Biologia molecolare (quarta parte-funzione genica mirata a un gene, gene targeting, topi KO)

22-NOVEMBRE 2018

ANALISI DELLA FUNZIONE GENICA MIRATA A UN GENE

Viene svolta nel topo perché prima della scoperta del RNA interferente, il KO non si poteva fare nell'uomo. Si può fare anche nel lievito, drosophila e zebra fish.

TRANSGENESI STANDARD:

Come si fa a produrre un transgenico? Cioè un topo nel cui genoma è stato inserito un gene. Quindi, per indicare che cosa succede al fenotipo del topo dopo l'inserzione di un gene che non appartiene al topo. Si inietta il DNA clonato in seguito e s'inserisce in una topo, questo genererà e poi si analizza la progenie. I topini che nascono sono eterozigoti. Questi si incrociano e si avrà un topo omozigote che esprime il gene inserito.*Ad esempio MYC.

Caratteristiche del transgene: deve selezionare seq. codificante, deve clonar nel vettore il cDNA del gene (cioè il gene che ha gli esoni). Il DNA che s'introduce nel vettore deve anche avere il promotore, seq terminatore. Si può anche inserire una parte in vitro la mia. La difficoltà di espressione di un transgene in un particolare tessuto.

• *Tra i nati la probabilità di integrazione è del 10-30%.
• *Il DNA genomico si inserisce alle loci del bis che succede quando si integra nel genoma del topo non è predicibile: si predice toprio casualmente il transgene.

*³ se il trasgene non è esprime oppure si grammi DNA è inserire una parte della di DNA negli esoni della i topi di non è problemi di posizioni in non in vicinanza casualmente nel genoma del. topo si avvicina inserisce solo trascrizione, se la sites frame, si attiva regioni. Ad esempio il transgene topo ma si finisce fa altre regioni. La cappa della transgenesi standard è da articile.

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22-NOVEMBRE 2018

ANALISI DELLA FUNZIONE GENICA MIRATA A UN GENE

Viene svolta nel topo perchi prima della scoperta del RNA interferenza, il KO non si poteva fare nell'uomo. Si può fare anche nel lievito, drosofila e zebra fish.

TRANSGENESI STANDARD:

Come si fa a produrre un transgenico? Cioè un topo nel cui genoma è stato inserito un gene. Quindi per studiare che cosa succede al fenotipo del topo dopo l'inserzione di un gene che non appartiene al topo. Si inserisce il DNA clonato o amplificato e inseriamo in una topo questo gene e poi si analizzano fa progenie. I topini che nasceranno sono eterozigoti. Questi si incrociano e si avrà un topo omozigote che esprime il gene introdotto. Ad esempio MYC.

Caratteristiche del transgene: deve sufficienta al gene desiderato, deve clonato nel retro il cDNA del gene (fisso il gene che ha gli esoni). Il DNA che si introduce nel vettore deve anche avere il promotore, che è riconosciuto per trascrivere il transgene. Si può anche inserire una coda di poli A per terminare la trascrizione. La specificità di espressione di non particolare tessuto è data anche quando il trasgene si integra nel genoma del topo non è predicibile e può finire in altre regioni.

* Tra i vari la probabilità di integrazione è del 10-30%: se il DNA genomico al sito di inserzione del topo per stabilità, con il transgene non si integra ed enzima.

* Ad esempio, il transgene non si esprime oppure si esprime troppo e finisce in altre regioni: se il topo è transgenico o è inserito nel genoma del topo e non è prediciile produce il transcrito che si inseriscono casualmente nel genoma del topo in vario recluto a regioni di eliminazione, ad esempio non si riescono a controllare.

Le scopo della transgenesi standard è da studiare.

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-> un guadagno di funzione, e quindi esprimere un gene esogeno (transgene) in uno o più tessuti dell’animale.

Per farci esprimere il transgene solo nel cervello, ad esempio, si deve mettere, quando si clona il gene, un promotore tessuto specifico che transcrive solo nel cervello.

