DNA - Biologia generale

DUPLICAZIONE DEL DNA.

Watson e Crick quando descrissero la struttura del DNA avevano intuito l’essenza della

duplicazione del DNA.

Sulla base dell’appaiamento delle basi posso avere una relazione durante la duplicazione perché

un filamento funziona da stampo mentre l’altro filamento sarà quello di nuova sintesi ovvero

quello copiato.

DIMOSTRAZIONE DI MESELSON E STAHL DELLA DUPLICAZIONE SEMICONSERVATIVA DEL DNA

In linea teorica era possibile supporre 3 diverse modalità di replicazione rappresentate da: un

modello semiconservativo, uno conservativo e uno dispersivo

Nel MODELLO SEMICONSERVATIVO la doppia elica originaria che possiamo anche chiamare

parentale dà luogo a 2 doppie eliche figlie a livello delle quali un filamento è costituito da DNA

originario mentre l’altro è costituito da un filamento di nuova sintesi.

Nel MODELLO CONSERVATIVO ciascun filamento funziona da stampo per 2 filamenti di nuova

sintesi che si uniranno a formare la doppia elica, mentre la doppia elica originaria rimane intatta.

Ottengo 2 molecole di DNA originate da quella originaria però: una da entrambi i filamenti di

nuova sintesi, l’altra da entrambi i filamenti originari.

Nel MODELLO DISPERSIVO ciascuna delle due eliche figlie risultava essere costituita da pezzi di

nuova e vecchia sintesi. Meccanismo più complesso da poter ipotizzare.

Tramite l’esperimento di Meselson e Stahl si è capito che il DNA si duplica in maniera

semiconservativa. L’idea era quello di poter marcare il DNA di nuova sintesi, prendendo dei batteri

e facendoli crescere in una fonte di azoto pesante ovvero il cloruro di ammonio contente azoto 15,

isotopo non radioattivo, ma isotopo pesante. Un altro gruppo in presenza di azoto 14, isotopo più

comune. Facendoli crescere in questi terreni i batteri quando si duplicano incorporano nel loro

genoma o l’azoto 14 o l’azoto 15 a livello delle basi azotate. Se si estrae il DNA da queste 2

popolazioni di batteri sottoponendolo a ultracentrifugazione in presenza di cloruro di cesio, questo

permette di separare il DNA in due bande distinte sulla base della densità, infatti il DNA

proveniente dalla crescita dei batteri in azoto 15 formerà una banda più in basso nella provetta

perché più pesante (centrifugata nel gradiente del cloruro di cesio, si ferma ad un livello del

gradiente dove c’è densità maggiore di cloruro di cesio a causa del DNA pesante). Se invece

prendo le molecole di DNA estratte dai batteri cresciuti in azoto 14 avrò un’unica banda che si

posiziona a livello del gradiente di cloruro di cesio a densità minore a causa del DNA leggero.

Descrizione esperimento= i batteri vengono fatti crescere per molti generazioni in azoto 15; vuol

dire che tutti i batteri conterranno una molecola di DNA pesante, tutti li loro cromosoma batterico

sarà costituito da DNA pesante. Successivamente i batteri vengono trasferiti in un terreno

contenente come fonte di azoto leggero; si aspetta 20 minuti ovvero il tempo che i batteri

impiegano per replicare il loro DNA quando le condizioni sono ideali (ovvero a 37°). Siccome ho

fornito azoto 14, il nuovo DNA di nuova sintesi conterrà azoto 14 e non azoto 15, se estraiamo il

DNA da questi batteri che hanno compiuto un unico ciclo di duplicazione e si sottopone ad

ultracentrifugazione in gradiente di cloruro di cesio, si ottiene un’unica banda. Un’unica banda che

è intermedia come densità rispetto ai punti di riferimento che corrispondo alla banda di DNA

leggera e alla banda di DNA pensante. Così posso escludere il modello conservativo perché

avrebbe permesso di ottenere 2 bande una corrispondente al DNA pensante e una corrispondente

al DNA leggero. Invece avendo un’unica bada che sta ad un livello di densità intermedio tra quello

del DNA leggero e pesante, vuol dire che questa banda contiene tutte le molecole di DNA che

derivano da un unico processo di duplicazione e che sono costituite da un filamento pesante ed

uno leggero.

Il fatto che si fosse creata un’unica banda a densità intermedia poteva far pensare anche ad un

modello dispersivo perché presupponendo due molecole di DNA figlie ciascuna delle quali era

costituita da frammenti di DNA pesante e leggero.

Dunque, con un’unica duplicazione batterica posso escludere solo il modello conservativo ma non

quello dispersivo che può essere escluso solo con la seconda duplicazione. I batteri vengono posti

in un terreno con azoto 14 e si aspettano 40 minuti per far avvenire due duplicazioni. Abbiamo

una prima divisione delle molecole di DNA che danno le prime due molecole di DNA figlie e poi

una seconda divisione da cui se ne formeranno da ciascuna di esse altre due. Da questo

esperimento ottennero di nuovo una banda intermedia perché il DNA pesante non viene

eliminato, una porzione delle molecole di DNA che si formano conterranno un filamento di DNA

pesante, poi però quelle che si originano usando come stampo quello leggero, saranno tutte

leggere e quindi avrò una banda più alta segno della duplicazione semiconservativa ed esclusione

di quella dispersiva. Se ottengo due bande vale il modello semiconservativo.

ORIGINE della DUPLICAZIONE DNA BATTERICO ed EUCARIOTICO.

La duplicazione del DNA batterico è quella

meglio conosciuta, e della quale si hanno

più informazioni.

