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Biotecnologie delle Fermentazioni

Appunti di Biotecnologie delle fermentazioni basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Marinelli dell’università degli Studi Insubria Como Varese - Uninsubria, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali - Varese. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Biotecnologia delle fermentazioni docente Prof. F. Marinelli

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le proprietà organolettiche. Se uso un terreno solido non posso fare la sterilizzazione in

continuo perché serve un terreno liquido.

Sterilizzazione

In batch terreno e fermentatore insieme dopo caricamento: 30-60 minuti a

 121°C con immissione di vapore o per riscaldamento di apposite intercapedini

Terreno in continuo attraverso passaggio da tubi caldi a scambiatori di calore

 sotto vuoto e fermentatore a parte con vapore diretto o aria calda

Sterilizzazione aria in ingresso ed in uscita: per vapore o filtrazione su 0.22

 μm (filtri per esclusione) o su materiale fibroso (filtri per captazione)

Rischio: spore batteriche ma soprattutto fagi

 Tutte le prese campione o altre uscite sono mantenute sterili sotto flusso di

 vapore

Aerazione e agitazione

Aerazione e mescolamento di un sistema a 3 fasi:

Fase liquida, terreno di fermentazione, più o meno viscoso

 Fase solida, biomassa e particolati nutrienti, variabile nel tempo e con

 morfologia della coltura

Fase gassosa, bolle di gas nel liquido e spazio in cupola

Si ha il trasferimento di massa.

Una buona agitazione permette la distribuzione delle bollicine d’aria nel liquido

facilitando l’ossigenazione e la rimozione di anidride carbonica che invece risulta

tossica ad alte concentrazioni. L’agitazione permette anche la distribuzione omogenea

dei nutrienti e dei prodotti del metabolismo e impedisce che si formino pellet o biofilm.

Favorisce il mantenimento costante della temperatura. Un terreno troppo viscoso

impedisce una buona agitazione, un buon scambio di gas e nutrienti. La presenza di

molecole di acqua libere è condizione necessaria alla vita (regolazione pressione

osmotica). NaCl quando è altamente concentrato lega tutta l’acqua disponibile e

impedisce la crescita microbica. Il miele se non è diluito è una soluzione molto dolce

che rimane sterile, non c’è contaminazione perché si lega a tutta l’acqua presente. Se

il terreno diventa sciropposo come il miele tende a non far crescere i microbi. Il terreno

quando diventa troppo viscoso impedisce una buona ossigenazione e impedisce che

l’acqua sia libera quindi varia la pressione osmotica che diventa incompatibile con la

vita.

Reattore agitato meccanicamente

Agitazione meccanica (rotazione palette a 200-600 rpm) ed aerazione (flusso d’aria

0.5-1.5 vvm): agitazione meccanica disperde aria in piccole bolle aumentando la

superficie totale di scambio e quindi favorisce aerazione del reattore. Potenza richiesta

per l’agitazione dipende:

Viscosità e densità dei bordi

 Morfologia della coltura

 Antischiuma e schiuma

 Geometria del reattore

 Temperatura, ossigeno necessario

 18

Tipologia pale

Vantaggio -> estrema flessibilità.

Svantaggi -> costo energetico, shear stress, non adatto per sospensioni molto

viscose.

Le cellule animali e le cellule vegetali sono molto sensibili allo shear stress perché non

sono in grado di sopportare questa pressione.

Altri bioreattori

Agitazione pneumatica (Bubble column & Air lif), forza che mescola il brodo è un

 gas che può essere prodotto da microrganismi o insufflato:

Vantaggio -> bassa richiesta di energia, assenza di stress

o Svantaggio -> bassa flessibilità, stratificazione e gradienti

o

Agitazione idrodinamica (Plug-flow, Fluidized beds, Packed beds), colonne di

 vetro in cui si utilizzano le cellule come catalizzatori per fare trasformazioni

chimiche:

Vantaggio -> bassa richiesta di energia

o Svantaggio -> bassa flessibilità, elevato stress, difficoltà di

o sterilizzazione. Stratificazione e gradienti

Photobioreactors = fotobioreattori, per coltivare ad esempio batteri o alghe, per

 produrre microorganismi fotosintetici

Scaling-up

La scala di produzione e quindi il volume operativo del bioreattore dipendono da fattori

di tipo economico:

Domanda per il prodotto

 Tempi e costi di produzione e di purificazione

 Costo dell’impianto e delle fonti di energia

 Rese del processo produttivo e di purificazione

 E. coli

Proteina prodotta in deve essere: altamente pura, prodotto ad alto costo,

quantità limitata. Upstream è la parte meno costosa, mentre la parte di downstream e

di purificazione è quella più costosa. Lo scaling-up che vuol dire “aumentare di scala”

non si può fare la stessa cosa in laboratorio, in un impianto di fermentazione. Cosa

bisogna tener presente nel concetto di scaling-up?