Microiniezione del DNA: si inietta il DNA nell’ oocita appena fecondato. Si deposita con una micromanipiga 1-2 pirolitri di DNA che contengono 100-200 copie del gene da inserire. A monte del gene (cDNA) da trasferire nel pronucleo dell’ oocita si usa una seq promotore che esprimerà il gene in tessuto-specificità.

Un promotore ubipichioso invece si esprime in tutte le cellule del topo.

Il topo che nasce è uno chimera o mosaico da cellule con patrimonio genetico diverso.

Limiti della tecnologia: - integrazione causale del transgene nelle regioni nonomominide con ripercussioni variabili sull’ espressione del transgene. - Integrazioni in zone di DNA silenti nella cromatina addensata e chiusura ai contaminini

- Mutagenesi inserzionale da caricoette nell’ inattiavato di geni anologoni causata dall’ inserzione del transgene in regioni codificanti e regolatorie.

Un modo per superare questi limiti è fare microiniezione di ripioini genomici ossai y cromisomi mei cromosomi artificiali di lievito (YAc)

Perché in questi segmenti con ausili di mateirali genomico si trassoce balle le cep che isolano il loco transgenico delle plessiture esterne.

Di fatti il topo transgenico senza costrioni si può ottenere la srepressione del transgene.

ALZHEIMER

quando si vuole trovare un target in una terapia si studiano i modelli putativi di linee cellulari simili alla patologia da si studia.

É stato prodotto il topo transgenico dell'Alzheimer, perché nella progenie si ha una mutazione genica e quindi si è cercato di produrre il topo con la proteina alterata dai presi ma ha tutti i sintomi dell'uomo. Sino stati prodotti dei topi in cui è stato inserdato uno forma mutata nel cervello di topi della proteina precursore della amiloide umana.

Nei cervelli affetti da Alzheimer si sono placche amiloidi sui masconi: agglomerati neuropibillari. I precursori di queste placche derivano della proteina APP. C'è il topo transgenico con tanta APP perché i ricercatori hanno ipocato che aumentando tanta APP si potesse avere un topo con Alzheimer. Oltre alla APP, c'è la β-secretasi e due gene della presenilina 1 e 2 ed è questo stato fatto un modello di Alzheimer secondo il gene della presenilina. Si è anche visto che esiste anche in polio morphismo per il gene della apolipoproteina E, allora hanno cercato di produrre un topo da espressione APOE che anche se il topo manifestasse i sintomi dell'Alzheimer.

ESPRESSIONE ECTOPICA

esiste un metodo con cui ni può incidenti un popolo stati utilizzato mostrato l'espressione di un transgene uomo. Si usa in constructive il gene addizionato la tinina kinasi del visco dell'erpes (HSV-TK) sotto il controlo di un promotore che ne permette l'espressione nella popolazione cellulare di eliminazione. Quinde se aggiungo ganciclovir nelle cell che esprimono la tinina-kinasi queste to fogorilano e andoi il ganciclovir blocca la sinetsi del DNA.

GENE TARGETING: manipolazione mirata del genoma del topo. Si elimina un determinato gene, mediante la ricombinazione omologa, cioè uno scambio di materiale genetico fra due seq omologhe: una è il gene bersaglio, e l'altra il vettore per la ricombinazione. Quindi si ha un costrutto di gene che genera ricombinato col gene omologo, e sostituisce fa eliminabile. Per fare gene targeting uso le cell embrionali staminali (ES). La ricombinazione avviene solo no poche delle alleli esposte allora si devono trovare sistemi che aumentano l'efficienza della ricombinazione omologa che si esegue in cell coltivate ex-vivo da possono essere reintrodotte. Ad esempio, si ha il MYC endogeno che voglio eliminare, quindi faccio in due il MYC da modifico e sostituisco a MYC endogeno in modo da eliminare MYC nel genoma del topo. Ma questo sistema in vivo non è molto efficace. Allora si adotta un sistema in vitro col KO e poi ci in ad simulare in vivo quello che è stato manipolato. C'è la presenza nel costrutto del transgene di due bracci di omologia al locus gene dove si vuole modificare interrotto della mutazione introdotta (da solo ho una cassetta di espressione per un marcatore di selezione positivo che selezionerà e sostituirà un seq. esonica stopp.). La scarsione più usata è il gene codificante la resistenza all'antibiotico G418 (neomicina). C'è MYC che voglio eliminare e clono nel costrutto il MYC con il gene resistente alla neomicina. I due geni (endogeno ed esogeno) a cambiano. Al posto del MYC endogeno vi mette il gene da non funziona più e in voglio fare il KO adi cell in vivo al梅mento la ricombin baciare omologa sono quella nvirtubila alle mamiici a es. no quella di autosovra.

