Conferenze Genetica forense

ZEBRAFISH: EMILINA-I E COLLAGENE VI

Parleremo di:

modelli animali e ruolo della MEC

• famiglia delle proteine emiline e multimerine

• emilina 1 nel cuore

• modello di distrofia per il collagene VI nello zebrafish

•

RUOLO DELLA MEC

La MEC ha un ruolo importante nell'omeostasi del tessuto.

Questo è stato dimostrato mediante approcci in vitro (colture) e in vivo.

L'analisi della MEC può essere fatta:

in tessuti ed organi

• identificare il ruolo di specifiche mutazioni genetiche

•

Alla fine si cerca di testae e validare nuove molecole che ripristinano il danno causato dalla

mutazione.

Si utilizzano diversi tool come:

organismi modello

• topi transgenici: con una mutazione specifica

• topi reporter: hanno diversi geni reporter come GFP, mCherry e laCZ

• topi KO o conditional KO

•

Ci possono essere linee reporter per specifiche vie di segnale.

Si vede dove sono espresse nelle diverse regioni del cervello dello zebrafish.

FAMIGLIA DELLE EMILINE

Sono proteine della famiglia MEC.

Sono dette anche EDEN.

Il dominio gC1q si trova in tutte le emiline tranne la 3; si trova al C-terminale e anche in altre

proteine no solo delle emiline.

E' coinvolto nella trimerizzazione e quindi nell'assemblramento.

Interagisce con integrina alfa4-beta1.

Serve per cellul adesione, proliferazione e migrazione cllulare.

Il dominio EMI è all'N-terminale.

E' lungo 70 aa.

Ha 7 cys; esse sono conservate nelle diverse emiline (comprese anche nell'emilina 3).

Serve per l'interazione di TGFbeta.

EMI domain è presente in tutti gli organismi.

Ma il ruolo di emilina 1 qual è?

La sigla “emilina 1” sta per elastin microfibril interface located protein.

Essa si localizza ai bordi della fibra elastica.

Essa ha un EMI domain (7 cisteine).

Per caratterizzare questa proteina inizialmente è stato condotto uno studio di espressione.

Poi sono stati prodotti dei topi reporter detti LacZ.

Poi sono stati prodotti modelli KO costitutivi e condizionali.

Infine si è proceduto alla sovraespressione di cDNA di emilina 1 in KO.

1- CARATTERIZZAZIONE DI ESPRESSIONE DI EMILINA 1

Per caratterizzare l'espressione dell'emilina 1 sono stati condotti due esperimenti:

Si fa una RT-PCR per misurare la quantità di RNA presente.

Poi sono conditti Westerm Blot per vedere i livelli di produzione della emilina1.

Linea sopra: analisi di embrione fino a 10 gg. La proteina è molto espressa.

Linea sotto: post nascita (P1-P19). Si vede che si prelevano differenti tessuti polmone, utero aorta,

anche nell'adulto è espressa specie nell'utero, nell'aorta, nel rene, nel polmone; non c'è nel cervello.

Questo WB permette di capire dove la proteina potrebbe svolgere un ruolo importante nella

determinazione del fenotipo.

Come è fatta la struttura di un'arteria?

C'è 3 strati: tunica intima, lamina elastica interna, tunica media (contenenti le cellule muscolari),

lamina elastica esterna e tunica avventizia (esterna).

La tunica intima ha le cellule endoteliali; successivamente nela tunica media ci sono le cellule

muscolari.

Nell'aorta l'emilina 1 si identifica nei cardiomioblasti, nell'interstizio, nelle cellule endoteliali e nelle

cellule muscolari lisce.

Quindi essa è altamente espressa a livello dell'aorta.

Quindi emilina è espressa sin dagli inizi di embriogenesi e persiste fino allo stadio adulto.

E' presente nel tessuto connettivo quind fornisce proprietà elastiche a aorta, polmone evari tessuti.

2- TOPO KO

Ruolo di emilina 1

per capire ruolo si è generato un topo KO.

L'embrione, utero, polmone e vescica NON esprimono emilina1.

++ wt, – omozigote, +- eterozigote.

In – non c'è emilina 1; l'Ab non riconosce la proteina quindi non c'è la banda.

Si conferma che topo è KO mediante:

western blot e analisi del cDNA.

• Successivamente si è verificato mediante immunofluorescenza che si ha una riduzione di

• proteina visualizzabile mediante Ab utilizzo (reazione immunostochimica).

A livello istologico si vede assenza di proteina: le aorta pareti hanno delle rotture a livello

• del topo KO.

Il wt ha lamina elastica interna di aorta intera, non frammentata.

Invece KO ha ua lamina elastica rottura (spezzata); anche la cellula endoteliale presenta

delle alterazioni cioè essa è schiacciata

questi eventi comportano il passaggio delle sostanze da vaso verso l'esterno.

Anche in cell muscolari lisce è espressa la proteina; le cell sono frmamentate, più piccole,

non hanno un bel nucleo

Grazie a ME si è confermato ciò che è visto mediante immunofluorescenza (tecnica

precedente); si ottiene mediante ME ingrandimenti maggiori cioè maggiore sensibilità

colture di fibroblasti: si fa un'immunfluorescenza contro elastina

• nei KO si riduce la capacità delle fibre di elastina di unirsi tra di loro e di organizzarsi

questa disorganizzazione non riguarda solo l'elastina ma anche altre proteine facenti parte

della MEC

qual è il fenotipo di topo KO?

Ha un sistema di ipertensione.

Sia di notte sia di giorno, i topi KO sono ipertesi.

Si ha un aumento di pressione osservato in tutti i topi (100% di penetranza).

Si osserva anche una riduzione del diametro dei vasi; questa è una conseguenza dell'ipertensione,

cioè successivamente a ipertensione si osserva riduzione dei vasi.

