Biotecnologie delle fermentazioni appunti completi

INTRO A PROCARIOTI, METABOLISMO E FERMENTAZIONE

ALCOLICA

Biotecnologie = ogni tecnologia che utilizza essi viventi (batteri, lieviti, cell vegetali, cell animali di

organismi sei lici / complessi) o loro componenti sub-cellulari purificati (organelli, enzimi) al fine di

ottenere quantità rilevanti (dipende da tipo di prodotto) di prodotti utili o per migliorare caratteristiche

piante e animali o per sviluppare microorganismi utili per specifici usi

Procarioti e eucarioti

Procarioti

Suddivisi in 2

• progenitore comune Progenote

• principali differenze nell’apparato di trascrizione e traduzione e membrana cellulare (quasi tutti

parete esterna a membrana)

a. Archeobatteri = molte sequenze rRNA simili a eucarioti, hanno polimerasi grandi e

complesse, in alcuni loro geni presenti introni (non codificanti), nella parete non hanno acido

muramico (principale costituente del peptidoglicano) e i lipidi della membrana sono

ramificati.

b. Eubatteri = rRNA molto diversi da eucarioti, RNA polimerasi piccole, peptidoglicani nella

parete e la membrana ha lipidi non ramificati

Classificazione

Suddivisione procarioti in base a forma

Cocchi = sferici

o - Streptococchi = uniscono a formare catene

- Stafilococchi = uniscono a formare grappoli

Bacilli = a bastoncino

o - Diplobacilli = uniscono a coppie

- Streptobacilli = uniscono a formare catene

Vibrioni = curvi a virgola

o Spirilli = forma a elica corta e rigida

o Spirochete = forma a elica ma strutture lunghe e flessibili

o

Suddivisione in base alla modalità di nutrizione

a) Autotrofi

= usano energia esterna per prodursi molecole utili

a. Fotoautotrofi

= usano energia solare

- Producono glucosio

b. Chemoautotrofi

= usano energia chimica da componenti chimici inorganici

b) Eterotrofi

= non sono in grado di produrre da sé molecole utili ma le introducono cibandosi di altri essere viventi

a. Fotoeterotrofi

= usano energia solare per fare molecole energetiche ma non molecole organiche utili per il

metabolismo

b. Chemoeterotrofi

= prendono energia da molecole organiche esterne

Suddivisione in base a colorazione specifiche

Gram-positivi = colorazione positiva (si colorano) a colorazione di Gram, di solito quelli che hanno

o parete compatta

Gram-negativi = non si colorano perché colorante si perde nello spazio periplasmico tra parete e

o membrana E.coli

Suddivisione in base alla temperatura di crescita ottimale (in ordine di T crescente)

Criofili / psicrofili 4-6 °C

o Mesofili 18/20-40 °C (optimum 37 °C)

o Termofili / estremofili 45/50-80/90 °C

o

Metabolismo primario e secondario

Metabolismo primario

= insieme di processi e di reazioni necessarie per la sopravvivenza della cellula, sia batterica che

eucariotica = si usa energia chimica x produrre altra energia chimica => metaboliti primari = molecole

prodotte per far fronte al metabolismo essenziale glicolisi, ciclo di krebs

Per capire come sviluppare al meglio la cellula

✓ primario e secondario si apprezzano, particolarmente, in alcuni organismi

▪ Alcune piante sono conosciute per la presenza di metaboliti secondari che possono essere molto

▪ importanti sia per l'industria chimica, che farmaceutica

Anche nei batteri, in determinate fasi della crescita batterica accompagnano il primario a un

▪ secondario

Glicolisi [ripasso della via metabolica]

Glucosio +2 ADP + 2 Pi —-> 2 piruvato + 2 ATP + NADH

- Essenziale

- Glucosio molto permeabile perciò appena entra fosforilato

- Dispendiosa nelle prime fasi (x le fosforilazioni)