Si inseriscono nel topo solo le cellule in cui è avvenuta la ricombinazione omologa per avere il KO. Elimino le cell di non hanno ricombinato mettendoci il marcatore minino-chinasi.

L'integrazione tramite ricombinazione omologa genera un allele difettivo in cui c seg genominio compreso tra le 2 bracce di omologia sono sostenute nelle stesse seg costituente nel vettore.

trametta il DNA clonato nelle att dominandi che ci inserliamo (solo quelle così costituenti c seg sennalzata la ricombinazione altraologa) nelle blastocisti del topo aprendo-giurdico e poi la procedura è uguale a quella della trasgenesi standard il c nell'ES mugno belle note della massa considerere interne delle blastocisti e moltecento in coltura in presenza di fattori che ne supplicaziono il differenziamento così le ES monotipano la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta identificatoche in embrione.

Un topo KO fu oscillivato c il 1987 (Lucia e mantagni).

TOPI KO CONDITIVI: devano trovare dei modi per rendere il KO

individuale e non resistitivo

Cre-lox: meccanismo di ricombinazione del fago P4 con siti lox e la ricombinante Cre. Si costruiscono vettori con le regioni genofiche da eliminare con siti lox all'interno con c persone avere topi transgenici c seg quindi c lox ista ista l'indici disdico d riportato con l'apression della ricombinazione Cre present-cretifica c più rire occurzioni il KO del gen sole in particolare tenante colico n sesquima o n indica Cre. Praticamente c hanno dei lox (2 seq palindrome di 13 bas) chiamati lox-P pico moscriti da Cre che taglia ed elimina le seq di DNA che predominano c non siti al ricombinamento che avica i lox-P c la condizionale azione grazie alla ricombinazione tro questi 2 siti.

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Si vuole eliminare il gene de n clona in modo che fiancheggi i Lox-P, si aggiunge Cre che taglia i Lox-P eliminando il gene.

Si elimina il gene target solo nelle cell che esprimono Cre cui che eliminati il gene. E il modo per fare KO condizionale perché faccio si di eliminare il gene solo nelle cell che riconoscono Cre, e quindi è un sistema indirizzabile.

Si produce un topo transgenico per Cre e lo si incrocia con un topo topo transgenico per il gene target che ho creato fiancheggiandolo a 2 Lox-P, si ottiene un topo Cre-Lox P dove elimino il gene target solo nella cell che lo ricombinazione attivata. Il sistema Cre-Lox include io tessuto-a ffio:

si fa delle line KO programmabili si ha promotore transgene e gene dei non codificante, si clona il transgene fianico ai Lox-P, si aggiunge la ricombinasa nelle cell che vogliamo noi, ricombni e elimina il transgene,

si KI e l’espressione programmabile: si lac il promotore, Lox-P e cassette di stop per un Lox-P non agisce sul transgene. Poi si ha il transgene la regione non codificante Questa volta n volta che tenega esprime tanto gene non da ma eliminato. Allora si esamina la ricordianina nelle cell in cui vogliamo la produzione e la espensione elimina la cassetta di stop, di sensatto al promotore di fare esprimere si transgene.

SISTEMA TET-ON/TET-OFF:

sistema per rendere l’ espressione e la soppressione di un gene inducibile.

E un sistema che deriva dall’ presenza Tet di E. coli.

Si usa quando aggiunga nel mezzoina la tetraciclina che si lega a un receptor che blocca la trascrizione nel gene che ho clonato e esprima, nel tipo OFF l’aggiunta di tet che esprime la trascrizione di gene. Invero nel sistema tet-on è la tet che esconde il gene.

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