L'aorta nel KO ha quindi una dimensione inferiore rispetto al wt.

Quindi si è cercato di capire quali signaling possono causare questo fenotipo.

Si è analizzato il signaling del TGFbeta.

Mediante un Ab che lega la forma fosforilata di Smad2 (che fa parte di via di signaling di TGFbeta),

si vede che nelle cellule della aorta di KO si ha una maggiore attivazione di TGFbeta.

Questo aumento di TGFbeta può essere osservato anche mediante Western Blot.

Una volta che si identifica una via di segnale aumentata (o ridotta), si cerca di intervenire per

modificare suddetta via di segnale (in modo opposto).

Essendo che TGFbeta è aumentato nel topo, si è cercato di ridurre il livello di TGFbeta.

Quindi i topi KO per emilina sono stati incrociati con altri topi KO per TGFbeta1 (eterozigoti).

Il topo KO per emilina 1 ha ipertensione e ha aorta con diametro ridotto.

I topi KO per TGFbeta1 e per emilina 1 (doppio mutante) si osserva che ha una pressione minore al

caso precedente e inoltre il diametro dell'aorta tende a ritornare a livelli normali.

Il topo KO solo per TGFbeta1, si vede che esso non è iperteso e non ha alcuna alterazione nel

diametro dell'aorta.

Si è scelto un eterozigote di Tgbeta1 KO perché una condizione di omozigosi per mutazione di

TGFbeta1 NON è vitale.

Quindi si è cercato di somministrare l'anticorpo che neutralizza TGFbeta.

Si inietta suddetto Ab a livello dei topi.

Si registra quindi la pressione giornalmente.

Si evde che già dal 6 giorno negli animali trattati con anticorpo si ha riduzione di TGFbeta.

Quindi oltre all'approccio genetico (incrocio KO), è possibile ridurre i livelli di TGFbeta agendo a

livello farmacologico (si blocca con un Ab l'azione di TGFbeta1 che quidni non è più in grado di

attivare la sua via di segnale).

Riassumendo...

L'emilina 1 blocca la maturazione del TGFbeta (blocca la folina).

Se manca l'emilina, si produce molto più TGFbeta.

3. TOPO CONDIZIONALE INDUCIBILE

Condizionale: espresos solo in determinati tessuti

Inducibile: lo induco nel momento in cui lo ritengo più opportuno.

Mentre il topo KO è tale dalla nscita, nel caso dell'inducbile il KO avviene solo quando si

somministra una certa sostanza.

Per ottenere questi topi condizionali inducbili si utilizzano i siti LoxP.

In presenza della Cre-ricombinasi, si ricombinano i siti LoxP e quindi si rimuove l'esone di un gene

quindi si ha KO e quindi la proteina NON viene espressa.

Esistono delle Cre ricombinasi modificate per il recettore degli estrogeni.

Quando si somministra Tamoxifene, la Cre ricombinasi si stacca da HSP ed è in grado di spostarsi

nel nucleo dove consente la ricombinazione dei siti LoxP.

Come Cre drivers (promotori per guidare l'espressione di Cre ricombinasi in modo tessuto

specifico)?

Il promotore deve essere tessuto specifico.

Il tamoxifene è quello inducibile per esprimere la Cre ricombinasi in adulto.

Esistono numerosi promotori utilizzabili.

Nel nostro caso utilizziamo promotore per cellule muscolari lisce o endoteliale (SSMHC e Tie2

rispettivamente).

Inizialmente si è cercato di confermare che il promtoore fosse funzionale ovvero tessuto-specifico.

Si hanno due siti LoxP prima della cassetta di stop; quando avviene la ricombinazione ovvero viene

fornita la cRe ricombinasi (per tamoxifene), si ha rimozione della cassetta di stop quindi si ha

espressione di LacZ (reporter) che consente di ottenere colorazione caratteristica blu.

In presenza di tamoxifene l'aorta è blu.

Se si fanno delle sezioni dell'aorta, si vedono dei nucllei che è bianca in controllo privo di

tamoxifene.

Questo permette di valutare se promotore è tessuto-specifico.

Emofilina: la proteina scompare tra 10 e 15 gg.

Il segnale scompare solo nella tunica media x cellule muscolari lisce.

Quindi si ha un modello KO tessuto specifico inducibile.

Per ottenere questo modello si devono incrociare due animali:

alleli flox2

• cre ricombinasi sotto promotore tessuto-specifico

•

dalla somministrazione del tamoxifen, dopo 10 gg, si vede che nell'animale trattato con Tamoxifen

si sviluppa di nuovo ipotensione.

Questo dimostra che ipertensione è dovuto alle cellule muscolari lisce dell'aorta; in questo caso

infatti NON si toglie emilina 1 da tutte le cellule ma solo dalle cellule muscolari lisce a

dimsotrazioen che sono queste cell quelle coinvolte nell'ipertensione.

Su queste cell quindi si deve intervenire per avere un fenotipo normale.

CUORE

Emilina 1 non serve solo per ipertensione ma anche nella fibrosi cardiaca.

Per questo sono state studiate, att diverse tecniche, quale potrebbe essere ruolo di questa proteina

nel tessuto cardiaco.

Si è fatta immunofluorescenza su tessuto cardiaco mediante diversi anticorpi rivolti verso emilina 1,

recettori per fibroblasti.

Il cuore è costituito da diversi tipi cell; cardiomiociti prevalentemente ma anche cell endoteliali,

fibroblasti, cFAPS (cellule progenitrici fibroadipogeniche), periciti e cellule mesenchimali e sistema

immunitario.

Si è cercato di separare le diverse componenti cardiache.

Si prende il tessuto cardiaco da animale.

Lo si tratta con digestioni enz