Botanica applicata

Botanica applicata: stress da metalli pesanti nelle piante

Metalli pesanti

Metalli pesanti: elementi naturali presenti negli ambienti terrestri in diverse concentrazioni, rimangono nel terreno e non possono essere eliminati; i principali metalli pesanti sono: cadmio, cromo, cobalto, rame, argento, manganese, mobildeno, piombo, zinco, nichel. Hanno due diverse origini:

• Naturale: suoli serpentinici (Ni, Cr, Co), calaminici (Zn, Pd, Cd), eruzioni vulcaniche
• Antropica: scarichi industriali, agricoltura (pesticidi, erbicidi), estrazione mineraria

I metalli pesanti sono tra le sostanze più tossiche e persistenti nell'ambiente e causano gravi danni a tutti gli organismi viventi; la loro caratteristica è di essere: Innocui (allo stato elementare, tranne Hg) e Tossici (nella forma cationica, più diffusibili ed assimilabile dagli organismi).

Disponibilità dei metalli pesanti nelle piante

In natura i metalli possono essere direttamente assimilati dalle piante oppure subire delle modificazioni, da parte della piante, che li rendano disponibili. Gli ioni metallici (carica +) vengono attratti da suoli e sedimenti colloidali (carica -) a causa della presenza di gruppi idrossilici e doppietti elettronici presenti in substrati argillosi o gruppi (carbossilici, fenolici) presenti nelle sostanze organiche.

Ci sono diversi fattori che favoriscono il rilascio di metalli da sostanze colloidali e complessi, in questo modo influenzano la biodisponibilità dei metalli e la loro concentrazione:

• Suolo: caratteristiche chimiche (pH, forza ionica, potenziale redox), tessitura, contenuto di sostanza organica o suolo argilloso. Es. pH basso: + biodisponibilità di metalli -> perché ioni H⁺ hanno alta affinità per cariche negative e competono con i metalli per il legame con i siti colloidali.
• Ambiente acquatico: caratteristiche chimiche (pH, particelle, agenti complessanti, forza ionica, potenziale redox), tipo di metallo, salinità, intensità luminosa e di O₂. Es. + Sali: + complessi metallo-Cl -> difficilmente assimilabili da piante e altri organismi

Inoltre la fitodisponibilità di metalli dipende da: Tipo di metallo, Tipo di suolo, specie vegetale.

Assorbimento dei metalli da parte di piante terrestri ed acquatiche

In natura, i metalli sono presenti in aria, acqua, suolo, sedimenti; inoltre le piante possono rilasciare metalli in acqua, suolo o in aria (dalla foglie). L’accumulo di metalli da parte delle piante dipende da: assorbimento nei tessuti, rilascio nel mezzo circostante.

Assorbimento radicale

I metalli vengono assorbiti a livello dell’Apoplasto radicale; è un meccanismo passivo, non metabolico, regolato da meccanismi di diffusione e flusso di massa. Con apoplasto si indica il sistema continuo di pareti cellulari e spazi aeriferi intercellulari dei tessuti della pianta che hanno perso il loro citoplasma (es. dotti xilematici, fibra), nella via apoplastica l’acqua può muoversi attraverso le pareti cellulari e qualsiasi spazio extracellulare ripieno di acqua (senza attraversare la membrana).

Una volta entrati nella pianta i metalli possono avere 3 destini diversi:

1. Via apoplastica.
2. Legame con sostanze cariche negativamente presenti della parete cellulare: ioni metallici possono muoversi attraverso i pori presenti nella parete primaria delle cellule vegetali; es. gli acidi poligalatturonici sono carichi negativamente.
3. Cellule: possono attraversare la membrana plasmatica e raggiungere il citoplasma, in cui si legano a molecole cariche negativamente come acidi organici o Fitochelatine (polipeptidi ricchi di zolfo) -> si formano complessi che facilitano il trasporto del metallo nel vacuolo o in strutture cellulari. I metalli possono anche accumularsi nel citoplasma.

