Conferenze di Genetica forense

I DUE CONTENDENTI

Alla fine si è deciso di sequenziare l'intero genoma.

Il Progetto Genoma Umano ha visto due contendenti:

Craig Venter: presidente della Celera Genomics

• Francis Collins: direttore del National Human Genome Reasearch Institute

•

SHOTGUN GERARCHICO

La strategia che è stata utilizzata per sequenziare il genoma umano (nel progetto Genoma Umano) è

la strategia dello shotgun gerarchico.

Lo shutgun gerarchico, definito anche come approccio “clone by clone”, è infatti il metodo

convenzionale per determinare la sequenza di un genoma eucariotico ovvero di un genoma di

grandi dimensioni.

Come funziona?

Si è estratto il DNA di numerosi soggetti che è stato successivamente frammentato in frammenti di

dimensioni abbastanza grandi parzialmente sovrapposti; in seguito, si è costruita una libreria

genomica ovvero si sono inseriti suddetti segmenti all'interno di vettori BAC (che contengono

frammenti di dimensioni elevate).

Successivamente alla formazione della libreria di BAC, si è generata una mappa fisica del genoma;

ovvero, prima di sequenziare, si è cercato di ordinare la libreria di BAC ovvero conoscere già

quale fosse la sequenza di suddetti frammenti a livello delle differenti regioni cromosomiche.

La costruzione di questa mappa è stata la base per il sequenziamento successivo.

Per ciascun cromosoma, quindi, si è cercato di conoscere la posizione di suddetti frammenti che si

sovrapponevano parzialmente, in modo da ottenere una mappa fisica del genoma.

Dopo aver ordinato questi cloni sovrapposti, si è proceduto con la selezione del numero minimo di

frammenti da sequenziare per ottenere la sequenza completa della regione cromosomica; si è cioè

ottenuto il minimal tiling path.

Infatti, dalla frammentazione casuale si ottengono più frammenti che rappresentano la stessa

regione cromosomica; quindi si è cercato di selezionare il numero minimo di cloni che

rappresentano una data regione cromosomica. Ovvero, sequenziando solamente quei cloni

selezionati, è possibile ricostruire l'intera sequenza cromosomica.

Quindi la mappa fisica ha permesso sia di ordinare i cloni sia di ridurre il numero di cloni da

sequenziare necessario per ottenere l'intera sequenza cromosomica.

Una volta ottenuta questa mappa fisica, si è proceduto con il sequenziamento vero e proprio dei

cloni ottenuti.

Ciascun clone, nello specifico, è stato ulteriormente frammentato e ciascuno di questi segmenti è

stato successivamente sequenziato. Le diverse sequenze dei frammenti sono state assemblate in

modo da ottenere la sequenza completa di ciascuno di questi cloni.

Ricorda!

Il progetto genoma umano ha sequenziato il genoma di numerosi individui provenienti anche da

popolazioni (etnie) diverse; questo ha consentito di identificare immediatamente i polimorfismi

(varianti di sequenza) presenti nel genoma umano.

Da Omiche

Fasi dello shotgun gerarchico

Dal momento che i genomi di grandi dimensioni sono, nella maggior parte dei casi, formati da

cromosomi, il primo step dello shotgun gerarchico consiste nel separare i singoli cromosomi.

Ciascuno di questi cromosomi, quindi, viene successivamente frammentato in modo da ottenere

frammenti di circa 150mila bp.

Tali frammenti vengono quindi clonati all'interno di appositi vettori BAC che vengono utilizzati per

trasformare batteri; in questo modo, si origina la libreria primaria di cloni BAC (che è una libreria

genomica).

La libreria primaria di cloni BAC è costituita, però, da cloni BAC che contengono frammenti

clonati che sono molto sovrapposti tra di loro. Dal momento che il sequenziamento completo di

questa libreria è molto dispendioso, si cerca di ridurre al minimo il numero di cloni BAC che

devono essere sequenziati.

Quindi, dopo aver costruito questa libreria, inizialmente si ordinano i diversi cloni BAC ottenuti in

modo da capire come essi sono sovrapposti tra di loro; per ordinare tali cloni, si costruisce una

mappa fisica dei singoli BAC.

Attraverso questo processo di allineamento, si ordinano i singoli frammenti che si sono originati dal

DNA cromosomico in tanti frammenti sovrapposti.

Una volta che i cloni BAC sono ordinati, si definisce il minimal tiling path ovvero si seleziona il

numero minimo di cloni che, sovrapposti tra di loro, sono in grado di ricostruire la sequenza

genomica completa.

Una volta selezionati questi cloni BAC, si procede con la frammentazione degli stessi (l'inserto di

150mila basi è frammentato in frammenti sovrapposti di 1000-2000 bp) in modo da formare, per

ciascuno di essi, una libreria plasmidica secondaria.

Ogni libreria plasmidica secondaria corrisponde ad un BAC di partenza.

I frammenti dei plasmidi vengono quindi sequenziati (attraverso il metodo shotgun) e si procede

con il loro allineamento; l'allineamento di questi frammenti porta alla formazione della sequenza

consensus del singolo BAC di partenza.

Una volta ottenute le sequenze consensus di ogni BAC appartenente al minimal tiling path, vengono

allineate per originare la sequenza completa del cromosoma.

Mappa fisica

Un punto importante preliminare al sequenziamento del genoma umano è stata la costruzione di una

mappa fisica ad alta risoluzione per ognuno dei cromosomi umani.

Per completare una mappa fisica di 3 miliardi di basi è necessario disporre di librerie genomiche

comprensive di tutto il genoma suddiviso in frammenti parzialmente sovrapposti tra di loro e clonati

in appositi vettori.