Agitazione, aerazione e controllo della temperatura in grandi volumi

 Raffreddamento, sterilizzazione, pulizia

 Geometria di scala: rapporto altezza/diametro da 2:1 a 6:1

 Confronto delle KLa in reattori di diversa dimensione e geometria

 Confronto delle quantità di energia richiesta per unità di volume

Kla è un parametro che è importante mantenere sotto controllo, è una costante che

tiene conto di diversi parametri. C’è una formula per calcolare la Kla, ma poi vanno

adattati tutti i parametri per mantenere le Kla costanti tra i diversi reattori in modo da

poter ricostruire le medesime condizioni.

Trasferimento dell’ossigeno dall’aria all’acqua

Le cellule assimilano ossigeno solo da soluzione acquosa. L’ossigeno entra come

bollicine d’aria, come bollicina deve entrare nel liquido e poi deve essere preso dalle

19

cellule. Solubilità in miscela aria/acqua a 20°C: 9 mg O per litro. La solubilità

2

diminuisce man mano che aumenta la viscosità e la densità, diminuisce in soluzioni di

nutrienti e aumentando la temperatura. Diminuisce secondo la Legge di Henry C* =

P H, dove C* è la [O ] a saturazione nella soluzione, P è la pressione parziale

i 2 i

dell’ossigeno nella fase gassosa, H è costante specifica che dipende dal gas e dal

liquido. Insufflando O puro, solubilità sale a 43 mg per litro di acqua a 20°C.

2

Trasferimento di massa

Cosa vuol dire fare un modello? Capire in un sistema qual è il parametro limitante.

Qual è il passaggio attraverso cui diminuisce di più? Il passaggio più criticato è

dal gas al liquido, è la resistenza maggiore al trasferimento di massa, quindi è questo

il punto che va modificato. Modello del film stazionario descrive la velocità di

trasferimento di ossigeno (ORT oxygen transfer rate) tenendo conto che la fase

limitante è il trasferimento tra fase gassosa e liquida: dC /dt = ORT = kLa (C*-C ).

L L

-1 -1

Velocità di trasferimento dell’O (mM O l h ). Kla = coefficiente di trasferimento di

2 2

-1

massa KL (m h ) per area interfaccia gas/liquido per volume di liquido a coefficiente

-1

volumetrico di trasferimento dell’ossigeno (h ). C* è la concentrazione a saturazione

dell’O disciolto. C è la concentrazione dell’O nel brodo di fermentazione. Kla è una

2 L 2

misura della capacità di aerazione di un reattore che è tanto maggiore

quanto più grande è Kla. Si misura sperimentalmente e dipende dalla geometria

del reattore, dal sistema di aerazione, dal flusso di aria, dalle caratteristiche del

terreno e del microrganismo, dall’antischiuma e dalla temperatura. Interdipendenza

dei parametri: ad esempio una fermentazione ben ossigenata richiede meno potenza

per il mescolamento in quanto in una miscela gas-liquido la densità è ridotta.

Misurazione del trasferimento di ossigeno nei reattori

Metodo dinamico: velocità di riduzione C da blocco aerazione

 L

Metodo chimico con sodiosulfito: velocità di ossidazione di un terreno modello

 Metodo diretto sui gas in entrata e in uscita

 In base alla misura della crescita microbica in coltura continua

La stechiometria del metabolismo respiratorio richiede che per consumare 10 g di

glucosio servano 10.6 g di ossigeno. La concentrazione di ossigeno è espressa come

concentrazione relativa DOT (dissolved oxygen tension) rispetto alle condizioni

operative utilizzate, quindi C* corrisponde a DOT 100%. La concentrazione critica di

ossigeno è il valore minimo di DOT (diverso per ogni organismo) che corrisponde al

valore minimo di DOT che permette la massima velocità di consumo dell’ossigeno

senza limitare la crescita. In genere tra il 5 ed il 25% della saturazione. Il range critico

è il 10-20% di DO, come si fa a rallentare la crescita per rimanere in questo

range? Diminuendo la temperatura di crescita per evitare il forte effetto

dell’anaerobiosi, si può diminuire l’inoculo quindi ho meno cellule per unità di volume

e queste crescono più lentamente. A parità di processo bisogna fare delle scelte.