Fitochelatine

Peptidi semplici formati da Glutammato, cisteina, glicina; in presenza di metalli pesanti vengono sintetizzati a partire dalla Fitochelatina sintasi. Sono presenti in alghe, funghi, muschi, piante superiori.

La fitochelatina sintasi si attiva in presenza di gamma-glutammil -cisteina (dominio presente in glutatione o in una fitochelatina) e di un metallo pesante (libero o legato a gruppo SH); quando tutti gli ioni metallici sono stati catturati dalle fitochelatine la reazione termina e la fitochelatina sintasi viene inattivata.

Nella fitochelatina sintasi: sito catalitico (su dominio ammino-terminale), sensore metalli pesanti (dominio carbossi-terminale); in quest’ultimo dominio sono presenti alcune cisteine che agganciano il metallo e lo portano a contatto con il sito catalitico attivandolo.

Lo stress da metalli pesanti attiva diversi processi ovvero prevenzione, disintossicazione e riparazione; perché essi siano possibili vengono prodotte diverse molecole (risposta a ventaglio): essudati radicali, fitochelatine, etilene da stress, perossidasi, metallotioneine, proteine da stress, acidi organici, lignificazione radicale.

Assorbimento fogliare

I metalli in forma gassosa vengono assorbiti dalle foglie tramite gli stomi, gli ioni entrano attraverso la cuticola.

Flusso dei metalli

I metalli possono essere rilasciati dai tessuti vegetali, si forma un flusso che procede in questo modo: vacuolo -> citoplasma -> apoplasto -> ambiente circostante.

L’assorbimento dei metalli da parte di radici e foglie aumenta con l’aumentare della concentrazione del metallo nell’ambiente circostante; NON è una correlazione lineare perché dipende dal grado con cui i metalli vengono rilasciati dai tessuti (metalli si legano ai tessuti causando saturazione dei siti di legame). Ci sono altri fattori che influenzano l’assorbimento:

• Superficie di assorbimento: lunghezza, grado di ramificazione della radice
• Fattori esterni: temperatura, luce, salinità, competizione con altri metalli o cationi
• Presenza di micorrize (micelio può aumentare assorbimento dei metalli da parte della radice)

Es. assorbimento metalli aumenta con aumento pH in soluzione e diminuisce con aumento pH del suolo.

Trasporto e distribuzione dei metalli pesanti nella pianta

Alcuni metalli (es. Cadmio, Zinco) sono più mobili di altri (Rame, Piombo).

Xilema: tessuto vegetale presente nelle piante vascolari ed adibito al trasporto della linfa grezza (acqua, soluti) dalle radici alle foglie; lo xilema è formato da cellule che subiscono un processo di lignificazione delle pareti secondarie, muoiono a maturità. Comprende due tipi di elementi: trachee (angiosperme, formano un vaso), tracheidi (gimnosperme).

Floema: presente nelle piante vascolari, è lo strato più interno della corteccia negli altri. È un complesso di tessuti viventi con triplice funzione (trasporto, riserva, sostegno).

Traslocazione: i metalli assorbiti a livello radicale passano nei vasi xilematici dove vengono traslocati; attraverso i vasi floematici la traslocazione è difficile perché il floema è formato da cellule vive con siti di legame per gli ioni. Es. lo zinco viene traslocato complessato con acidi organici. Es. rame viene legato ad amminoacidi. Es. cadmio viene traslocato sotto forma di ione bivalente.

Distribuzione: la maggior parte dei metalli pesanti (75-90%) resta nelle radici legato alle pareti cellulari, sono pochi arrivano nel fusto.

Accumulo dei metalli nei tessuti vegetali

I metalli vengono accumulati nelle pareti cellulari mediante il legame con cariche negative. Le fitochelatine agiscono da Shuttles per trasportare i metalli nel vacuolo dove vengono immagazzinati o come “complesso di accumulo” (Ph-metallo) nel citoplasma.