- Enzima centrale è aldolasi: presenza di questo enzima determina se microorganismo e in grado

o no di fare la glicolisi (catalizza formazione gliceraldeide3P e DHAP)

- Molti fanno glicolisi perché non serve l’ossigeno, e veloce e semplice e energia e sufficiente

- Spesso abbinata a fermentazione per aumentare, ma già così è sufficiente

Ciclo di Krebs

- Interfacciato con glicolisi

- Anfobolica = Produce intermedi ma anche cofattori ridotti per la produzione di energia con

catena di trasporto elettroni (forma potere ossido-riduttivo)

- Per organismi aerobi è l’inizio della respirazione

- Utilizzato in biotech led produrre intermedi

- Se do terreno coltura con poco Fe: aconitasi lo usa per fare aconitato e la maggior parte di acido

citrico non si trasforma e si accumula => produzione acido citrico

Metabolismo secondario

= insieme dei processi endocellulari che, dal punto di vista biochimico, non sono essenziali per la

crescita e la sopravvivenza della cellula me che le permettono di adattarsi al meglio all’ambiente (crea

competizione); si accompagna al primario => introduce, ad esempio, nuove vie biosintetiche che

portano alla formazione di molecole, definite genericamente metaboliti secondari = coadiuvano la

sopravvivenza della cellula o dell'organismo

Quello che noi nell’industria utilizziamo di più

✓ Non sostituisce il primario mas i affianca

▪ Nei procarioti aumenta durante alcune fasi crescita batterica (porta a sintesi antibiotici, tossine…)

▪

Metabolismo energetico

Tutti i microorganismi necessitano del metabolismo energetico: avere bassa entropia per aumentare

▪ energia libera

E quello che vogliamo valutare noi nelle fermentazioni

▪ 3 tipi di metabolismo energetico

▪ a) Fermentazione

= Processo metabolico energetico in cui i componenti organici fungono sia da donatori che da

accettori finali di elettroni (reazioni redox); Il substrato di origine genera una serie di prodotti finali in

parte più ossidati del substrato, in parte più ridotti

Non si formano prodotti con percentuali fisse ma dipende da situazione

▪ Redox fondamentali => importante avere equilibrio controllato

▪ Ridotti molto più energia che ossidati che invece molto più stabili

▪ I microrganismi in grado di fermentare

▪ - anaerobi obbligati = microorganismi che non possono crescere in presenza di O2 perché non

hanno enzimi che li proteggono da ox

- anaerobi facoltativi = sopportano ossigeno

praticamente ogni carboidrato o derivato può essere fermentato e rappresentare una fonte

▪ energetica per i microrganismi

- polisaccaridi: amido, cellulosa, lecitina, chitina

- disaccaridi: lattosio, maltosio, saccarosio

- esosi: glucosio, fruttosio, lattosio

- pentosi: arabinosio, xilosio

- acidi derivati da zuccheri: acido gluconico e glucuronico

- polialcoli: mannitolo e glicerolo

b) Respirazione

= Processo metabolico energetico in cui donatore elettroni (da cui si estrae energia chimica) è

composto organico o inorganico ridotto, accettore finale solitamente l’ossigeno molecolare O .

2

Nella respirazione una sostanza organica viene completamente ossidata a CO2 e H2O

(mineralizzazione)

Molecola energetica cerca modo per stabilizzarsi

▪ Molecola arriva a livello finale che non ha più energia come anidride carbonica e acqua

▪ I microrganismi in grado di respirare sono

▪ - aerobi obbligati

- anaerobi facoltativi = possono sia fermentare che respirare a seconda della necessità

(ambiente)

- anaerobi stretti (es. Metanobatteri) = utilizzano come accettore finale elettroni un composto

inorganico ossidato diverso dall’ossigeno

in alcuni processi posso scegliere se farli fermentare o respirare Saccharomyces cerevisiae se

