2. Genetica dello sviluppo e del differenziamento, ENCODE e CRISPR-Cas 9

ENCODERNAsec: Metodi di sequenziamento ad alta efficienza per la genomica funzionale

ENCODERNAsec fa parte dei metodi basati sul sequencing di ultima generazione, noti anche come high throughput sequencing. Questo approccio permette di descrivere tutti i trascritti della cellula, sequenziandoli e consentendo anche la mappatura dei siti di legame dei fattori trascrizionali, come ad esempio CIPsec. Per effettuare l'immunoprecipitazione, è necessario disporre di un anticorpo ipersensibile alla DNAasi.

Utilizzando ENCODERNAsec, è possibile mappare anche i siti di sequenze regolative che sono ipersensibili alla DNAasi, poiché più accessibili. Inoltre, è possibile mappare le modificazioni covalenti degli istoni, come acetilazioni o metilazioni, che sono correlate alla trascrizione differenziale del DNA.

ENCODERNAsec consente anche di mappare la metilazione del DNA. La metilazione dei dinucleotidi CPG rende il DNA non permissivo per le interazioni cromatiniche a lungo raggio e quindi per la trascrizione.

Infine, ENCODERNAsec permette di mappare le associazioni di tratti del DNA anche a grandi distanze. Spesso si osservano associazioni tra promotori e enhancer, che sono alla base della regolazione genica. Questo metodo consente di studiare tali associazioni a livello genomico.

Di queste interazioni è oggetto di un programma di ricerca multicentrico mirato a studiare gli aspetti della genomica funzionale in diversi tipi cellulari di uomo e topo. Questi esperimenti ci forniscono cataloghi essenziali per indagare il funzionamento del genoma, sono state in grado di ridefinire il nostro concetto di gene, attraverso il sequenziamento completo degli RNA cellulari ci si è accorti che in tipi cellulari diversi, la maggior parte del genoma è trascritto, tramite ultra deep sequencing sono stati individuati anche i messaggeri poco abbondanti, tra tutti i tipi cellulari, risulta che i geni trascritti nel loro insieme coprono il 75% del genoma, inoltre vengono trascritti molti tratti di DNA intergenico, anche se non tutti agli stessi livelli, l'attività dei trascritti cambia in base al tipo di cellula, non tutti gli RNA trascritti sono codificanti, molti sono miRNA che modulano la stabilità dei geni, i trascritti più lncRNA, lunghi.

di 200 bp, possono essere intergenici o sovrapporsi a RNA codificanti, su entrambi i filamenti, questi RNA possono agire in CIS, o in TRANS, si possono ripiegare per complementarietà delle basi interne, a assumere strutture tridimensionali, che ne riducono l'energia interna, tramite la loro struttura tridimensionale, interagiscono come proteine, anche formando complessi e innescando modificazioni allosteriche dei fattori trascrizionali, convertendoli in attivatori o inibitori.

Long non-coding RNAs (lncRNAs)

Con i primi sequenziamenti del genoma e del trascrittoma si è scoperto che la maggior parte del genoma nei mammiferi e in altri eucarioti è trascritto, in modo regolato, in tantissimi ncRNAs (RNA non codificanti).

I ncRNA più corti di 200 nt sono i small non-coding RNA, quelli più lunghi di 200 nt sono i long non-coding RNA.

I primi studi hanno evidenziato funzioni e livelli di espressione molto diversi.

Funzioni dei lncRNAs:

- XIST, uno dei primi studiati,

agisce in cis, rimane connesso al cromosoma X che lo trascrive di cuimedia l'eterocromatizzazione- Altri agiscono in trans interagendo con i fattori trascrizionali determinando modificazioniconformazionali, inattivazione o attivazione..., es. HOTAIR interagisce con un complesso proteicoche regola negativamente la trascrizione.

Una caratteristica comune dei lncRNAs è che si organizzano tridimensionalmente, alcuni tratti interagisconotra di loro tramite complementarietà delle basi e determinano il ripiegamento dell'RNA in una specificastruttura 3D attraverso cui è in grado di interagire con i siti di legame specifici di alcune proteine, con lafunzione ad es. di regolare la trascrizione.

Alcuni lncRNA vengono trascritti in verso opposto rispetto alla trascrizione di geni strutturali,sembra che la trascrizione in verso opposto abbia il ruolo funzionale di antagonizzare la trascrizionedel gene strutturale.