Una delle caratteristiche di queste libraries genomiche è che devono essere costituite da grossi

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frammenti di DNA, nell'ordine di 100-300 kb, in modo che con 2-5 x 10 cloni indipendenti è

possibile avere la completa rappresentazione del genoma.

Le mappe di contigui di cloni costituiscono veri e propri blocchi di partenza per il sequenziameno

del DNA.

Si ricordi che una mappa fisica è una mappa che localizza i marcatori sui cromosomi, dando una

posizione espressa con misure fisiche reali, cioè il numero di paia di basi (bp).

Esistono due tipi di mappaggio fisico che si distinguono per la distanza che riusciamo a definire tra

due marcatori:

mappa fisica a bassa risoluzione

• mappa fisica ad alta risoluzione: è ottenuta mediante mappaggio con enzimi di restrizione

• o FISH (uso sonde direttamente sui cromosomi)

Minore è la distanza definita tra due marcatori, più alta è la risoluzione della mappa

Ordinamento di una libreria genomica di cloni BAC

Dopo aver ottenuto una libreria primaria di cloni BAC, è necessario ordinare i cloni BAC ottenuti.

Solo dopo averli ordinati è possibile selezionare il Minimal Tiling Path, ovvero la collezione di

frammenti genomici in grado di coprire la regione cromosomica con il minor grado di

sovrapposizione.

Si ricordi che la somma delle sequenze consensus dei singoli cloni BAC selezionati permette di

ottenere l'intera sequenza del cromosoma di partenza.

Da Omiche:

Lo step più complicato è sicuramente quello di ordinare i cloni BAC.

Mettere in ordine i cloni BAC significa organizzare dei cloni genomici in una mappa fisica, cioè in

un set ordinato di frammenti di DNA su una regione cromosomica.

E' essenziale che la mappa fisica prodotta sia accurata poiché errori a questo livello portano alla

formazione di sequenze cromosomiche chimeriche.

Gli approcci che possono essere utilizzati per ordinare i cloni BAC sono differenti:

chromosome walking: camminare sul cromosoma.

• Questa strategia consiste nello scegliere un clone di una genoteca ed identificare

successivamente un secondo clone il cui inserto si sovrappone a quello del primo. Poi, si

identifica un terzo clone il cui inserto si sovrappone al secondo ecc e così via.

Il chromosome walking può essere di diverso tipo:

1. utilizzo l'inserto del DNA del clone di partenza come sonda di ibridazione per saggiare tutti

gli altri cloni della libreria

2. chromosome walking mediante PCR: si sequenzia per ogni BAC un piccolo frammento al

5' o al 3'. Successivamente si sono disegnano delle coppie di primer per i singoli BAC; con

una coppia di primer si amplifica il DNA di tutti i BAC della libreria. Dov'è presente il

segnale, allora c'è sovrapposizione

fingerprinting dei cloni: le informazioni sulla struttura fisica di un frammento di DNA

• clonato vengono confrontate con le informazioni di altri cloni.

In questo modo è possibile osservare la presenza di somiglianze tra cloni che sono indicative

di sovrapposizione dei frammenti contenuti nei cloni stessi.

Il fingerprinting può essere:

1. per mappa di frammenti di restrizione: sono confrontati i profili di digestione (ottenuti

mediante l'utilizzo di enzimi di restrizione) di cloni BAC.

I cloni BAC che originano il maggior numero di dimensioni uguali sono BAC concatenati

(sovrapposti)

2. del contenuto di sequence-tagged sites (STS): si valuta il contenuto di queste brevi

sequenze uniche, lunghe da 200 a 500 bp, nei cloni BAC

Attraverso l'ordinamento dei BAC, si passa da una libreria altamente ridondante, a un numero di

cloni BAC ridotto che ha il minimo grado di sovrapposizione.

Il numero minimo di cloni è opportuno per ridurre al minimo il lavoro di sequenziamento che deve

essere svolto.

Librerie plasmidiche secondarie

Per ogni BAC selezionato (per ogni BAC che costituisce il minimal tiling path) viene formata una

libreria secondaria plasmidica.

Infatti, il frammento di circa 150mila bp contenuto nel BAC viene frammentato in frammenti di

circa 500-2000 bp che sono clonati all'interno di vettori plasmidici.

Ogni plasmide verrà sequenziato.

Alla fine le diverse sequenze si assemblano a formare contig. L'obiettivo è quello di ottenere, dopo

sequenziamento di ogni singola libreria plasmidica, un unico contig per ogni BAC.

Alla fine i singoli BAC si allineano tra di loro per formare la sequenza cromosomica completa.

Fasi schematiche dello shotgun gerarchico

Le principali fasi della strategia shotgun gerarchico di sequenziamento sono:

1. costruzione di una libreria genomica con inserti cromosomici di grandi dimensioni

2. costruzione di una mappa fisica del genoma e selezione del numero minimo di cloni per

coprire il genoma (minimal tiling path)

3. frammentazione casuale e sequenziamento shotgun dei cloni

4. assemblaggio delle sequenze

LIBRERIE DI cDNA

Perché sequenziare tutto subito se la maggior parte di ciò che interessa sono le sequenze

codificanti?

Venter iniziò quindi la produzione di librerie di cDNA tessuto-specifiche e il sequenziamento di

corte sequenze dette EST (Expressed Sequence Tags); egli quindi pensa di partire dal

sequenziamento delle sequenze codificanti per ricostruire la sequenza del genoma umano (i gap

sarebbero poi stati riempiti).