2. Genetica dello sviluppo e del differenziamento, ENCODE e CRISPR-Cas 9

Cellule diverse di tessuti diversi, esprimono geni diversi

Importanza dei geni nello sviluppo e differenziamento

Quali sono i geni importanti per programmare lo sviluppo e il differenziamento? Partendo dall'idea che, dal punto di vista genetico, lo sviluppo consiste in espressione genica differenziale, in che modo i nostri geni vengono attivati in modo differenziale nel tempo e nello spazio?

Fattori di trascrizione e regolazione genica

Geni importanti da studiare sono i geni che codificano fattori di trascrizione che nel loro insieme regolano l'attività differenziale dei vari geni. Cellule diverse di tessuti diversi esprimono geni diversi. In dettaglio, se prendiamo 3 tessuti diversi, cervello, fegato e cuore, vediamo che esprimono geni divisi principalmente in due classi: i geni housekeeping, che codificano per le funzioni necessarie a tutte le cellule, come metabolismo, respirazione, replicazione del DNA, riparo del danno al DNA; oltre a questi sono presenti specifici di diverso tipo, che codificano ad esempio, per proteine differenziate (actomiosina del muscolo), proteine connesse al controllo dell'identità della cellula, recettori e proteine segnale, fattori di segnalazione e citochine, importanti nello sviluppo embrionale e nel differenziamento cellulare.

In particolare, le citochine sono proteine che interagiscono con specifici recettori e mediano la segnalazione fra cellule nello spazio intracellulare. Molta della genetica dello sviluppo si basa sull'espressione di prodotti genici di questo tipo. Lo sviluppo della rete dei neuroni è pilotato da questi sistemi che segnalano la direzione di crescita assonica e la formazione delle sinapsi; anche nel sistema ematopoietico, la proliferazione e il differenziamento di diversi tipi cellulari è guidato dall'interazione citochina-recettore.

Regolazione dei fattori trascrizionali

Un singolo fattore trascrizionale regola centinaia di geni diversi. Per esempio, un TF tessuto specifico è GATA1 (che prende il nome dalla sequenza che riconosce sul DNA), controlla geni critici per l'identità della cellula eritroide differenziata, come quelli delle globine, degli enzimi per la biosintesi dell'eme, il gene per il recettore dell'eritropoietina e altri geni che codificano per altri fattori trascrizionali eritroidi. Inoltre, il prodotto di un fattore di trascrizione può regolare anche il TF stesso.

La trascrizione tessuto o cellula-specifica dipende da combinazioni specifiche di fattori trascrizionali, una regolazione combinatoria che permette anche la riduzione del numero di fattori trascrizionali necessari alla regolazione di tutti tipi cellulari dell'organismo.

Gene della β-globina e regolazione genica

Il gene della β-globina è composto di almeno due esoni e contiene siti di legame multipli per proteine regolatrici, come GATA1, che ha più siti di legame al promotore e agli enhancers (elemento di sequenza che regola i livelli di trascrizione di un gene, che normalmente non gli sta vicino, tipico degli eucarioti pluricellulari). Si legano anche negli introni che ospitano enhancer attivi sul promotore del gene stesso, e possono trovarsi anche a 3’.

L’enhancer viene legato da GATA1 e NFE2 (Nuclear factor eritroid 2, target trascrizionale di GATA1) sono in networks di regolazione genica. Ci sono diverse combinazioni di fattori trascrizionali, tessuto specifiche, GATA1 e NFE2 regolano globina, enzimi della sintesi dell'eme, recettore per l'eritropoietina e geni eritroidi, oltre ad altri fattori trascrizionali, tra cui NFE2 stesso. Lo stesso fattore trascrizionale in combinazione con un altro, regola geni diversi: GATA1 con EtS controlla l’attività dei geni dei megacariociti.

Interazioni tra fattori trascrizionali

Questo aspetto dipende dall'evoluzione parallela dell'espressione dei geni, degli insiemi di fattori trascrizionali e delle sequenze regolative. In questo modo, il dato gene sarà attivo laddove ci sono entrambi i fattori di trascrizione, ovvero laddove si instaurano interazioni proteina-proteina fra i due fattori trascrizionali. GATA1 insieme a un altro fattore regola la gonade maschile. Spesso ci sono sequenze riconoscibili da più fattori, presenti anche in più copie, a cui si correla il controllo quantitativo dell’attività del gene.

Questi aspetti sono stati scoperti con esperimenti funzionali, che prevedono la mutazione di questi siti sul DNA e l’utilizzo di geni reporter, animali transgenici e trasfezione di cellule. Mutazioni puntiformi nell’enhancer hanno portato a mappare i siti tramite i quali agiscono i diversi fattori di trascrizione.

Regolazione genica nel tessuto nervoso

Nel tessuto nervoso, Neuro-D controlla geni importanti nei neuroni e per le loro funzioni, come canali ionici, proteine delle sinapsi, neurotrasmettitori e loro recettori. Anche Neuro-D agisce in concerto a fattori trascrizionali, in diversi tipi di neuroni. Spesso Neuro-D agisce con neurogenine, attivatori presenti, ad esempio, in neuroblasti. Alcuni agiscono da repressori: infatti, le cellule non neurali esprimono spesso il repressore dei geni neurali NSRF (Neuron-Restrictive Factor).

Pax6 codifica per un fattore di trascrizione importante per occhio, cervello e pancreas. Ha siti di regolazione su geni diversi. Il gene del cristallino dipende da un enhancer importante, a cui Pax6 si lega in associazione a Sox2, che solitamente regola cervello e talamo. Mutazioni eterozigoti in Pax6 o Sox2 hanno difetti oculari e in altre regioni del cervello. Nell’enhancer del gene della somatostatina pancreatica, Pax6 si lega in associazione a Pdx1 e Pbx1.

Metodi di analisi avanzata

ENCODE fa parte dei metodi basati sul sequencing di ultima generazione, high throughput sequencing, genomica funzionale. RNAsec descrive tutti i trascritti della cellula e li sequenzia. È possibile anche mappare i siti di legame dei fattori trascrizionali, come CIPsec, purché sia disponibile un anticorpo ipersensibili alla DNAasi. Per fare immunoprecipitazione, è possibile mappare anche siti solitamente una sequenza regolativa è ipersensibile alla DNAasi in quanto più accessibile.