Alcuni lncRNA competono con gli mRNA per il legame

con i miRNA. I miRNA di solito legano un mRNA non specifico e ne regolano la stabilità, alcuni lncRNA hanno siti di legame per i miRNA che competono con gli mRNA. Possono essere lineari o circolari, vengono chiamati RNA sponge o competing endogenous RNA (ceRNA). Tanto più sono abbondanti tanto più competono con gli miRNA per il legame con i miRNA. Un'altra funzione dei lncRNA è quella di decoy, in cui un lncRNA compete con il DNA per il legame con alcune DNA binding protein che così vengono sequestrate, anche in questo caso è la forma tridimensionale del lncRNA che permette l'interazione specifica con la proteina. Con l'analisi del trascrittoma si è rivista anche la definizione di gene, non solo trascritto in mRNA tradotto in una proteina, ma anche trascritto in RNA non codificanti. Chromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP Seq) immunoprec 263 Tramite la tecnica ChiP Seq oggi possiamo trovare su tutto il genoma i siti dilegare ad anticorpi specifici per il fattore trascrizionale di interesse. Gli anticorpi legati al DNA vengono poi isolati e il DNA ad essi associato viene sequenziato. Questo permette di identificare i siti di legame del fattore trascrizionale nel genoma e di studiare i pattern di legame in diversi tipi cellulari. Durante l'analisi dei dati di ChIP Seq, i siti di legame del fattore trascrizionale vengono mappati sul genoma di riferimento e possono essere visualizzati utilizzando programmi appositi. In questo modo è possibile identificare i geni bersaglio del fattore trascrizionale e studiare i meccanismi di regolazione dell'espressione genica. Il ChIP Seq è una tecnica molto utilizzata nello studio della regolazione genica e permette di ottenere informazioni dettagliate sui legami tra i fattori trascrizionali e il DNA. Grazie a questa tecnica è possibile comprendere meglio i meccanismi che regolano l'espressione genica e studiare le basi molecolari delle malattie e dei processi biologici.

correre su un gel elettroforetico. I frammenti separati sul gel elettroforetico vengono incubati con anticorpi diretti contro un certo fattore trascrizionale, tramite l'immunoprecipitazione ottengo un immunoprecipitato con gli anticorpi che hanno legato il fattore trascrizionale a sua volta legato a tutte le sequenze di DNA con cui interagisce. Si eliminano i legami covalenti e si ottengono frammenti di DNA puro che possono essere analizzati con il sequenziamento. Ottengo tutte le sequenze a cui si trovava legato il fattore trascrizionale, le sequenze vengono allineate a un genoma di riferimento. Trovo anche dei picchi di legame che mi dicono a quali sequenze era maggiormente legato il fattore. Se ho già una sequenza che voglio vedere se viene legata dal fattore, ottenuti i frammenti non sequenzio, ma faccio una PCR per vedere se il frammento di interesse era stato legato ed è presente nell'immunoprecipitato. Si può anche eseguire una ChIP-on-chip, in cui delle

1. sonde sono coniugate su un supporto solido come quelli dei microarray, le sonde sono complementari alle sequenze di DNA che voglio vedere se sono legate a un certo fattore trascrizionale.
2. I frammenti ottenuti con l'immunoprecipitazione vengono marcati e ibridati sul chip, in questo modo vedo quali frammenti sono presenti e si ibridizzano e quali no.
3. Con il tempo sono state fatte tante ChIP Seq di diversi fattori trascrizionali in diversi tipi cellulari, i risultati sono stati raccolti in un database.

Implicazioni per lo studio delle patologie genetiche umane:

Con i genome wide association studies (GWAS) si studiano le varianti del genoma che sono associate a specifici tratti fenotipici, ad esempio patologici, altezza... . Ci sono dei database in cui sono riportate le varianti degli SNP in linkage disequilibrium con determinati tratti fenotipici patologici. Questo non vuol dire che lo SNP che usiamo come marcatore è la mutazione che causa la patologia. Si sono confrontati i risultati di

di studio del progetto ENCODE.I siti ipersensibili alla DNAsi sono quelli più accessibili alla DNAsi I, nella cellula, essendo le sequenze più accessibili, sono quelle che vengono legate dalle proteine regolatrici dell'espressione genica, come i fattori trascrizionali. I siti ipersensibili alla DNAsi corrispondono quindi alle sequenze regolatrici: promotori, enhancer, silencers, insulators, locus control regions... . Ci sono metodi che permettono di studiare tutti i siti ipersensibili alla DNAsi nel genoma di un determinato tipo cellulare, es ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing). Sono stati individuati 2,9 milioni di siti ipersensibili alla DNAsi, più di 200.000 per tipo cellulare, mentre i geni che codificano per le proteine sono 20.000, se c'è un ordine di grandezza in più di siti ipersensibili rispetto ai geni codificanti, ipotizziamo che ciascun gene sia regolato da più regioni ipersensibili, quindi

dapiù regioni regolatorie. Ci sono metodi per analizzare l’informazione regolativa più di alto livello, come la connessione fisica tra ipromotori e i rispettivi enhancer, solitamente molto lontani dai geni che controllano. Ci sono metodigenomici che permettono di ottenere una lista delle regioni di DNA che sono lontane sul genoma linearema si trovano vicine fisicamente nel nucleo della cellula in studio. Es. ChIA-PET (Chromatin InteractionAnalysis by Paired-End Tag Sequencing) permette di immunoprecipitare la cromatina con un anticorpodiretto verso la RNA polimerasi II, il DNA immunoprecipitato viene trattato in modo da ligare le sequenzeche hanno co-precipitato insieme, si ottengono tutte le interazioni a lunga distanza tra le sequenze di DNAin quella cellula.La connessione dei geni con enhancer lontani è un fattore importante per la trascrizione, infatti si è vistoche i geni connessi con enhancer lontani sono statisticamente più espressi dei

geni non connessi. Moltospesso un enhancer non è connesso con il promotore più vicino ma con uno più lontano, saltando gen