Gli acidi organici (citrato, malato, ossalato, trans-aconitato) possono legarsi ai metalli ed agire come shuttle per il trasporto nel vacuolo o per immagazzinamento nel citoplasma (acido organico – metallo).

In base alla capacità di accumulare i metalli e possiedono specifici meccanismi di detossificazione; possiamo distinguere piante:

• Sensibili, tolleranti
• Indicator: accumulano metalli in modo proporzionale rispetto alla concentrazione esterna
• Excluder: piante che accumulano basse concentrazioni di metalli, anche in presenza di alte concentrazioni esterne; queste piante possiedono barriere che non permettono l’assorbimento, se la concentrazione diventa eccessiva la barriera perde la sua funzione
• Iperaccumulatrici: piante caratterizzate da una bassa biomassa poiché usano la loro energia per gestire alte concentrazioni di metalli nei loro tessuti. Sono organismi che accumulano una quantità di A (Cobalto, rame, cromo, piombo, cadmio, nichel) > 0,1% o B (Manganese, zinco) > 1%.

→ Baker e Brooks 1989. Esempi di piante iperaccumulatrici: Thlaspi caerulescens (Cd > 0.1, Zn > 10): crescione alpino, pianta da fiore appartenente alle brassicacee, Minuartia verna (Pb > 1), Aeollanthus biformilius (Co Cu >1).

Tossicità dei metalli pesanti

I metalli pesanti sono tra gli inquinanti più tossici e diffusi nell’ambiente, causano numerosi danni agli organismi tra cui:

• Problemi respiratori, inibizione attività enzimatica
• Denaturazione proteine, degradazione del DNA

In particolare nelle piante causano: necrosi, clorosi (no produzione clorofilla), inscurimento delle radici, diminuzione della crescita e di conseguenza dei tessuti. Le piante hanno delle difese per proteggersi dai metalli pesanti (prevenzione, detossificazione, riparo del danno): immobilizzazione, compartimentalizzazione, proteine, etilene, esclusione, lignificazione, essudati radicali, fitochelatine, metallotioneine (proteine presenti nell’apparato di Golgi affini ai metalli pesanti).

Effetti dei metalli pesanti nei vegetali

A basse concentrazioni alcuni metalli pesanti sono microelementi essenziali (es. rame, nichel zinco).

Effetto macroscopico

L’effetto macroscopico è visibile tramite test di germinazione (in laboratorio arpa o in campo); è possibile effettuare un’analisi floristica e vegetazionale che dà informazioni sulla salute delle piante in sito:

• Analisi floristica-vegetazionale -> metodo Braun – Blanquet (si analizza la copertura vegetale dell’area di studio, % di ricopertura vegetale, specie presenti)
• Valutazione stato di salute delle piante: considero piante della stessa specie che vivono in habitat simili.

Foglie: colore (giallo determina clorosi), caduta anticipata delle foglie, foglie secche. Malattie, parassiti, presenza di necrosi, arricciamenti, accortecciamenti. Presenza di essudati (emissione come difesa per la penetrazione di patogeni).

Analisi del contenuto in MP: tramite spettrometria di massa di preparati di fusto, radici, foglie, frutti. Determinazione indice di stress tramite PEA: è stato misurato usando lo strumento PEA che valuta l’efficienza del fotosistema II; piante stressate hanno indice Fv/Fm < 0.830. Il valore ottimale è 0.850.

[Fotosistema II: primo fotosistema coinvolto nelle reazioni fotosintetiche delle piante e alcuni batteri; si trova nei cloroplasti a livello della membrana dei tilacoidi; l’enzima cattura fotoni ed usa energia per aumentare il livello energetico degli elettroni che vengono usati per ridurre plastochinone in plastochinolo] I metalli pesanti determinano una diminuzione dell’efficienza fotosintetica.

