Ematologia

Malattie del sangue

Programma del corso

• Emopoiesi; biopsia osteomidollare; principi del trapianto di cellule staminali
• Anemie e principi trasfusionali
• Aplasie midollari e sindromi mielodisplastiche
• Alterazioni dei leucociti. Leucemie acute (mieloidi e linfoidi)
• Malattie mieloproliferative croniche e leucemia mieloide cronica
• Linfomi, leucemia linfatica cronica, gammapatie e mieloma
• Sindromi emorragiche: piastrinopenie, coagulopatie congenite

Lezione 1: Emopoiesi, bom, principi del trapianto di cellule staminali

Emopoiesi: definizione

Insieme dei processi che regolano il mantenimento del numero fisiologico di cellule circolanti del sangue in condizioni di omeostasi e intervengono come compenso in situazioni di perdita/distruzione, o per rispondere adeguatamente ad un aumento della richiesta da parte dell’organismo. Questo appare ovvio, ad esempio, quando c’è una perdita ematica post-traumatica o in caso di appendicite, in cui i globuli bianchi aumentano fino a 30.000/40.000 in pochissimo tempo.

Gli organi del sistema emopoietico

• Milza e fegato (solo nella fase di sviluppo; nell’adulto solo in alcune condizioni patologiche)
• Midollo osseo (con progressiva restrizione di sede nell’adulto alle ossa piatte; abnorme espansione in alcune condizioni patologiche)
• Organi del sistema linfatico
• Il sangue periferico

L’emopoiesi avviene nel sacco vitellino fino al 4^o mese; dal 4^o mese di gestazione avviene nel midollo osseo e si mantiene per tutta la vita nelle ossa cave. In malattie come mielofibrosi, si può avere emopoiesi a livello di milza e fegato.

Il sistema linfatico

Fanno parte del sistema emopoietico anche gli organi del sistema linfatico, che si distinguono in:

• Primari (generano linfociti da cellule progenitrici immature): midollo osseo e timo
• Secondari (mantengono i linfociti naive maturi e avviano la risposta immunitaria adattiva): milza, linfonodi, tessuto linfatico associato alle mucose (ad esempio nella mucosa gastrica o respiratoria; può essere colpito da linfomi)

La nicchia ematopoietica

L’emopoiesi nell’adulto si svolge nella cavità ossea, nella nicchia emopoietica (sede fisiologica, concetto funzionale). Sono state trovate delle popolazioni cellulari che, se modificate, cambiano la nicchia emopoietica, ad esempio cellule dello stroma, cellule adipose, osteoblasti (i quali non solo contengono fisicamente l’emopoiesi, ma la possono modificare).

Farmacologicamente possiamo agire sull’emopoiesi tramite il paratormone (il paratormone promuove il rilascio di calcio dalle ossa nel circolo ematico).

Proteine che influenzano l’emopoiesi: alcune sono prodotte dalla nicchia ematopoietica, ad esempio alcune citochine, altre sono prodotte esternamente, ad esempio l’eritropoietina.

Cellule staminali

La cellula staminale emopoietica normalmente rimane nella nicchia; alcune cellule passano nel sangue periferico, e questo fenomeno aumenta con alcuni fattori di crescita, ad esempio G-CSF. Il G-CSF sotto forma di farmaco viene usato per far andare le cellule nel sangue periferico, per poi prelevarle ed eseguire il trapianto. Quando si effettua un trapianto, le cellule staminali vengono immesse nel circolo, poi avviene il fenomeno di “homing” (le cellule tornano nella nicchia). È un fenomeno fondamentale per la riuscita del trapianto.

Cellule CD34+

Le cellule CD34 sono cellule staminali, sono abbastanza rare nel sangue periferico, ma aumentano di 50 volte nel sangue periferico mobilizzato. In particolare, si trovano:

• 1-2% nel midollo
• 0.05% nel sangue periferico
• 0.3-0.5% nel sangue cordonale, il cordone ombelicale può essere conservato per il trapianto
• 0.5-3% nel sangue periferico mobilizzato

Le percentuali in condizioni patologiche (mielofibrosi) sono molto più elevate.

Evoluzione delle cellule staminali

La cellula staminale emopoietica è una cellula capace di evolvere verso tutte le filiere delle cellule mature, circolanti del sangue. La cellula staminale è una cellula che si divide poco, la proliferazione avviene a carico delle cellule successive (progenitori che si differenziano). La cellula staminale sta per la maggior parte della propria vita in fase G0 (questo è vantaggioso perché una cellula che si divide tanto è maggiormente a rischio di errori). Quando una cellula staminale acquisisce una mutazione, diventa una cellula leucemica ed è poco aggredibile dai farmaci.

