Botanica forense

MOLECOLARI

Si utilizzano le macromolecole presenti nel DNA per identificare le specie

usandole come marcatori, avendo la possibilità di effettuare analisi a

livello interspecifico o sopra il livello tassonomico della specie, oppure

attraverso altri tipi di analisi più fini addirittura arrivando a livelli

intraspecifico quindi sotto il livello di specie.

Un approccio interspecifico molto utilizzato è quello dell’analisi di

sequenza e di conseguenza l’utilizzo di tali sequenze nucleotidiche serve

per ricostruire una filogenesi molecolare; questo è necessario per riuscire

a classificare il campione che si fa nell’ambito forense.

Ci sono degli aspetti da valutare, come la tipologia della regione o delle

regioni di DNA che possono essere utilizzate per la classificazione: in

ambito vegetale le principali regioni che vengono prese in esame

provengono dal DNA plastidiale e in particolare dal DNA del cloroplasto

oppure da quello nucleare; c’è anche la possibilità di utilizzare il DNA

mitocondriale.

I vantaggi rispetto ad un approccio morfologico (che non deve per forza

escluso ma magari integrato) sono diversi come quello che riguarda la

descrizione dei caratteri che non è ambigua: la sequenza nucleotidica è

oggettiva e non può cambiare.

Inoltre viene escluso anche il problema dell’evoluzione convergente dove

si hanno fenotipi simili ma genotipi differenti e di conseguenza di nuovo

si potrebbero avere delle relazioni ambigue di riconoscimento tra

organismi che il DNA va a superare.

Analizzando fino a quattro regioni di DNA differenti di circa 1000 paia di

basi ciascuna, si considera che ognuna di quelle basi nucleotidiche è un

singolo carattere, quindi si stanno analizzando 4mila caratteri diversi, il

che è impensabile se si utilizzasse un approccio di tipo morfologico.

Questo è molto importante e discriminante da un punto di vista evolutivo

e della classificazione delle varie specie poiché si studiano in massa i dati

dei campioni.

È possibile utilizzare modelli statistici rigorosi che permettono una

standardizzazione della tecnica di analisi quindi utilizzando determinate

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regioni è possibile risalire alla topologia dell’albero filogenetico ottenuto

e proposto prima da altre persone e che rappresenta ad alti livelli quello

che si osserva. Analisi del DNA non codificante: oltre alle regioni

codificanti che sono maggiormente conservate, si possono analizzare

regioni di DNA non codificanti e che potenzialmente accumulano una

maggiore percentuale di variabilità e ciò permette di massimizzare

l’efficienza dell’analisi fatta.

Nell’analisi molecolare può

esserci il problema della

paralogia perché è possibile

trovarsi di fronte a quelli che

sono dei geni paraloghi o delle

regioni di DNA parologhi ossia

che da un punto di vista evolutivo, quella regione di DNA che si sta

analizzando, per qualche motivo ha subito una duplicazione genica.

Quando si vanno ad analizzare due organismi che fanno parte della

stessa popolazione o della specie e che presentano questa condizione (a

insaputa dell’operatore) si mette in evidenza un’evoluzione dei geni che

però non interessa in questo ambito di studio. Questi casi si hanno nelle

specie che presentano diversi citotipi quindi gruppi di individui che fanno

parte della stessa specie ma che si separano da un punto di vista del

numero cromosomico; di conseguenza questo fenomeno è frequente nei

marcatori che provengono dal DNA nucleare.

Evoluzione indipendente tra DNA dei cloroplasti e DNA nucleare: si ha

una non congruenza degli alberi filogenetici il che è un potenziale

problema perché si ottengono due filogenesi differenti ossia non

congruenti e ciò non permette l’analisi di regioni di DNA che provengono

sia dal cloroplasto che dal nucleo e non le si può concatenare.

Per massimizzare il potere di risoluzione dell’analisi che si sta svolgendo,

potenzialmente si possono prendere tanti frammenti di DNA del

cloroplasto e del nucleo, si possono concatenare formando un’unica

lunga sequenza che poi si può analizzare confrontandola con quella di

altri organismi. In questo modo si aumenta il numero di caratteri

analizzabili rendendo la filogenesi statisticamente sempre più sostenuta.

Usando questo metodo si deve stare attenti alla congruenza della

topologia tra gli alberi filogenetici ottenuti tra i due DNA se no non si

possono concatenare i due marcatori che hanno origini differenti.

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Analisi di sequenza

Si procede con le sequenze ottenute in laboratorio da DNA estratto da un

frammento vegetale ben conservato di una specie X usando due

marcatori molecolari differenti chiamati Internal transcribed spacer (con

le tre regioni di un totale di 700 paia di basi ITS1-5.8s-ITS2 di cui il primo

e il terzo sono due spaziatori intergenici mentre il secondo è una regione

codificante per l’RNA ribosomiale) e spaziatore trnL-trnF (regione di DNA

che si trova tra l’RNA transfer per la leucina e per la fenilalanina.

Dopo aver ottenuto il campione in laboratorio ed essere stato catalogato,

si deve estrarre il DNA dal frammento vegetale e si deve amplificare in

quelle due regioni selezionando i primer specifici per quelle due regioni e

tramite la reazione a catena della polimerasi si ottengono dei prodotti

PCR da purificare e mandare al sequenziatore Sander che restituisce gli

elettroferogrammi.