▪ fermenta produce etanolo

c) Fotosintesi

= Processo in cui luce funge da fonte energetica; energia luminosa assorbita trasformata in energia

chimica (ATP e NADPH2) e in seguito utilizzata per biosintesi, precisamente per conversione di CO2

in molecole organiche

Energia si trasforma da luminosa in chimica

▪ Immagazzinata in molecole altamente energetiche

▪

FERMENTAZIONI

• In generale processo semplice

• enzimi che fanno reazioni e che trasformano molecole per

mantenere equilibrio ossido-riduttivo adeguato

✓ produrre energia (non tanta come la respirazione)

✓

• primo processo che si è evoluto (respirazione molto dopo)

• permette di usare moltissime fonti

• quasi tutti carboidrati e derivati possono essere utilizzati

- zuccheri semplici

- polisaccaridi: amido, cellulosa, lecitina, chitina

- disaccaridi: lattosio, maltosio, saccarosio

- esosi: glucosio, fruttosio, lattosio

- pentosi: arabinosio, xilosio

- acidi derivati da zuccheri: acido gluconico e glucuronico

- polialcoli: mannitolo e glicerolo

Fermentazione alcolica

1) decarbossilazione (piruvato decarbossilasi) piruvato (alfa-chetoacido) => acetaldeide (intermedio)

+ CO2

2) riduzione (alcol / etanolo deidrogenasi DH) acetaldeide + NADH + H+ => etanolo (alcol etilico) +

NAD+

prodotti: etanolo + CO2

• fermentazione alcolica utilizzata in industria per

(etanolo) produzione bevande alcoliche; preservante per cibi

✓ Etanolo per biocarburante (“bioetanolo” riguarda processo, non molecola che invece è la

✓ stessa): cambia impatto processo, modalità differente per produrre in maniera rinnovabile e

circolare (si butta il meno possibile); si è sviluppata ricerca imponente per far fare a lievito per

fare più etanolo possibile (concentrazioni per unità di L di fermentazione) così ho meno costi e

più guadagno. In Europa veniva usato come additivo per carburanti perché le nostre automotive

non andavano così; prodotto molto anche dal Brasile fermentando residui canne da zucchero e

producevano milioni di tonnellate di bioetanolo e addirittura producevano automobili

(biotecnologie di prima generazione: ha avuto discussioni perché si usavano prodotti che

potevano essere utilizzati per alimento). Bioetanolo di Seconda generazione anni ‘50: si utilizza

biomassa di scarto e serve prima fase di demolizione enzimatica che smantella biomassa e

forma zuccheri liberi (una delle aziende che ha ottimizzato al meglio II gen era italiana).

Mentre si sviluppava bioetanolo, come molecola non è top p3rche bisogna dargli da mangiare

idrolizzando molecole (meglio dargli esosi che pentosi) e si doveva usare anche microorganismi

per fare bioetanolo o modificati geneticamente.

Utilizzato poi il butanolo: energeticamente ma si poteva usare sia come additivo ma anche come

carburante diretto (altro tipo di fermentazione che vedremo in seguito) fatto da Clostridium

(anaerobi stretti) ma si è dato gene a saccharomyces per farlo fare a lui

(CO2) panificazione, prodotti da forno… (lievitazione) (a volte infatti si sente odore leggero di

✓ etanolo perché con fermentazione sono rimasti residui)

• Molte specie di lieviti, funghi, Cellule vegetali

• Microorganismi utilizzati

- E.coli

- Saccharomyces cerevisiae (vino, birra, pane), moto versatile e utilizzato in basta gamma di

prodotti fermentati di cui ci sono molte varietà (alcune selezionate e altre OGM)

- Saccharomyces pastorianus (birre), lavora a T più fredde (18-20C)

- Saccharomyces hayanus (vini spumanti e quelli con forte gradazione alcolica), più veloce

- Brettanomyces particolare, per il gusto aromatico in abbinamento con Saccharomyces, si

aggiunge in momenti particolari durante azione Saccharomyces con fermentazionehe da meno

etanolo ma profilo aromatico particolare (per reazioni collaterali)