Sangue circolante

Fa parte del sistema emopoietico anche il sangue circolante (il sangue circolante è un tessuto connettivo specializzato; composto da una parte corpuscolata: formata dai globuli rossi o eritrociti, globuli bianchi o leucociti e dalle piastrine; e da una parte fluida: il plasma). La composizione del sangue si apprezza quando si centrifuga; i globuli rossi occupano il 45%-50% del sangue. Il rapporto tra il plasma e gli elementi corpuscolati del sangue costituisce l'ematocrito.

Eritropoiesi

I processi dell’eritropoiesi sono regolati principalmente dall’eritropoietina, prodotta dal rene e in parte dal fegato. A livello midollare i precursori eritroidi sono ben riconoscibili per le loro caratteristiche morfologiche e si distinguono in:

• Proeritroblasto
• Eritroblasto basofilo
• Eritroblasto policromatofilo
• Eritroblasto ortocromatico

La durata in circolo del globulo rosso è di circa 120 giorni.

Eritropoietina

Se si riduce il numero di globuli rossi, le cellule del rene percepiscono la riduzione di O₂ e producono eritropoietina. L’eritropoietina va nel sangue e stimola il midollo a far maturare gli eritroblasti che producono poi globuli rossi. Questo avviene in caso di perdita ematica. Tutte le malattie del rene provocano una riduzione della produzione di eritropoietina e questo provoca anemia.

Oggi l’eritropoietina è un farmaco, grazie alla tecnologia del DNA ricombinante.

Eritroblasti

Gli eritroblasti nel sangue periferico si possono riscontrare in alcune condizioni patologiche (ad esempio, talassemia).

Reticolociti

Il reticolocito è un giovane eritrocito che si forma dall’eritroblasto ortocromatico per perdita del nucleo e presenta una quota residua di RNA, che viene evidenziata da alcuni coloranti vitali sotto forma di granuli o di un fine reticolo. I reticolociti sono importanti da un punto di vista diagnostico, perché ci danno informazioni sulla funzione del midollo osseo. Nel soggetto con anemia cronica da malattie renali, il numero di reticolociti circolanti è basso.

Eritrociti

Gli eritrociti sono privi di organuli cellulari. Il loro citoplasma è ricco di emoglobina e altre proteine ed enzimi. Hanno una forma di lente biconcava, con un diametro di 7,5 μm, uno spessore di circa 2 μm e di 1 μm nella parte centrale. Tale forma assicura un miglior scambio gassoso. L’eritrocita maturo è anucleato.

Leucociti

I leucociti sono cellule differenti tra loro, che possono essere riconosciuti sullo striscio di sangue periferico. I neutrofili hanno un nucleo polilobato, gli eosinofili hanno un nucleo con due lobi e il citoplasma con granuli arancio, i basofili hanno una concentrazione <1%, sono di colore scuro e il loro aumento è quasi sempre espressione di leucemia mieloide cronica. La formula leucocitaria è il rapporto in percentuale delle cellule nello striscio di sangue.

Piastrine

Le piastrine sono frammenti citoplasmatici ovviamente anucleati di megacariociti (cellule grosse, molti nuclei) (sono le cellule più grosse che si trovano nel midollo osseo). La formula leucocitaria è un esame di routine, tuttavia ci sono dei casi in cui è necessaria l’osservazione dei leucociti al microscopio, ad esempio quando vogliamo osservare: il numero preciso dei granuli e il colore dei granuli.

Funzione dei leucociti

I leucociti svolgono la loro funzione al di fuori del torrente sanguigno, infatti attraversano gli endoteli (diapedesi) ed entrano nei tessuti. La loro sopravvivenza in circolo è varia, di 12 ore circa per i neutrofili fino ai linfociti che sopravvivono per anni. In parte sono "marginati" e possono essere riportati in circolo da sostanze e stimoli diversi (adrenalina, cortisone, infezioni, …). La funzione principale è quella di difendere l’organismo da sostanze estranee (neutrofili e monociti), intervenire nelle reazioni di difesa da parassiti e reagire a sostanze estranee (eosinofili e basofili), regolare le risposte immunitarie (linfociti e non solo).

