mantenimento della conformazione tridimensionale dell'enzima. La fosforilazione può influire sulla sua conformazione, influenzando così il legame del substrato e la catalisi. Questo tipo di modulazione covalente è la più comune ed è controllata da due categorie di enzimi modificatori: le chinasi, che aggiungono il gruppo fosfato, e le fosfatasi, che lo rimuovono. Le catene laterali di questi residui amminoacidici sono polari ma non cariche, e il legame tra l'idrossile (OH) e il gruppo fosfato costituisce un legame fosfoesterico. La fosforilazione può attivare o inibire alcuni enzimi, e la proteina-chinasi e la proteina-fosfatasi che regolano questo processo sono spesso coinvolte in cascata di fosforilazioni scatenate da segnali. La fosforilazione può inibire o attivare un enzima. Il glucosio 1-fosfato può essere utilizzato per sintetizzare ATP nel muscolo o.

convertito in glucosio libero nel fegato. La glicogeno-fosforilasi, responsabile della rimozione di unità di glucosio dal glicogeno, presenta due forme: la fosforilasi α (più attiva) e la fosforilasi β (meno attiva).