Citologia e istologia

METODI:

Polisaccaridi → Reazioni PAS + Metacromasia

Acidi nucleici → Reazione di Feulgen + Test di Brachet + UV

Lipidi → Fissare ad Hoc

Inoltre vi sono ACIDOFILIA, BASOFILIA, IMPREGNAZIONI ARGENTICHE

CITOCHIMICA PER AFFINITA' :

Ligando → Molecola estranea ad un compartimento di materia vivente, capace di legarsi

specificatamente ad una molecola di quel compartimento

Sito di legame → molecola di tale compartimento.

Questo metodo sfrutta appunto questo legame per dimostrare un sito di legame. Legame

garantito da una serie di legami deboli ma numerosi.

Recettore → Sito di legame per cui l'unione con il ligando rilascia una risposta dal

compartimento in cui si trova il recettore stesso.

METACROMASIA ( BLU DI TULUIDINA):

Tessuti assumono colorazione diversa rispetto a quella dei colorati utilizzati. Avviene con

sostanze ad alto peso molecolare contenenti molti gruppi anionici liberi ( es.

mucopolisaccaridi).

Proprietà in relazione con la disposizione e numero di radicali anionici che sporgono sul

contorno delle molecole ( proteoglicani).

BLU → Disposizione dei radicali sufficientemente rarefatta, le molecole del colorante sono

rade e ben distanziate. Colorazione ORTOCROMATICA.

ROSSO- VIOLETTO → Radicali numerosi e vicini.

PER LIPIDI:

Coloranti liposolubili (es. SUDAN NERO B, SUDAN III, ROSSO CONGO, BLU NILO)

Questi coloranti si sciolgono nei grassi contenuti nelle cellule grazie alla maggiore affinità

ai grassi rispetto al solvente in cui sono disciolti ( solitamente acido acetico).

Quindi, dato che i lipidi si sciolgono totalmente nei solventi, dopo la fissazione il pezzo

viene tagliato al criostrato.

PER POLISACCARIDI:

Reazione PAS ( ACIDIO PERIODICO DI SCHIFF) solitamente per polisaccaridi neutri

( glicogeno, amido , cellulosa, mucine e glicoproteine)

Reattivo di Schiff (fucsina basica rossa ridotta in acido solforoso)

1) Ossidazione con acido periodico.

I gruppi glicolici ( più precisamente ossidrilici) sono trasformati in gruppi aldeidici i

quali reagiscono a loro volta con la fucsina ridotta (incolore), ossidandola e

riportandola alla colorazione rossa ( elevata basolfilia).

Si utilizzano enzimi per aumentarne la specificità. (es. AMILASI per eliminare il glicogeno e

verificare la scomparsa della colorazione)

PROTEGLICANI + MUCOPOLISACCARIDI + GLICOSAMMINOGLICANI → Colorazione “

ALCIAN BLU”.

LECTINE → Particolare famiglia di proteine vegetali, con capacità di legarsi selettivamente

a specifici residui zuccherini, che possono legarsi a specifici marcatori. ( es. fluorocromi,

perossidasi etc.). Utilizzate per la localizzazione di glicoproteine.

PER PROTEINE:

La maggior parte dei fissativi esercitano un'attività inattivante, perciò vie è la necessità di

preparare il materiale di studio con il criostrato, in altri l'enzima resiste ad una breve

fissazione in formaldeide, gluteraldeide e dialdeide.

Solitamente le tecniche sono basate sull'incubazione di sezione in presenza di opportuni

substrati specifici per l'enzima, quest'ultimo attacca il substrato formando un prodotto di

reazione insolubile e colorato.

Perciò si evidenzia non l'enzima ma il prodotto di reazione che è catalizzato dall'enzima

stesso.