Linfonodo

Nella corteccia sono presenti i follicoli o noduli linfatici, provvisti di:

• Un centro germinativo, principale sede di formazione dei linfociti B
• Le zone paracorticali, sono invece ricche di linfociti T
• La zona midollare, dove si organizzano cordoni e seni midollari dove si ha prevalentemente l’inizio di maturazione funzionale in plasmacellule che si localizzano poi nel midollo

Il parenchima è formato anche da una complessa rete di fibre reticolari e fibroblasti. I linfociti B e T possono essere riconosciuti usando anticorpi monoclonali, è l’esame di tipizzazione linfocitaria. Nello striscio di sangue sono maggiormente frequenti i linfociti T.

Piastrinopoiesi

La piastrinopoiesi è regolata dalla trombopoietina (prodotta dal fegato), con un meccanismo di feedback positivo. Le piastrine sono distribuite in 2 pool: un pool circolante e un pool splenico (nella milza). Il soggetto che subisce splenectomia avrà un aumento del numero di piastrine circolanti, perché non esiste più il pool splenico (le piastrine sono tutte circolanti).

Valutazione del sistema emopoietico

La valutazione morfologica del sistema emopoietico richiede i seguenti campioni:

• Sangue periferico
• Citoaspirato midollare
• Biopsia osteomidollare

Emocromo

Cosa ci interessa guardare?

• Conta assoluta cellulare
• Emoglobina
• Ematocrito, rapporto in percentuale della massa dei globuli rossi sul volume totale di sangue
• Volume corpuscolare medio, aiuta a capire il tipo di anemia del soggetto
• Contatore piastrine
• Formula leucocitaria differenziale e conta assoluta. Quella assoluta si calcola moltiplicando il numero di globuli bianchi per la percentuale.

Terminologia

• Anemia: riduzione del livello di emoglobina al di sotto del range di normalità (nella talassemia il numero di GR è normale o aumentato).
• Leucopenia: riduzione del numero di leucociti totali al di sotto del range di normalità. È importante distinguere quale leucocita, possiamo avere: neutropenia; linfocitopenia; monocitopenia.
• Piastrinopenia: riduzione del numero delle piastrine al di sotto del range di normalità. (indipendentemente dalla causa!)

Condizione opposta: numero di cellule circolanti aumentato

• Eritrocitosi/policitemia: aumento del livello di emoglobina o del valore Hct al di sopra del range di normalità (si accompagna l’aumento del numero dei GR).
• Leucocitosi: aumento del numero di leucociti totali al di sopra del range di normalità. È importante distinguere quale leucocita, possiamo avere: neutrofilia; eosinofilia; basofilia; linfocitosi; monocitosi. Es. l’appendicite provoca una neutrofilia; leucocitosi è un termine generico, bisogna distinguere la popolazione cellulare.
• Piastrinosi/trombocitosi: aumento del numero delle piastrine al di sopra del range di normalità. (indipendentemente dalla causa!)

Trapianto di cellule staminali ematopoietiche

Si classifica in 3 categorie a seconda del donatore:

• Autologo: il paziente stesso è donatore;
• Allogenico: il donatore è un’altra persona rispetto al ricevente, può essere:
  • Da donatore familiare,
  • Da donatore non familiare volontario (MUD),
  • Da cordone,
  • Aploidentico: il donatore è HLA identico rispetto al ricevente per il 50 per cento, ad esempio un genitore che dona al figlio;
• Singenico: da gemello omozigote.

La probabilità di essere HLA-identico dipende da pacchetti di geni situati sul cromosoma 6. La madre e il padre hanno due pacchetti di geni ciascuno, perciò, dato che sono 4 pacchetti di geni, la probabilità che ci siano due fratelli HLA-identici è pari al 25%, ovviamente non ho un campione di n figli. La condizione cerchiata è la condizione statisticamente migliore per fare un trapianto.

Modalità di trapianto

1. Somministrazione di una chemio-radioterapia mieloablativa (regime di condizionamento) avente lo scopo di:
   • Creare lo spazio midollare per l’attecchimento del trapianto (svuotare le nicchie emopoietiche dalle cellule malate);
   • Determinare l’immunosoppressione necessaria per impedire il rigetto del trapianto;
   • Eradicare il clone neoplastico.
2. Infusione per via endovenosa delle CSE (cellule staminali emopoietiche). Si fa il trapianto vero e proprio: si infondono le cellule staminali nel circolo venoso tramite un CVC, le cellule grazie al fenomeno di “homing”, arrivano nella nicchia.
3. Assistenza e terapia di supporto nel periodo successivo al trapianto.