Dagli elettroferogrammi si ottengono:

1. dal marcatore molecolare nrDNA - Internal transcribed spacer (ITS1-

5.8s-ITS2) si ottengono due sequenze chiamate Fwr e Rev;

2. per marcatore molecolare: cpDNA - spaziatore trnL-trnF si

ottengono due sequenze chiamate Fwr e Rev.

In laboratorio si procede col fare più sequenze dello stesso campione di

riferimento ma già avere quelle due sequenze è un controllo preciso di

ciò che si deve andare a studiare.

Si hanno allora quattro sequenze nucleotidiche, si prende la prima, la si

copia e si copia su “BLAST” (sito internet che permette di importare

sequenze nucleotidiche o proteiche e in maniera automatizzata fare un

multi allineamento con tutte le sequenze nucleotidiche che vi si sono

state depositate all’interno). Si incolla la sequenza all’interno della

finestra apposita, dopo di che si specifica che tipo di database

interrogare quindi se è standard o di altro tipo, e si può anche indicare il

tipo di organismo anche se è meglio rimanere sul generale.

In questo modo il sistema restituisce tutta una lista di organismi più

similari a quello che possiede la sequenza nucleotidica che è stata

inserita dall’operatore; il valore che interessa maggiormente è il “query

cover” ossia quanta percentuale della sequenza depositata è coperta da

quella dell’organismo che la possiede simile, e l’altro valore è la

“percentuale d’identità”.

Un aspetto molto importante è anche che specifica il tipo di marcatore

che è stato utilizzato dal momento che se si va ad analizzare un

campione vegetale e il database produce dei risultati con dei marcatori

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umani/animali, significa che l’operatore ha commesso degli errori o c’è

un inquinamento delle prove; lo stesso discorso si pone nel caso dei

primer.

I riferimenti “query cover” e della “percentuale d’identità” sono

importantissimi perché così si ha certezza di una determinata

percentuale che la sequenza caricata è identica a quella di un organismo

trovato e conosciuto. Si può anche cliccare poi su un codice a destra che

riporta la pagina relativa del campione con ulteriori informazioni e tutta

la sequenza nucleotidica dell’organismo: questo funziona come

riferimento per l’identificazione del campione ignoto che si ha in

laboratorio per ricostruire una filogenesi.

Analizzando le sequenze Fwr e Rev derivanti da entrambi i marcatori si

nota come una non è conforme alle altre: si tratta di un fungo infestante

la pianta a cui appartengono le altre tre sequenze. Per questo motivo è

importante attuare questo tipo di analisi più volte e soprattutto

analizzare il DNA del cloroplasto dal momento che i funghi non li

possiedono mentre quello del nucleo lo possiedono tutti.

Dopo aver fatto questo passo, si possono recuperare le sequenze

nucleotidiche che serviranno per l’analisi filogenetica così da inserire il

campione ignoto. Per iniziare ciò si deve preparare un file in formato

FASTA (formato che molti software leggono per fare multi allineamento

prima e ricostruzione delle relazioni evolutive dopo) recuperando la

maggior parte di sequenze nucleotidiche di riferimento di specie che

sono potenzialmente affini.

Per trovare le specie che risultano affini basta controllare i risultati di

BLAST in cui ci sono molte specie che possiedono percentuali molto alte

di affinità. Per preparare un nuovo formato FASTA si deve fare un nuovo

file di testo con:

>specieX (in cui X sarebbe ignoto) e la sequenza nucleotidica nel rigo

sotto

Nelle righe sotto si aggiungono le sequenze nucleotidiche delle specie

più vicine ottenute da BLAST: per prima cosa va messo il codice GenBank

(si trova in alto ed è identificato con “Locus”, è univoco del campione

depositato):

>codice GenBank specie e sequenza nucleotidica

Così via per tutte le altre specie affini.

Dalle diverse specie affini si ottengono le loro accezioni e insieme alla

specie X il tutto compone delle sequenze nucleotidiche grezze: il passo

successivo (il secondo) è eseguire un allineamento di queste sequenze.

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Tali sequenze vengono messe a confronto tra di loro e si individuano

delle regioni comuni ed eventuali locus che sarebbero dei punti di

variabilità ossia delle mutazioni puntiformi o delle ripetizioni; possono

anche essere presenti delle delezioni o delle inserzioni.

L’ultima sequenza che si ha nel caso del multiallineamento è data dal

programma e si tratta di una sequenza di consenso che mette in

evidenza la sequenza che trova il maggior consenso cioè quella zona che

trova la maggiore “consistenza” e la minore “variabilità”.

La sequenza di consenso serve per fare un controllo con

l’elettroferogramma e vedere se esistono effettivamente quelle

mutazioni perché da un punto di vista pratico gli elettroferogrammi

possono presentare degli errori legati a come il sistema ottico della

macchina legge i picchi di fluorescenza dei frammenti al momento

dell’arrivo.

Tutti i programmi di

multiallineamento

funzionano allo stesso

modo più o meno: si

prend