Virus e terapia genica

Le CAR-T cells: una terapia innovativa per il trattamento dei tumori

Hanno rivoluzionato il campo della terapia cellulare le CAR-T cells, cellule T modificate per esprimere un recettore chimerico chiamato complesso CAR (Chimeric Antigen Receptor). Questo recettore conferisce alle cellule T una specificità unica, simile a quella di un anticorpo.

La terapia con le CAR-T cells è attualmente utilizzata in clinica per il trattamento delle leucemie, dei linfomi e, più recentemente, anche dei tumori solidi.

Tutti i modelli di CAR contengono un dominio di riconoscimento dell'antigene, situato all'esterno della cellula, una parte transmembrana e un dominio di segnalazione all'interno della cellula. Quest'ultimo fornisce un segnale per attivare le cellule T e contiene una porzione stimolatoria e una attivatoria.

Il recettore CAR è un immunorecettore ingegnerizzato a partire da diverse fonti, tra cui gli anticorpi monoclonali, ed è progettato per riconoscere un bersaglio specifico. Nel corso degli anni sono state sviluppate tre generazioni di recettori CAR, ognuna con miglioramenti e modifiche rispetto alla precedente.

è stato migliorato il dominio di segnalazione. Il recettore viene inserito nelle cellule T attraverso un vettore virale.

L'antigene dev’essere espresso in grande quantità dalle cellule tumorali e si spera da nessun’altra cellula. In realtà questo non avviene e spesso è presente una risposta autoimmune.

Alcuni esempi di antigeni riconosciuti dalle CAR T cells:

• CD30: linfoma di Hodgkin
• BCMA: mieloma multiplo
• SLAMF7: mieloma multiplo
• CD19: leucemia linfoblastica acuta e linfoma

L’antigene CD19 è un bersaglio ideale, perché la sua espressione è ristretta solo ai linfociti B e ai suoi precursori, ma non dalle cellule staminali emopoietiche.

Questa particolare terapia genica, chiamata CTL019, è indicata soprattutto per i malati affetti da Leucemia Linfoblastica cellule B Acuta (LLA). In particolare nei pazienti giovani, sotto i 25 anni, che non rispondono a nessun’altra terapia. Viene usata poi come prima forma

La terapia genica viene utilizzata per curare il cancro, in particolare nelle forme aggressive di linfoma non-Hodgkin.

Il processo di terapia genica prevede i seguenti passaggi:

1. Prelievo del sangue: i linfociti T vengono prelevati dal sangue del paziente mediante un processo chiamato leucaferesi, che consente di isolarli dal sangue periferico. Successivamente, vengono separati utilizzando metodi immuno-magnetici. I restanti elementi ematici vengono rimessi in circolo.
2. I linfociti T prelevati vengono congelati e inviati a una struttura specializzata per l'ingegnerizzazione genetica.
3. Le cellule vengono geneticamente modificate utilizzando metodi virali o non virali, inserendo un CAR (Chimeric Antigen Receptor).
4. Le cellule geneticamente modificate vengono fatte espandere in vitro.
5. Le cellule modificate vengono somministrate al paziente, prima della chemioterapia e successivamente ai linfociti T modificati.
6. Viene effettuato un monitoraggio per valutare l'efficacia del trattamento.

Questa terapia è simile al trapianto autologo delle cellule staminali, ma con una durata limitata dei linfociti T. Pertanto, da un certo punto di vista, è considerata più sicura dell'editing delle cellule staminali.

che sono invece più soggette alla cancerogenesi, ma non è comunque completamente priva di rischi. Hanno ottenuto l'Autorizzazione all'Immissione in Commercio (AIC) nell'Unione Europea:

• Kymriah (tisagenlecleucel), autorizzato il 22 agosto 2018: pazienti pediatrici e giovani adulti fino a 25 anni di età, affetti da leucemia linfoblastica acuta a cellule B o BALL, che non hanno mai risposto alla chemioterapia, o che sono in recidiva dopo il trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche o dopo almeno due linee di chemioterapia.
• Yescarta (axicabtagene ciloleucel), autorizzato il 23 agosto 2018: pazienti affetti da linfoma primitivo del mediastino a cellule B o PMBCL già sottoposti ad almeno due linee di terapia sistemica.

Entrambe sono indicate per pazienti con linfoma diffuso a

grandi cellule B o DLBCL. Rispetto alle terapie "convenzionali", le CAR T permettono di ottenere remissioni complete, anche in fasi di malattia molto avanzate.

La terapia che si serve delle CAR T presenta alcuni effetti collaterali, quali:

• La terapia genica nelle Genodermatosi

La pelle umana è strutturata come segue:

• epidermide: presenta cellule staminali epiteliali, follicoli piliferi e ghiandole sudoripare
• derma: presenta cellule staminali mesenchimali e follicoli piliferi
• sottocute: presenta le cellule staminali dei melanociti

Le genodermatosi sono sindromi o malattie dermatologiche genetiche, causate da mutazioni. Sono quasi sempre malattie rare e hanno ereditarietà sia dominante che recessiva, spesso a carico di proteine della pelle con funzione adesiva, come il collagene, la laminina o la cheratina. A seconda della proteina colpita si avranno diverse varianti. Generalmente comportano la formazione di spazi intraepidermici, in cui si accumula del siero.