Nei saggi in vitro le specie individuate nella coltura idroponica, vengono posizionate in vaso per valutare gli effetti dei singoli inquinanti; nell’esperimento le plantule di Pisum sativum (pisello) sono state fatte crescere per 5 giorni in coltura idroponica (coltivazione fuori dal suolo, terra sostituita da substrato inerte come argilla o vermiculite; viene irrigata con soluzione nutritiva; consente produzioni controllate dal punto di vista qualitativo e sanitario):

1. Sterilizzazione semi
2. Germinazione semi in condizioni di crescita controllate
3. Messa in soluzione
4. Prelievo a 24h
5. Prelievo a 48h

Effetto microscopico (dal macro al cellulare)

Le radici delle piante vengono suddivise in due gruppi:

1. Fissate: fissazione tramite camoy, colorazione Feulgen degli apici radicali e osservazione al MO -> vedo effetti di Cd su mitosi
2. Non fissate: analisi citofluorimetria su radici non fissate e prive di apici -> vedo effetti Cd su popolazioni nucleari delle zone differenziate

Gli effetti del Cd sull’attività mitotica -> anomalie mitotiche a livello di metafase ed anafase.

Risposte delle piante ai metalli pesanti

Sintesi di fitochelatine (PCs) e metallotioneine (MTs).

Fitochelatine: sono gamma-glutammil peptidi composti da glutammato, cisteina e glicina; vengono sintetizzate a partire dal glutatione, in presenza di metalli pesanti o anioni multi-atomici, dalla Fitochelatina sintasi.

Metallotioneine: peptidi ricchi di cisteina, generalmente senza gruppi aromatici; sono presenti in animali, cianobatteri, funghi e piante (scoperta recente). Venivano raggruppate in due classi: classe I (mammiferi), classe II (comprendeva le fitochelatine); ora le fitochelatine sono a parte. Hanno diverse funzioni: morfogenesi (apparato radicale), detossificazione dei metalli, omeostasi metalli essenziali (in particolare rame), produzione radicali liberi, trasporto intracellulare di metalli; la loro sintesi è anche indotta da fattori di stress diversi dai metalli (es. osmotico, termico, senescenza, ferite, virus).

Heat shock protein (HSPs): sono proteina da stress, fortemente affini a proteine denaturate -> le aiutano a ritrovare la loro struttura e le reintegrano in membrana. I meccanismi di riparazione dei danni operati da HSPs sono indotti soprattutto da stress acuto, le risposte descritte prima sono innescate da stress acuto e cronico.

Ci sono altri sistemi di detossificazione:

• Nichel: chelato da istidina e/o acidi organici
• Cr VI: ridotto a CrIII e legato a gruppi carbossilici di aa
• Cu: induce sintesi di fitochelatine e viene immobilizzato nella parete
• Altri metalli (Cd, Hg, Zn, As, Co): stimolano la sintesi di Proline che impediscono la denaturazione proteica, proteggono i gusci di idratazione delle proteine

Caso di studio 1: meccanismi di risposta al cadmio in 2 macrofite acquatiche

Le macrofite acquatiche sono un gruppo definito su base ecologica funzionale che comprende vegetali macroscopicamente visibili presenti negli ambienti acquatici; nel caso di studio sono state coltivate all’aperto in laghetti artificiali (4 laghetti, 2 per ogni pianta). Le 2 specie sono:

• Pistia stratiotes: Lattuga d’acqua pianta acquatica natante perenne
• Eichhornia crassipes: Giacinto d’acqua pianta acquatica natante che galleggia grazie alla presenza del parenchima aerifero (tessuto parenchimatico con grandi spazi che fanno passare aria)

Lo scopo era quello di rispondere a due domande:

• Le due macrofite hanno elevate attitudini al bioaccumulo di Cadmio e in quali organi?
• Le strategie di difesa nei confronti dello stress indotto dal Cadmio sono simili o diversi a seconda della specie?

