CRISPR CAS9

FENOMENO DI PROTEZIONE

Complesso CAS9- crRNA (RNA guida) ha la capacità di indirizzarsi verso verso il genoma bersaglio

determinandone la degradazione. Questo meccanismo determina il fenomeno di infezione

Il batterio sviluppa una memoria di infezione e sviluppa un complesso in grado di riconoscere e degradare il DNA

dell’infestante, bloccandone l’infezione.

RNA guida (crRNA) è il risultato di coniugazione tra:

• Sequenza di RNA omologa al target virale che si vuol distruggere

• Sequenza compatibile con la Cas9

Questo complesso è in grado di riconoscere la sequenza target.

Il legame tra il complesso Cas9-RNA e il DNA target è possibile grazieall’omologia

tra il target di DNA virale e l’RNA guida complementare.

Sequenza PAM (Protospacer Adjacent Motif)

Elemento fondamentale per il meccanismo di azione CRISPR-Cas9, in particolare

per l’azione di Cas9.

Ogni fago possiede una sequenza PAM. Sequenze PAM di fagi diversi possono essere diverse, ma sempre con un certo

grado di ridondanza: devono sempre essere presenti 2 glutammine.

La PAM è una breve sequenza di 3 nucleotidi posizionata accanto e a monte della sequenza DNA bersaglio riconosciuta

dall’RNA guida e tagliata dalla proteina Cas.

Ha un ruolo fondamentale nel:

• Riconoscimento del bersaglio: La proteina Cas9 richiede la presenza di una sequenza PAM vicino al sito bersaglio del

DNA per poter interagire con il DNA. Se la PAM non è presente, Cas9 non può legarsi né tagliare il DNA virale, anche

se la sequenza complementare all’RNA guida (crRNA) è corretta. Questo assicura che la proteina Cas9 non tagli

accidentalmente il DNA nel punto sbagliato.

• Specificità e prevenzione dell’auto-taglio: La sequenza PAM si trova nel DNA virale, ma non nel CRISPR array

(cioè, nel DNA batterico che contiene i frammenti di virus precedentemente incontrati). Questo impedisce al sistema

CRISPR di tagliare il proprio DNA, garantendo che solo il DNA estraneo venga degradato.

1. Ricerca del bersaglio: La proteina Cas9 complessata con l’RNA guida (crRNA) scansiona il DNA in cerca di una

sequenza PAM. Una volta che identifica la PAM, Cas9 si lega al DNA.

2. Appaiamento dell’RNA guida: Dopo il riconoscimento della PAM, Cas9 apre la doppia elica del DNA e consente

all’RNA guida di appaiarsi alla sequenza bersaglio complementare sul filamento di DNA vicino alla PAM.

3. Taglio del DNA: Se l’appaiamento è corretto, Cas9 esegue un taglio a doppio filamento del DNA in prossimità della

sequenza PAM. Questo taglio può essere utilizzato per distruggere il DNA virale o per innescare la modifica di un gene

(nel contesto dell’editing genomico).

PRIMO ATTACCO

Proteine del complesso Cas costitutivamente espresse dal batterio,

intervengono quando il batterio viene infettato da un virus.

Il fago inserisce il suo genoma all’interno del batteriofago, con lo

scopo di introdurlo nel genoma batterico sfruttando la sua replicazione.

Il complesso CAS lega il DNA virale in prossimità della sequenza

PAM e lo degrada in piccoli frammenti.

Uno di questi frammenti si posiziona nel genoma batterico, interposto

tra due sequenze palindrome e ripetute formando la famosa sequenza

CRISPR.

Questo frammento costituisce la memoria batterica riguardo quel

determinato fago, la quale verrà sfruttata in un potenziale secondo

attacco da parte dello stesso fago.

Il CRISPR array può arricchirsi ogni qualvolta un nuovo fago infetta il

batterio, creando così una memoria per la risposta immunologica. Le

nuove sequenze CRISPR sono aggiunte a valle.

SECONDO ATTACCO

Se poi il fago ritorna…si riattiva la memoria del batterio.

La sequenza genomica virale viene riconosciuta dal batterio poichè già

presente nella sequenza CRISPR.

Da questa sequenza viene espressa la sequenza spacer corrispondente

dal genoma virale appena iniettao. Da questa viene prodotto un

trascritto di RNA che risulterà essere complementare alla sequenza

target del genoma virale. Questa complementarietà è la base della

memoria immunitaria del batterio.

Trans-crRNA si lega con la sua sequenza complementare crRNA.

Questo complesso a doppio filamento si lega alla proteina Cas9

Il complesso Cas9- transcr-RNA-crRNA si lega a sequenze del DNA

virale che viene riconosciuto grazie alla presenza della sequenza PAM.

Quando la proteina Cas9 si siede sulla sequenza PAM, inizia la fase di

taglio del DNA virale all’estremità della sequenza corrispondente alla

sequenza spacer.

Il DNA virale degradato è impossibilitato nell’infezione del batterio.

che sono il risultatod ella trascrizione del genoma batterico.

Se riconoscimento del genoma virale da parte della cas9 si basasse solo sull’omologia con la sequenza CRISPR, allora

tale proteina potrebbe tagliare il proprio genoma in corrispondenza di tale sequenza.

Il riconoscimento infatti si basa anche sulla compatibilità con la sequenza PAM presente solo ed esclusivamente sul

genoma virale iniettato e non su quello già integrato nel genoma batterico sottoforma di sequenza CRISPR

METODO “Break to Edit”

Questo processo è stato rivoluzionario.