Come si fa un downstream?

Tutte le cose che faccio cambiando il microbo determinano un cambiamento di

produzione. Downstream = recupero del prodotto, è la fase più chimica! Quando voglio

E. coli

produrre una proteina ricombinante in questa produzione è altamente

controllata. In un processo fermentativo l’IPTG per produrre qualcosa è il costo

maggiore, molecola che emula il lattosio e inizia a produrre la proteina di interessa.

Cosa fa il biotecnologo che scala il processo fermentativo? Si vanno a vedere i

componenti più costosi, ovvero ad esempio l’IPTG. Per prima cosa si verifica il

20

protocollo per vedere se la quantità di IPTG è necessaria, poi riduco la quantità di IPTG

e vedo quanto varia, nel caso devo modificare le condizioni di produzione. Come si

cambia un sistema di induzione? Si utilizzano dei terreni di autoinduzione: terreni in

cui ad un certo punto si libera il lattosio e avvia il processo di induzione. Alternativa è

la termoinduzione: ci si libera dalla dipendenza di un composto chimico per fare

questa fermentazione -> si creano proteine virali che rispondono ad uno shift termico,

vuol dire attivare senza avere un’aggiunta chimica. Ma si ha un problema critico

quando si aumenta di scala, di volume, se il promotore innovativo deve essere portato

con uno shift di temperatura questo tipo di variazione (shock termico) si fa facilmente

con una beuta, mettendola a bagno e poi raffreddandola, ma quando si deve fare uno

shift termico in un reattore questo non è scalabile.

Downstream = parte più chimica, parte che si può migliorare, c’è una resa di

purificazione, ma ci sono sempre dei margini stringati. Quando si inizia a fare un

recupero del prodotto si hanno delle rese che possono essere migliorate di un paio di

volte e basta perché c’è un limite chimico per questo discorso. Esempio: penicillina, il

gene wildtype produce 10 mg/L. Com’è costituito il litro di coltura? Substrati S

(del terreno iniziale, di fermentazione), penicillina, cellule (biomassa), prodotti del

metabolismo (acidi organici, modifica del brodo). Dov’è la penicillina? È nella

soluzione, quindi bisogna innanzitutto separare le cellule dal brodo perché le cellule

non ci servono più. Come si fa questo? Con una centrifugazione. La penicillina

rimane nella soluzione acquosa assieme ai substrati e ai prodotti, quale sarà la resa

di purificazione? Si arriva ad una resa circa del 50% in seguito alla purificazione per

estrarre l’antibiotico dalla soluzione, la resa può arrivare anche a 70-80-90%, al 100%

non si arriva mai (Resa = quanto mi trovo alla fine rispetto a quando parto). Ci sono

molti antibiotici che non sono secreti nel mezzo di fermentazione. Quindi il primo

parametro da capire del downstream è dove viene prodotto il prodotto! Il fatto che il

prodotto sia fuori o dentro la cellula condiziona in modo pesante la resa del

purificazione. Le statine sono gli anticolesterolemici, sono metaboliti secondari

esattamente come degli antibiotici, in teoria sono dei prodotti naturali. Sono prodotti

da funghi, ma a differenza della penicillina sono prodotti dentro le cellule, quindi per

fare le statine bisogna rompere le cellule quindi le rese sono molto più basse rispetto

alle rese che si hanno con la produzione di penicillina. Fattore di miglioramento? Da

10 mg/L si è passati a 100 g/L di penicillina grazie al miglioramento del processo. La

parte di miglioramento sta nella parte biologica, i biologi hanno la responsabilità di

aumentare la produttività.

Processo downstream: 50-90% dei costi totali di un processo fermentativo:

Tipologia e concentrazione del prodotto

 Localizzazione del prodotto

 Terreno di coltura e contaminanti

 Grado di purezza finale

 Produzione di reflui

La maggior parte degli antibiotici vengono prodotti colorati perché durante la

fermentazione vengono prodotti dei co-pigmenti quindi bisogna fare un processo di

decolorazione per eliminare il pigmento che ha assunto l’antibiotico. Più si aumenta

l’upstream più migliora il downstream.