ACIDI NUCLEIDI:

DNA + RNA → Affinità per coloranti basici ( Blu di toluidina + Azzurro B)

Per DNA → Si utilizza reazione di Feulgen → con una blanda idrolisi in Acido cloridrico

vengono allontanate le purine del DNA e RNA, smascherando i gruppi aldeidici del

desossiribosio che possono reagire con il reattivo di Schiff ossidandolo e riportandolo alla

colorazione rosso – porpora nelle zone contenenti cromatina, lasciando incolore il nucleolo

e il citoplasma.

L'intensità della colorazione è dovuta alla quantità di DNA presente.

IMMUNOISTOCHIMICA:

Si avvale delle reazioni tra anticorpo ( proteine con caratteristica forma ad Y e

neutralizzano i corpi estranei) ed antigene (corpo estraneo).

Antigene → o1 o più siti specifici ( EPITOPI → piccola parte dell'antigene che lega

l'anticorpo specifico)

Antigeni proteici → epitopo che presenta un segmento di amminoacidi.

Anticorpi → Presentano una porzione che si lega ad APTENE → porzione costante per

anticorpi di una medesima classe tanto da essere cristallizzabile.

Se legato ad una proteina può diventare antigene.

Reazione antigene /anticorpo → legami deboli ma numerosi.

Da qui deriva l'importanza per caratterizzare l'epitopo, non solo dalla presenza di

particolari sostanze chimiche ma anche la sua organizzazione nello spazio. Con certe

tecniche è possibile localizzare specifiche sostante come actina e miosina anziche una

generica sostanza proteica o saccaridica.

Miosina e actina fungono da antigene , per ognuna delle quali è possibile ottenere un

relativo anticorpo.

Li anticorpi specifici vengono coniugati con sostanze fluorescenti ( rodamina o

fluoresceina) o con molecole opache agli elettroni (come ferritina) .

Quando si fa legare direttamente l'anticorpo marcato con l'antigene si parla di “metodo

diretto” ( poco sensibile di conseguenza poco utilizzata).

Il più usato è il “METODO INDIRETTO” → antigene viene fatto prima reagire con un

anticorpo non marcato (“anticorpo primario”) e poi il complesso creato va a reagire con un

anticorpo marcato (“anticorpo secondario”).

Più copie di anticorpo secondario possono legarsi a quello primario dando un segnale più

evidente (inoltre ciò esclude che la specificità venga alterata da procedimenti chimici).

ISTOAUTORADIOGRAFIA:

Utilizzato per cellule ed organismi vivi → studio della sintesi e traslocazione di prodotti con

un precursore assorbibile e radioattivo.

Vi si utilizza un procedimento Pulse:

Fase 1 → Prelevare campioni di tessuto a varie distanze di tempo.

Fase 2 → Allestimento preparati su vetrini e coprirli con emulsione fotografica.

Fase 3 → Lasciare impressionare e poi sviluppare.

IBRIDAZIONE IN SITU E ANALISI DI IMMAGINI :

Localizzare specifiche sequenze di DNA e RNA.

Si basa sul principio secondo il quale le sequenz nucleotidiche complementari sono in

grado di appaiarsi tra loro in particolari condizioni sperimentali, la marcatura specifica delle

due sequenze permette di localizzare sequenze bersaglio a cui essa si appaia.

L'analisi di immagini ci può permettere di stabilire : forma, taglia, numero e densità ottica.

STRUMENTAZIONE → Computer con dispositivo di ingresso capace di raccogliere

immagini collegato ad una scheda che traduce queste immagini in forma digitale.

ARCHITETTURA GENERALE DELLA CELLULA:

Protoplasma → sostanza vivente costitutiva della cellula.

La cellula è circoscritta da membrana plasmatica.

La cellula animale è formata da CITOPLASMA+NUCLEO.

CITOPLASMA → e' formato da due fasi : una otticamente omogenea (IALOPLASMA) +

differenziazioni citoplasmatiche (organuli + inclusi)

Contiene il citoscheletro il quale è un sistema di strutture proteiche filamentose che

definisce la forma e a mobilità.

Organuli → Golgi, lisosomi, mitocondri, RE e ribosomi presenti in ogni cellula, sono attivi

metabolicamente.