- Kloeckera gusto aromatico di abbinamento

- Hanseniaspora gusto aromatico di abbinamento

• Non produce concentrazioni di etanolo alte => perché è tossico anche per la cellula ad alte

concentrazioni quindi prodotto a basse concentrazioni e si disperse

• Vino in verità potrebbe formarsi anche ambientalmente ma nessuno lo fa: si controlla, si aggiungono

ceppi selezionati e divisi in base a tipo di vino, birra, gusto… moltissimi venduti

- Acido acetico che si forma dev’essere bassa, malico idem, tutto per il gusto finale

- Vino filtrato anche per evitare componenti indesiderati => noi agiamo fin dall’inizio per avere

prodotto accettabile

• Importante sempre analizzare tutto ciò che si forma e informare azienda… (CO2 che si forma

potrebbe essere pericolosa in alcuni processi operatore che va a pulire contenitori per produzione

vino respira ristagno di CO2 e rimangono prima addormentati e poi asfissiati (non ci si accorge

perché incolore, insapore)

Fermentazione omolattica

1) riduzione (lattato deidrogenasi, LDH): piruvato + NADH + H+ —> acido lattico / lattato + NAD+

• Tipica di batteri lattici omofermentanti, tessuti animali in particolari condizioni

• Resa 2 ATP (vista complessivamente insieme alla glicolisi)

• Non molto dispendiosa e la usa anche per bilanciare equilibrio redox

• Contesto applicativa imponente

Settore alimentare: formaggi, yogurt e tutto settore caseario usa batteri lattici, sottaceti, salumi,

✓ altri prodotti fermentati come crauti

• Microorganismi utilizzati

- Lactobacillus bulgaricus

- Streptococcus thermophilus unico streptoccocco utilizzato in casearia, 50% volume di

microorganismi dedicati a caseario

• In un prodotto come latte si trovano benissimo perché è completo: fanno fermentazione lattica ma

trasformano anche prodotto (proteine…)

• Liberano acido lattico che diminuisce pH => strategia di sopravvivenza per inibire crescita di altri

microorganismi (strategia di sopravvivenza)

- Per noi interessante per gusti e consistenze

Fermentazione eterolattica – shut degli esosi

Inizio simile a glicolisi

1) Fosforilazione del substrato: Glucosio + ATP —> Glucosio-6-fosfato + ADP

Via simile a pentosi fosfati

2) Ossidazione: Glucosio-6-fosfato + NADP —> 6-fosfogluconato + NADPH + H+

3) Decarbossilazione ossidativa: 6-fosfogluconato + NADP —> pentoso-fosfato + NADPH + H+ + CO2

- Da esoso ottengo un pentoso

4) Scissione: pentoso-fosfato —> Gliceraldeide-3-fosfato + Acetil-fosfato

- Gliceraldeide segue via glicolitica che produce piruvato che poi va a fermentazione omolattica

5) Gliceraldeide-3-fosfato — (Glicolisi)—> Ac. piruvico —(Ferm. lattica)—> Acido lattico

6) Riduzione: Acetil-fosfato + NADH —> Acetaldeide + NAD + Pi

7) Riduzione: Acetaldeide + NADH —> Etanolo + NAD

Prodotti: acido lattico / lattato (maggior parte) + etanolo + CO2

• Più complessa e particolare

- Differenza è che c’è un’alternativa metabolica a monte perché non c’è glicolisi (manca aldolasi

che scinde esosi in2 triosi)

- Si produce solo una molecola di gliceraldeide3P

• Tipica di batteri lattici eterofermentanti (importante sapere quindi se sono omo/eterofermentanti),

di solito dei generi (mancano dell’aldolasi)

- Leuconostoc

- Lactobacillus

• Resa: 1 ATP

• Scopi applicativi

Prodotti caseari (alcuni formaggi o kefir devono avere acido lattico e etanolo e CO2)

✓ alimenti fermentati (crauti, kimchi, cetrioli e carote in salamoia) conferendo sapore acidulo e

✓ maggiore conservabilità

ingredienti per bevande

✓ produzione bioplastiche (PLA = polimero biodegradabile usato per imballaggi, piatti e posate

✓ monouso sostituendo plastiche tradizionali)

Prodotti diversi tra loro non sempre nel settore alimentare

✓

Fermentazione malolattica

= evento fermentativo caratteristico, successivo a fermentazione alcolica

importante nella fase di maturazione dei vini.