Le “fasi” del trapianto autologo

Nel trapianto autologo, il paziente ha già raccolto le sue cellule staminali tramite aspirati midollari. Il laboratorio ha già separato e congelato il buffy coat in vapore di azoto, fino al momento del trattamento, giorno 0. Il laboratorio scongela le cellule staminali del soggetto e il medico lentamente le inietta, con delle siringhe, nel sangue del paziente. Nel giorno 0, il chemioterapico deve essere stato smaltito dal circolo.

La fase successiva è l’aplasia, che comporta: rischio di infezioni, rischio di sanguinamento, necessità di trasfusione di globuli rossi. Il paziente deve essere gestito al meglio, con asepsi massima, sterilizzazione di tutto il materiale, acqua filtrata, pronto intervento in caso di infezione; il rischio più temuto è la sepsi. La fase di aplasia dura 15 - 40 giorni. Nella fase successiva, aspettiamo che i granulociti neutrofili arrivino a 500; solo più tardi assisteremo alla produzione di nuovi globuli rossi e nuove piastrine. Si calcola che sia necessario almeno un anno per il ripristino della funzione immunologica. Inoltre, il paziente ha perso la propria memoria immunologica (perciò spesso va incontro ad infezioni virali).

Le “fasi” del trapianto allogenico

Le fasi del trapianto allogenico sono le stesse del trapianto autologo, i farmaci utilizzati sono diversi. In questo caso, le cellule staminali non sono congelate; le cellule sono state raccolte nei pochi giorni precedenti o mediante aspirati midollari multipli o mediante sangue periferico. Anche in questo caso segue una fase di aplasia midollare ma, a differenza del trapianto autologo, questi soggetti fanno farmaci immunosoppressori.

Graft failure = rigetto del trapianto, nonostante la terapia immunosoppressiva che il paziente sta facendo. Si capisce perché continua l’aplasia. Questa situazione accade nell’1-2 % dei casi. In questo caso, se il paziente ha altri fratelli, si può provare a prelevare le cellule staminali da un altro fratello ed effettuare un altro trapianto.

Complicanze del trapianto

Complicanze precoci:

• Danni indotti dalla chemioterapia;
• Complicanze infettive:
  • Batteriche,
  • Fungine,
  • Virali,
  • Protozoarie;
• Malattia veno-occlusiva epatica;
• Cistite emorragica;
• Complicanze polmonari;
• Acute GVHD;
• Rigetto e Perdita del Trapianto (solo in caso di trapianto allogenico)

Definizione: mancato attecchimento delle cellule del donatore. Fattori di Rischio:

• Disparità HLA
• T- deplezione
• Bassa carica cellulare

Graft Versus Host Disease

La principale complicanza e causa di morte nel trapianto allogenico. È la complicanza più grave del trapianto. Per certi versi è l’opposto rispetto al rigetto: sono le cellule del donatore che attaccano i tessuti del ricevente. La GVHD è una conseguenza dell’attivazione delle cellule immunocompetenti del donatore (“graft”) contro il ricevente (“host”) (assente nel trapianto singenico). Questa condizione è esclusiva del trapianto di cellule staminali (non avviene nel trapianto di rene), questo perché noi impiantiamo cellule immunocompetenti, che producono linfociti e anche linfociti maturi. La GVHD è probabilmente la principale variabile di efficacia della procedura trapiantologica. Esiste una forma acuta e una forma cronica (malattia multiorgano con caratteristiche peculiari). La forma acuta avviene nel 20-30% dei casi e in genere si manifesta entro 100 giorni dal trapianto di midollo osseo. La forma cronica in genere si presenta oltre il terzo mese.

Patogenesi

Si manifesta dopo, ma si “prepara” prima del trapianto. La GVHD cronica è l’azione del linfociti delle cellule trapiantate contro le cellule del ricevente. Il momento cruciale è quello precedente al trapianto; il regime di condizionamento genera uno stato infiammatorio → è in quel momento che dobbiamo iniziare gli immunosoppressori.

GVHD acuta

La GVHD acuta si divide in 4 gradi a seconda del danno. La GVHD ha manifestazioni:

• Cutanee: Eritema maculo papulare (con o senza prurito o bruciore), con evoluzione in bolle, a livello dello scollo e della pianta