Inclusi → Materiali di riserva, pigmenti, granuli di secreto sono accumuli di prodotti

cellulari metabolicamente inerti e caratteristici di solo alcuni tipi cellulari.

Nucleo → Centrale, generalmente unico (oppure polinucleato o non nucleato). Involucro

nucleare lo separa dal citoplasma.

Contiene la cromatina (sostanza colorabile con coloranti basici) e nucleoli.

Capitolo 3 : Citoplasma, RE, Golgi e Traffico

Vescicolare

CITOPLASMA:

Costituito da :

• IALOPLASMA → Parte otticamente attiva e omogenea il quale contiene organuli

ed inclusi. E' molto ricco di acqua in cui sono contenute molecole proteiche ed

enzimi.

La presenza di un discreto numero di molecole di grandi dimensioni conferisce al

suddetto ialoplasma le caratterische fisiche di COLLOIDE ( sistema colloidale

estremamente energico e polifasico)

• FASE DISPERSA → Composta da complessi citoplasma-macromomolecolare-

proteici i quali interagiscono con legami reversibili ( a H e Van der Waals)

Il grado di viscosità del colloide non è stabile perciò viene chiamato “ PLASMAGEL” se il

grado di viscosità è molto alto oppure “PLASMA SOL” se invece è più basso.

La variazione SOL-GEL → Causato da una variazione dei legami.

INCLUSI → Presenti nel citoplasma solo di alcune cellule.

Tipi di inclusi :

• Pigmenti → Dotati di colore proprio ( es. Melanina, Lipofucine le quali sono

lisosomi)

• Secreti → Materiale temporaneamente accumulato sottoforma di granuli per poi

essere espulso tramite il processo di SECREZIONE:

• Paraplasmi → Inclusi con funzione di materiale di riserva come GLICOGENO e

GOCCE LIPIDICHE.

• Alloplasmi → Sono inclusi fibrillari (es. TONOFIBRILLE delle cellule epiteliali /

MIOFIBRILLE delle cellule muscolari / GLIOFIBRILLE degli astrociti etc.)

• Altri inclusi → es. CRISTALLI DI RENKIE nelle cellule interstiziali del testicolo.

Il citoplasma si presenta quasi sempre acidofilo ( a causa della presenza delle proteine)

IALOPLASMA → Alcuni tipi cellulari presentano uno ialoplasma basofilo , basofilia diffusa

o in ammassi irregolari ( in questo caso si chiama ERGASTOPLASMA).

La sostanza basofila del citoplasma assorbe selettivamente UV a 260 nm.

Se si applica RIBONUCLEASI sia la basofilia che l'assorbimento UV a 260 nm sono

aboliti. (Presenza RNA in area)

Colorazione VERDEMETILE → Lega specificatamente DNA ( colorazione verde)

PIRONINA → Aspecifico, colora di rosso sia RNA che proteine, con il TEST DI

BRANCHET diventa specifico. Tratta sezione succeiva a

quella colorata con verde

metile- pironina con

RNAasi

RIBOSOMI

Citoplasma basofilo → Ricco di ribosomi.

Ribosomi → Piccoli granuli di circa 15 nm composti da RNA e proteine. Sono deputati alla

sintesi proteica.

I ribosomi liberi sono abbondanti nello ialoplasma delle cellule in proliferazione(es. Cellule

embrionali) e nelle cellule sintetizzanti proteine non destinate all'esportazione ( es.

Linfociti, Eritoblasti e Mioblasti)

I ribosomi non aggregati a membrana sono la sede di sintesi delle proteine strutturali del

citoscheletro, di enzimi attivi nello ialoplasma, di proteine nucleari e mitocondriali e quelle

necessarie per la divisione cellulare.

I ribosomi associati alla membrana del reticolo endoplasmatico ( liscio e ruvido), del Golgi,

dei lisosomi.

Sia i ribo liberi che associati membrana solitamente vanno a disporsi in catenelle chiamati

POLIRIBOSOMI, acqui