✓

= Nella fermentazione malolattica acido malico, nell'uva, trasformato dai batteri lattici in acido lattico

e anidride carbonica

• Durante la malolattica, nel vino l'acido malico, il più aspro, si trasforma in acido lattico, acido più

debole del malico, che è percepito come più delicato e meno acre.

• Per svolgere fermentazione malolattica ci si può affidare a batteri naturalmente presenti nel mosto

e riattivati da variazione condizioni conservazione (come l’aumento di temperatura)

o si può ricorrere a inoculi di ceppi batterici selezionati

- Oenococcus

- Lactobacillus

Fermentazione acido-mista

= da molecola di Glucosio si produce miscela acidi organici (acido lattico, acetico, formico, succinico)

+ etanolo + gas (CO2, H2)

• relazioni quantitative tra prodotti finali non hanno valore fisso ma variabile, influenzato da tipo

microrganismo condizioni colturali

• tipica di un gruppo batteri, in genere enterobatteri Coliformi

- Escherichia

- Salmonella

- Shigella

- Proteus

- Yersinia

- Vibrio

- Photobacterium

- Aeromonas (solo alcune specie)

• Applicazioni per produzione di varietà di prodotti

produzione di birra, spesso combinando lieviti ad alta fermentazione con batteri

✓ produzione di carne fermentata

✓ conservazione degli alimenti: produzione di acidi organici e etanolo conferisce proprietà

✓ conservative a alimenti prolungandone durata

Fermentazione 2,3-butilenglicole

= può avere come prodotti anche etanolo e acido acetico, in maniera analoga a fermentazione acido

mosta + acetoina che genera 2,3 butilenglicole e in presenza di O2 può formarsi anche diacetile

(prodotto con aroma di brutto prodotto in piccola quantaita anche durante altre fermentazioni come

vinificazione)

• tipica dei batteri Coliformi

- Aerobacter

- alcune specie di Aeromonas ed Erwinia

- Serratia

• trasformazione di parte di acido piruvico in 2,3-butilenglicole riduce sensibilmente la quantità di

acidi prodotta, rispetto a fermentazione acido-mista

• applicazioni

produzione biobutanolo

 componente per bio plastiche e pellicole biodegradabili

✓ solvente organico

✓ antiossidante o assorbitore di raggi UV in industrie cosmetiche

✓ antigelo nella conservazione a bassa temperatura

✓ in agricoltura grazie a proprietà antibatteriche e effetti promozione della crescita sulle piante

✓

• Dalla disidratazione del 2,3-butandiolo si può ottenere l’1,3-butadiene

importante precursore per produzione gomma sintetica e plastica

✓

Fermentazione butirrica e isopropilica

• tipica dei batteri del genere Clostridium, sporigeni e anaerobi

• La presenza di ferredoxina nei Clostridi permette di utilizzare l’idrogeno formato per ridurre acidi in

composti neutri (alcooli)

Fermentazione aceton-butilica

• schema precedente è simile anche per questa fermentazione, dove produzione spinta verso alcoli e

chetoni di interesse

• applicazioni

ambito accademico e industriale

✓ crescente interesse verso questo processo giustificato da possibilità valorizzare biomasse

lignocellulosiche di scarto per produrre Acetone-Butanolo-Etanolo in modo

economicamente competitivo rispetto a tradizionale via petrolchimica

campo dei biocarburanti

✓ butanolo prodotto con fermentazione ABE, presenta vantaggi rispetto a etanolo prodotto con

fermentazione tradizionale: possibilità di essere miscelato in qualunque proporzione con

normali benzine per autotrazione. Butanolo e acetone possono essere utilizzati anche come

solventi o come reagenti di processi chimici successivi

• a livello genetico state svolte attività ricerca, con scopo di inattivare la via che porta alla formazione

di acetato, ridurre la formazione di butirrato a favore di butanolo e acetone (ad esempio con utilizzo

di RNA antisenso)