Gli esperimenti sono stati effettuati nel periodo di tempo compreso tra giugno-luglio di 2 anni consecutivi, i laghetti sono stati trattati con cadmio a diverse concentrazioni (0, 25, 100 micromolare) per 21 giorni.

Lattuga d’acqua: il cadmio viene accumulato soprattutto nelle radici.

Giacinto d’acqua: il cadmio viene accumulato nelle foglie, solo con la concentrazione di 100 micromoli si arriva ad un livello di accumulo nella radici confrontabile alla lattuga al 25 micromolare. In questa pianta, nei vacuoli delle cellule del mesofillo fogliare, sono presenti accumuli di fenoli con gruppi OH; è una risposta delle piante a stress di varia natura.

Cristalli di ossalato di calcio: in nessuna delle due specie sono presenti accumuli di ossalato di calcio (in alcune piante questi si accumulano nei vacuoli, è un sistema della pianta per degradare i metalli dal citoplasma; acido ossalico si lega ai metalli pesanti). Usata elettroforesi capillare.

Accumulo peptidi tiolici (glutatione, fitochelatine):

• Foglie (giacinto d’acqua): si ha maggior quantità di glutatione a 25 micromolare, ma produzione diversa di fitochelatine.
• Radici (lattuga d’acqua): diminuzione del flutatione a 25 micromolare perché viene usato per produrre fitochelatine -> i livelli costitutivi e indotti di Cadmio e fitochelatine è più elevato in lattuga d’acqua sia nelle foglie che nelle radici.

Le piante rispondono in modo diverso allo stress indotto dal Cadmio:

• Lattuga d’acqua: contrasta Cd usando peptidi tiolici (glutatione, fitochelatine).
• Giacinto d’acqua: ricorre a sistemi antiossidanti non tiolici (enzimi: perossidasi, superossidodismutasi, -> ciclo ascorbato-glutatione).

Non è stato riscontrato nessun danno macroscopico (no diminuzione peso secco, scarse alterazioni); entrambe le specie sembrano tolleranti al cadmio.

Caso di studio 2: osservazione delle alterazioni strutturali in Elodea canadensis

In questo caso di studio sono state osservate le alterazioni strutturali e l’eventuale presenza di HSPs70 nella monocotiledone Elodea canadensis (monocotiledone, erbacea acquatica) esposta per 6 giorni a Cadmio, Cromo, Rame, Piombo e Zinco.

L’esposizione al cadmio ha inibito la biosintesi di clorofilla, (enzima protoclorofilla reduttasi) probabilmente a causa dell’interazione con il gruppo SH di questo enzima.

In generale i metalli pesanti inibiscono la sintesi di clorofilla totale, possono sostituire l’atomo di Mg determinando la perdita di funzionalità della clorofilla.

Inquinamento atmosferico

Inquinanti atmosferici: sostanze che alterano la composizione chimica dell’aria, dannose per uomo e ambiente; già nel 1827 un dipinto rappresentava le emissioni di una fonderia in Scandinavia.

Classi di inquinanti: SOx (ossido di zolfo), Nox (ossido di azoto), CO (monossido di carbonio), O₃ (ozono), PM (particolato atmosferico), C₆H₆ (benzene), IPA (idrocarburi policiclici aromatici), elementi in tracce (As, Cd, Ni), Pb.

In base all’origine possono essere:

• Primari (SOx, Nox, NH₃, HCl, metalli pesanti, diossine): tossici nella forma in cui vengono emessi
• Secondari (ozono, acido nitrico e solforico): derivano dalle reazioni dei primari
• Intermedi (PM, nanoparticelle): in parte primari e in parte secondari

In base allo stato fisico: gassosi (NH₃, O₃, SOx, Nox), particellari (aerosol, nebbie, polveri, fumi).

Ossidi di zolfo (SOx)

Costituiti principalmente da SO₂ (biossido di zolfo), in minima parte da SO₃ (anidride solforica). SO₂ è un gas...