Inizia a livello di una regione detta origine

di replicazione e dove i due filamenti di

DNA che costituiscono l’elica si separano e

ciascun filamento comincia ad essere

duplicato. La duplicazione procede in

entrambe le direzioni ed è per questo detta

bidirezionale. Queste strutture da cui

comincia la duplicazione si chiamano

forcelle di duplicazione o forche di

replicazione; a partire da un’unica origine

ho 2 forcelle che si muovono in direzioni

opposte duplicando progressivamente tutta

la molecola di DNA circolare fino a

ricongiungersi, formando 2 molecole di

DNA figlie.

Il DNA eucariotico è lineare invece ed organizzato in più cromosomi ed è più lungo, quindi sono

presenti più origini di duplicazione sennò la replicazione sarebbe troppo lenta, per ciascuna origine

parte una replicazione bidirezionale quindi progressivamente i due filamenti si dissociano e

vengono copiati. Le unità di replicazione vengono detti repliconi, e man mano che vengono

duplicati i filamenti i repliconi si ricongiungono per avere una duplicazione completa.

*Prima differenza tra procarioti ed eucarioti→ i procarioti hanno un’unica origine di duplicazione,

mentre nel DNA eucariotico ci sono più origini di duplicazione.

Il filamento stampo è detto parentale mentre quello di nuova sintesi è detto anche filamento

figlio.

PUNTI CHIAVE DELLA DUPLICAZIONE.

1) Le eliche del DNA sono separate e devono essere tenute separate durante la replicazione.

DNA ELICASI e proteine che legano il DNA a singolo filamento per far si che non si riformino

legami ad idrogeno.

2) I superavvolgimenti vengono eliminati dalle TOPOISOMERASI.

3) La sintesi procede in direzione 5’ 3’ la DNA POLIMERASI forma legami fosfodiesterici tra il

3’OH della catena in allungamento ed il 5’P di un nuovo nucleotide.

4) La sintesi necessita di un iniziatore di RNA.

5) La sintesi avviene in modo: Continuo sul filamento guida e Discontinuo (frammenti di

Okazaki) sul filamento ritardato.

6) I frammenti di Okazaki devono essere legati insieme: Intervento della DNA LIGASI.

Un enzima che è la DNA elicasi rompe i legami ad idrogeno tra i due filamenti e li rompe in

1 maniera ATP dipendente in modo tale che si formi la bolla di replicazione con le due forcelle.

Progressivamente le elicasi scorrono lungo il DNA aprendolo, circa mille nucleotidi vengono

separati in un secondo e intervengono anche proteine che legano il filamento singolo, dette SSP, in

modo tale che non si riformino legami a idrogeno

2 I superavvolgimenti vengono eliminati dalle topoisomerasi.

Quando vengono separati i due filamenti, l’estremità dei cromosomi non è libera di ruotare per cui

si formano dei superavvolgimenti. Questi superavvolgimenti devono essere eliminati sennò

l’enzima che catalizza la duplicazione del DNA, ovvero la DNA polimerasi si trova di fronte un

intreccio che non può essere sciolto. Ci sono perciò degli enzimi detti topoisomerasi che

catalizzano l’eliminazione dei superavvolgimenti facendo dei tagli sul DNA in modo tale da far

passare un filamento sopra l’altro.

Esistono due tipi di topoisomerasi:

• Topoisomerasi I: taglio di un solo filamento.

• Topoisomerasi II: taglio di entrambi i filamenti.

3+4

Quando tutto è pronto interviene l’enzima chiave della sintesi del DNA detta DNA polimerasi: nei

procarioti ne esistono 3, negli eucarioti ne esistono molte di più.

L’enzima catalizza l’aggiunta di nucleotidi formando legami fosfodiesterici per creare un filamento

di nuova sintesi. Questo enzima ha una particolarità: necessita di un 3’ ossidrile a cui attaccare i

nucleotidi (un filamento può crescere solo in direzione 5’→ 3’, infatti la DNA polimerasi riesce a

catalizzare la sua regione solo aggiungendo un nucleotide all’estremità 3’). La DNA polimerasi

aggiunge nucleotidi al 3’ ossidrile muovendosi in direzione 5’→ 3’ e leggendo lo stampo in

direzione 3’→ 5’.

La DNA polimerasi usa i nucleosidi trifosfato come substrato, si scinde il legame a partire dal

nucleotide trifosfato e il fosfato legato al carbonio

in posizione 5, viene unito al 3’ ossidrile del

nucleotide precedente, inoltre viene eliminata una

molecola di pirofosfato scissa in 2 ioni fosfato che

serve per spostare la reazione verso destra.

Dunque, l’energia per la formazione del legame

fosfodiesterico, reazione anabolica, viene fornita

dalla scissione del legame presente a livello del

nucleotide trifosfato (legame ad alto contenuto

energetico). La sua scissione permette la

formazione del legame fosfodiesterico.

Se all’inizio quando i due filamenti sono aperti,

non c’è un 3’ a disposizione perché ancora non ho

filamenti di nuova sintesi, si ha l’intervento di un

enzima detto RNA primasi, il quale è una RNA

polimerasi che catalizza la sintesi di un breve

pezzetto di RNA, fatto da circa una decina di nucleotidi, per questo si chiama innesco o primer.

l’RNA polimerasi a differenza della DNA polimerasi non necessita per iniziare la sintesi della

presenza di un 3’ ossidrile di un nucleotide, ma possono iniziare la sintesi ex novo. Questo breve

filamento fornisce il 3’ ossidrile a livello del quale la DNA polimerasi può cominciare la sintesi del

filamento.

5 La sintesi avviene in modo cont