• Parallelamente si è operato anche su tecniche colturali, incrementando biomassa e produttività

• l’ottimizzazione stata eseguita anche con estrazioni in fase di fermentazione del butanolo, in modo

da minimizzare l’inibizione da prodotto

• microrganismo più coinvolto nello sviluppo è il Clostridium acetobutylicum

• Si sono ottenuti risultati promettenti ma occorrono ulteriori sforzi per avere ceppi microbici

competitivi nelle produttività

Fermentazione propionica

• caratteristica dei

- Propionibacterium, asporigeni, possono fermentare l’acido lattico prodotto da altri batteri

- Veillonella alcolescens (presente nel rumine e nella saliva dei mammiferi), cocco Gram-

PROCESSO DELLA RESPIRAZIONE – catena di trasporto

degli e- + chemiosmosi

Respirazione aerobica – Fosforilazione ossidativa

= processo che coinvolge sistemi di trasporto composti da trasportatori associati alla membrana che

hanno due principali funzioni:

ricevere gli elettroni da un donatore e trasferirli ad un accettore

✓ conservare una certa quantità di energia rilasciata durante il trasferimento degli elettroni per la

✓ sintesi di ATP

La reazione generale del processo respiratorio che interessa il glucosio è:

Glucosio + 6 O2 ---------> 6 CO2 + 6 H2O + energia (ATP)

Donatore di elettroni è materia organica e accettore finale è ossigeno

• monoossigenasi => incorporazione di un singolo atomo di ossigeno nel substrato L’altro atomo viene

invece ridotto ad H2O mediante il cofattore NADPH2 (o NADH2)

• diossigenasi => incorporazione di entrambi gli atomi di una molecola di ossigeno nel substrato,

causando la rottura di un doppio legame aromatico

Fasi

1) glicolisi

per ogni molecola di glucosio di ottiene:

- 2 piruvato => va nel ciclo di krebs per ossidazione

2) Ossidazione completa piruvato nel ciclo di krebs a dare CO2 + H+

Si ottiene

- 3 NADH

- 1 FADH2

- 3 CO2 (3 decarbossilazioni ossidative: una durante formazione acetil-CoA; una da

decarbossilazione isocitrato; una decarbossilazione α-chetoglutarato)

3) Fosforilazione ossidativa

• Descrive destino dei cofattori ridotti che provengono dal ciclo di Krebs

• Da glicolisi un glucosio diventa 2 piruvato; ciascuna entra mitocondrio e diventa 2 molecole di

Acetil-CoA che entra nel ciclo di Krebs; qui nelle reazioni si produce 2 CO2, 2 GTP, e vengono

ridotti 3 NAD a NADH, e 1 FAD a FADH2;

• NADH, FADH2 ridotti (che hanno più elettroni e quindi un potenziale standard di riduzione)

entrano nella catena respiratoria che termina con produzione di ATP mediante un’ultima

reazione di fosforilazione ossidativa

• Potenziale standard di riduzione E0 = capacità di convertirsi da forma ossidata a croma ridotta di

una particolare specie chimica

- Più è alto più è alta capacità di ridursi

- Più è alto maggiore sarà tendenza a strappare elettroni a altre specie

- Più è alto più è l’affinità elettronica => e- vanno dove affinità elettronica è maggiore

• Ciclo di Krebs è punto in comune con molte vite metaboliche che hanno come risultato l’Acetil-

CoA (beta-ox acidi grassi, via catabolismo