Prima di questa scoperta si cercava un modo per modificare il genoma in modo preciso e mirato.

Sono stati identificati una serie di enzimi che potessero modificare la sequenza genomica, tra cui Cas9

• Meganucleasi sono dei grossi complessi proteici che hanno la capacità di legarsi al DNA e effettuare un taglio a

doppio filamento. Non hanno elevata specificità, ma riconoscono sequenze che sono presenti in decine di copie

nel genoma. Problema: se usate per tagliare il genoma, questo verrebbe frammentato in tante piccole sequenze.

Altri complessi proteici che sfruttavano domini DNA-binding di queste meganucleasi.

• Nucleasi Zinc finger complessi proteici generati in laboratorio, composto da più dominii per il legame al DNA

che riconoscono ognuno 3 nucleotidi e un dominio con attività nucleasica di DNA. Sono necessari due

monomeri per generare una nucleasi attiva, ma 3-6 moduli sono spesso utilizzati per inattivare un bersaglio

specifico sul DNA.

• TALEN: questi complessi proteici hanno una struttura modulare composta da due domini, uno attivatore della

trascrizione è un dominio nucleasico che taglia il DNA. I domini TALEN sono lunghi 34aa e ognuno di loro

riconosce un singolo nucleotide. La presenza di due aa nella posizione 12 e 13 in ogni modulo TALE determina

la specificità del nucleotide. Queste complessi proteici sono più precisi rispetto alle Zinc finger e meno flessibili

OFF TARGET: fenomeno durante il quale i domini sintetici disegnati in laboratorio colpiscono un dominio diverso

da quello per cui sono stati progettati. Il taglio fuori dal bersaglio è causato dal fatto che ogni dominio ha una

propria tolleranza, quindi può creare legami meno forti con domini simili al bersaglio.

Il fenomeno dell’off target è il vero problema per il quale queste tecniche di genome editing non possono essere

usate in vivo.

Tra tutti i complessi proteici nucleati Ici in grado di effettuare un taglio a doppio filamento, CRISPR/CAS9 risulta

essere il metodo più attendibile e più preciso.

La tecnica del Break to edit prevede che dopo il double strand break il genoma debba essere riparato.

Dopo il taglio, la cellula entra in allarme emette in moto una serie di processi riparativi.

La riparazione avviene in due modi:

• NHEJ: riparazione imprecisa poichè aggiunge nucleotidi casuali—> se la sequenza riparata è alterata rispetto a

quella di origine, la proteina che ne deriva non è funzionante e viene degradata. Questo metodo corre questo

rischio, piuttosto che mantenere un frammento di DNA tagliato. La probabilità di generare una proteina non

funzionante a causa dell’alterazione della sequenza è minima perché la maggior parte del nostro genoma non è

codificante.

• HDR: riparazione precisa perché usa come temprato il cromosoma omologo, che ha una sequenza uguale o

simile a quella precedentemente tagliata. La riparazione per omologia può essere sfruttata in laboratorio

fornendo alla cellula una sequenza di DNA ingegnerizzate per essere utilizzata come templato, in sostituzione

della sequenza omologa del cromosoma omologo.

VANTAGGI DELLA CRISPR-CAS9

• tecnica più semplice, rapida ed economica.

• È necessario sintetizzare in laboratorio solo la sequenza di RNA target.

• Cas9 è in grado di localizzarsi in un punto specifico del genoma, grazie alla sintesi di RNA guida che si

associano alla sequenza/gene target da tagliare

• Multiplexing: è possibile effettuare più tagli contemporaneamente sintetizzando gli oligonucleotidi necessari

affinchè la cellula produca RNA guida corrispondenti. Quando le CAS9 si legano agli RNA guida, si creerà un

pool di CAS9 che tagliano il DNA in prossimità di target diversi.

• È possibile disegnare RNA che targettino ogni singolo gene del genoma

Questa tecnica è stata sfruttata per cercare geni in un intero genoma, che conferiscono resistenza agli antibiotici

Hanno studiato cellule tumorali con resistenza ai chemioterapici.

Hanno sintetizzato in laboratorio sequenze di RNA guida che potessero targhettare uno a uno tutti i geni di questa

cellula, in modo da identificare quali tra questi fornisce resistenza ai farmaci chemioterapici.

Le stesse cellule sono state trattate con una intera libreria di copie della CAS9 e poi trattate con il chemioterapico.

Tramite il sequenziamento del genoma delle cellule che presentavano resistenza al chemioterapico è stato possibile

quale guida era stato somministrato e quindi il gene corrispondente che conferiva resistenza al chemioterapico.

Si è trovato il modo per cui si può uccidere l’attività nucleasi della cas9 ovvero non taglia il DNA ma mantiene la

sua capcità di legarsi alla sequenza corrispondente. Alla luce di questa scoperta hanno iniztao ad attaccare domini

effettori alla Cas9: come per esempio

• Domini di regolazione trascrizionale, che richiamano il complesso e inducono la trascrizione

• Domini che modificano epigenoma che tolgono o aggiungo metilazioni,

• Domini fluorescente in modo da localizzare la sequenza di interesse,

• Domini che si legano tra loro per indurre cambi conformazionali nella tolopoloigia del genoma stesso

• Domini che riescono a modificare le BA stesse. Hanno attività enzimatica tale per cui il residuo del nucleotide

viene modificato, la cellula stessa lo corregge e questo permette di sostituire la BA

In questo modo sono stati progettati enzimi che modificano/correggono direttamente il DNA rispetto alla Cas9

tradizionale senza effettuare tagli potenzialmente dannosi per il DNA, poichè la riparazione può portare co