Lesintomatologia è molto dolorosa. Per questo tipo di patologie sono da anni in via di sviluppo terapie geniche ex vivo, in quanto la pelle è un tessuto facilmente isolabile. Si stanno studiando modelli di trapianti uguali a quelli per le ustioni, ovvero trapianti autologhi di cellule staminali. La differenza è che in questo caso interverrà la terapia genica per correggere la mutazione, attraverso approcci sia di addizione che di silenziamento o di rimpiazzamento. Il procedimento è il seguente: 1. biopsia di pelle sana 2. messa in coltura per amplificare solo le cellule staminali. Nella pelle se ne trovano molte, tra staminali e progenitrici, e si riconoscono, poiché sono quelle che amplificano di più. 3. correzione della mutazione con il vettore (virale o non) 4. trapianto Un esempio di patologia è l’epidermolisi bullosa, causata dalla mutazione del gene LAMB3, la cui terapia genica è stata sviluppata da un gruppo italiano di ricerca.ricercatori dell'università di Modena, tra cui Michele de Luca. L'Italia in questo campo si trova all'avanguardia. La terapia genica nelle Malattie Degenerative, in particolare nella Distrofia Muscolare Non esiste un'unica distrofia muscolare, in quanto vengono coinvolti tanti tipi di geni e di conseguenza tante regioni corporee. La più comune è la distrofia di Duchenne. La distrofia di Duchenne è un disordine ereditario legato all'X recessivo, che causa una degenerazione progressiva del muscolo e ha insorgenza prima dei 6 anni di vita. La perdita della funzionalità è graduale e fino al compimento del 1-2 anno di vita non ci si accorge. In quanto patologia legata all'X, le femmine raramente si ammalano (1% dei malati), ma possono presentare alcuni sintomi. La frequenza nei maschi malati, invece, è 1/3500, quindi non è così rara. La maggior parte delle cause di insorgenza è dinatura ereditaria (70%), mentre il 30% ha insorgenza spontanea. La patologia si manifesta con diversi sintomi, quali iniziare tardivamente a camminare, difficoltà a mantenere la posizione eretta e altri sintomi muscolari che compromettono il movimento. Con gli anni diventano sempre più gravi, fino a perdere l'abilità di fare le scale o di alzarsi dalla posizione seduta. Spesso si perde la capacità di camminare intorno ai 12 anni. A questi sono associate diverse complicazioni cardiache e respiratorie, e deformità. Infatti, molti pazienti muoiono per problematiche cardiache all'età di circa 25 anni, anche se con le cure di oggi si può aspirare ad una vita più longeva. A livello molecolare, la patologia è causata dalla mutazione del gene che codifica per la distrofina, il gene più grande del genoma umano. La distrofina fa parte del complesso distroglicano che, insieme ad altre proteine, collega il citoscheletro della

La fibra muscolare è circondata da una matrice extracellulare. Il complesso che unisce l'apparato contrattile alla membrana che circonda la fibra stessa è composto da diverse proteine, tra cui la distrofina. La distrofina è una proteina essenziale per la stabilità della membrana muscolare. Mutazioni a carico della distrofina causano la distrofia muscolare di Duchenne, una forma grave di distrofia muscolare.

Mutazioni a carico delle altre proteine del complesso, come la laminina, le emerine o i sarcoglicani, causano altre forme di distrofia muscolare.

A seguito di un danno muscolare alla fibra, il muscolo attiva un processo rigenerativo. Le cellule satelliti, che sono cellule staminali adulte presenti nel muscolo, vengono attivate e si differenziano in miotubuli per cercare di rigenerare la fibra muscolare danneggiata.

Il processo rigenerativo normalmente ha successo, ma nella distrofia muscolare, essendo il danno muscolare costante, la rigenerazione diventa aberrante e il danno diventa progressivo nel tempo.

Inoltre, intervengono anche i macrofagi, cellule facenti parte del sistema immunitario innato, per ripulire i prodotti di scarto della fibra muscolare danneggiata.

possono rigenerare tessuto sano all'infinito, per cui dopo un danno continuo il tessuto muscolare viene rimpiazzato da tessuto connettivo o adiposo. Negli stadi precoci della patologia si osserva quindi poco tessuto connettivo, mentre a stadi più avanzati sempre più fibre vengono rimpiazzate dallo stesso.

Il gene della distrofina è molto grande, più di due megabasi, e rappresenta lo 0,08% del cromosoma X, su cui si trova. Viene trascritto in 16 ore e il suo mRNA maturo misura 14 kb. La proteina nell'isoforma del muscolo scheletrico ha più di 3600 amminoacidi. Altre forme più piccole si trovano, ad esempio, nell'etina.

Essendo un gene così grande sono molto comuni e numerose le mutazioni (delezioni, duplicazioni, inserzioni, non senso, missenso) e la maggior parte di queste interrompe l'open reading frame, per cui si forma una proteina tronca, non funzionale.

La cura ancora non è definitiva. Esistono varie strategie

Che tentano di ridurre i sintomi attraverso una terapia farmacologica a base di steroidi e fattori di crescita, che riescono quindi a migliorare il decorso, ma non a curare. Il problema maggiore, in questo caso, dell'efficacia della terapia genica è la grandezza del gene. Infatti, essendo un gene molto grande, è difficile da veicolare tutto intero nella cellula virale, la quale possiede una capienza massima di 8 kb.

Gli approcci genici in corso di sviluppo per la cura della distrofia sono:

1. Approccio di addizione genica: opera a livello del DNA ed è spesso combinato a terapia cellulare. Un esempio è l'utilizzo di micro-distrofine, versioni sintetiche del gene della distrofina, più piccole del gene endogeno, che conservano un certo grado di funzionalità.
2. Approccio di modifica a livello dell'RNA: agisce sulla trascrizione. Un esempio è l'exon-skipping, che cerca di correggere la trascrizione del gene della distrofina.

in modo da saltare la mutazione.

3. terapia farm