Tipologia e localizzazione

Biomassa

 21

Prodotti intracellulari (acidi nucleici, vitamine, la maggior parte di enzimi e

 proteine, alcuni antibiotici)

Prodotti extracellulari (aminoacidi, acidi organici, alcoli, molti antibiotici, alcuni

 enzimi, proteine)

Prodotti sia intra che extracellulari (vitamina B12, alcuni antibiotici)

Cinque fasi principali

1. Pretrattamenti

2. Separazioni solido-liquido

3. Concentrazione

4. Purificazione

5. Formulazione

Separazione della biomassa dal brodo colturale o chiarificazione

 Sedimentazione -> separazione spontanea di particelle piuttosto grandi, si

usa ad esempio per il lievito di panificazione.

 Flocculazione -> aggiunta di un agente flocculante (composti chimici che

fanno aggregare le cellule di lievito) quale un sale inorganico, un idrocolloide

minerale o un polielettrolita organico.

 Centrifugazione -> rimozione prodotto in continuo o per lotti, separatore a

piatti o decantatore.

 Filtrazione -> filtro rotativo o a pressa.

 Flottazione -> galleggiamento in presenza di gas a volte in presenza di

coadiuvanti tipo ammine e acidi grassi, gas che fanno sì che il prodotto vada in

superficie.

Chiarificazione: termine che si usa per la fermentazione della birra o dell’alcol. Alla

fine della fermentazione abbiamo una fase solida e una fase liquida da separare. Per

lavorare la fase solida è necessario disintegrare le cellule.

Disintegrazione (o permeabilizzazione) cellulare

Metodi fisici meccanici -> ultrasuoni, omogenizzazione, trattamento ad alta

 pressione, mulino a sfere, macinazione.

Metodi fisici non meccanici congelamento/scongelamento e

 ->

disidratazione.

Metodi chimici -> trattamento con acidi, alcali, solventi, detergenti e shock

 osmotico, bisogna stare attenti che il prodotto che ci interessa resista al

trattamento.

Metodi biologici -> lisi enzimatica, autolisi, antibiotici che inibiscono la

 formazione di parete, fagi, metodi molto selettivi, molto specifici della cellula,

ma c’è il rischio di una cross-contaminazione chimica.

Stock-coltura -> beuta agitata -> fermentatore da inoculo -> fermentatore da

produzione -> raccolta! Per fare la raccolta devo separare le cellule dal mezzo di

coltura acellulare:

Se il prodotto sono le cellule si fa una disgregazione delle cellule e si fa una

 purificazione del disgregato cellulare.

Se il prodotto è il mezzo di coltura acellulare si fa un’estrazione da questo

 mezzo di coltura e si purifica del prodotto, contemporaneamente bisogna

uccidere le cellule, serve un metodo per eliminare la biomassa, in seguito

questa biomassa (ricca di nutrienti) o viene riciclata (ad esempio l’estratto di

22

lievito) o viene utilizzata come concime organico (in forma disidrata, ricca di

vitamine).

Se bisogna estrarre dal brodo qual è il problema? È concentrare! Perché il brodo

ha un’elevata quantità di acqua -> estrazione su resine o solvente-solvente per

concentrare il volume. Se il prodotto è la biomassa bisogna verificare che nel brodo

non ci siano ancora cellule residue.

Come si concentra un prodotto?

Precipitazione di metaboliti solubili in acqua mediante l’aggiunta di Sali

 (proteine, acidi organici, alcuni antibiotici) o di solventi organici quali acetone ed

etanolo, ad esempio con l’aggiunta di ammoniosolfato le proteine precipitano.

Se nel mezzo ho tante proteine non precipita solo la proteina di interesse, ma

tutte, per cui devo anche purificare la proteina di interesse dalle altre. La

penicillina ad esempio precipita grazie all’aggiunta di solventi organici

(acetone).

Processi a membrana basati sull’impiego di una barriera selettiva che lascia

 passare alcuni componenti (permeato) e ne trattiene altri (retentato). Varia la

forza motrice (gradiente di concentrazione, forza idrostatica, campo elettrico), il

cut-off delle membrane ed il tipo di flusso. Sulla membrana si possono applicare

varie forze (elettrica, elettrostatica, elettromagnetica) e in base alla tipologia

della forza si hanno vari metodi. Si possono utilizzare delle membrana selettive

chimicamente. I principali metodi sono la dialisi (forza motrice = gradiente di

concentrazione), l’osmosi inversa, l’ultrafiltrazione, la microfiltrazione. Il

sistema utilizzato negli impianti è la microfiltrazione (o anche ultrafiltrazione),

ha due scopi: filtra e concentra nello stesso tempo. Si applica una pressione ad

un filtro, come si fa a funzionare questo sistema? O con la pressione o

applicando il vuoto sotto. Ma dopo un po’ il filtro si intasa, quindi cosa si è

inventato? Il sistema di microfiltrazione tangenziale: la pressione non viene

posta sopra, ma si fa scorrere in continuo un liquido sulle membrana, questo

mentre scorre pulisce i filtri, si applica una forza tangenziale al filtro e le diverse

membrane possono far passare selettivamente varie cose. Microfiltrazione:

pori di diametro di 0.1-10 μm, ultrafiltrazione pori con diametro minore al

micron. Con questi diametri si garantisce la sterilità perché attraverso queste

membrane non passano le cellule. Possono essere le cellule del produttore, ma

possono essere anche dei contaminanti.

Parziale purificazione, passaggi successivi

Estrazione liquido-liquido -> concentrazione di metaboliti idrofobici

 estraendoli dall’acqua con solventi in base al loro coefficiente di ripartizione

(per metaboliti secondari)

Evaporazione -> allontanando acqua o solvente per evaporazione, se il

 prodotto non evapora

Distillazione -> recupero del prodotto a punto di ebollizione inferiore al

 solvente o all’acqua (per acidi ed alcoli)

Cromatografie per la purificazione

Adsorbimento su resina ed eluizione in batch -> per metaboliti secondari;

 soprattutto per gli antibiotici, se ho una quantità di prodotto molto grande

faccio prima a far passare la resina all’interno ed estrarla 23

Cromatografia su colonna -> fase stazionaria, eluizione isocratica o a

 gradiente, frazionamento e metodo di analisi

Filtrazione su gel -> per rimuovere sali o interferenze a basso peso

 molecolare e per purificare proteine e polisaccaridi

Cromatografia per adsorbimento -> su silicati, allumina, idrossilapatite,

 carbone attivo, destrani di uso molto diffuso; quando ad esempio il composto

rimane colorato o è ad esempio un antibiotico

Cromatografia a scambio ionico -> ed eluizione con soluzioni tampone a

 forza ionica variabile per amminoacidi, antibiotici e proteine

Cromatografia per affinità -> con matrici funzionalizzate per legami specifici;

 ad esempio per le proteine ricombinanti

Scelgo la purificazione in base alla natura del prodotto, al costo, al livello, etc.

l’economicità del prodotto è collegata al grado di purificazione. Se ad esempio voglio

purificare una proteina rara il prodotto può costare tanto e deve essere relativamente

pulito; se devo fare un enzima per i detersivi posso avere un grado di purezza relativo.

Metodi analitici

Saggio enzimatico

 Gas-cromaografia -> per visualizzare l’alcol, perché è volatile, evapora

 HPLC -> per antibiotici perché hanno anelli aromatici che riesco a vedere

 nell’UV

TLC

 Elettroforesi-> per proteine

 Isoelettrofocalizzazione

 Spettrometria di massa

Trattamenti finali -> prevedono la formulazione del prodotto, quasi mai la formulazione

è un liquido

Essiccamento -> per esempio per le biomasse, ad esempio il lievito viene

 essiccato

Liofilizzazione -> sublimazione dell’acqua a bassa temperatura e bassa

 pressione, ad esempio antibiotici e proteine

Cristallizzazione -> da una soluzione sovrasatura a bassa temperatura, per

 evaporazione, per addizione di agente chimico, ad esempio amminoacidi,

zuccheri e proteine

Resa nei processi di downstream

100 g/L, 50g X 10, calcolata sempre sulla produttività volumetrica del fermentatore

Prodotto di fermentazione Resa tra prodotto finale e prodotto alla

fine della fermentazione (%)

Antibiotici 50-80

Enzimi extracellulari 90

Enzimi intracellulari 10

Biomassa 95

TECNICHE FERMENTATIVE 24

Batch

 Fedbatch

 Continuo

BATCH

La fermentazione in batch è un sistema chiuso in cui non vengono aggiunte

 nuove sostanze nutritive

I batteri crescono e si moltiplicano, passando attraverso fase di latenza, fase di

 crescita esponenziale, fase stazionaria; la composizione chimica del mezzo varia

Contemporaneamente i nutrienti si vanno esaurendo e tutto ciò porta ad andare

 in contro a morte dovuta principalmente alla mancanza di nutrienti

Vantaggi:

Versatile -> può essere usata per diverse reazioni ogni giorno

 Sicuro -> può essere facilmente sterilizzato ed il rischio di contaminazioni o

 mutazioni è minimo

È possibile avere una completa conversione del substrato

Svantaggi:

Alto costo del lavoro

 Lunghi tempi di attesa

 Problemi di sicurezza

Curva di crescita:

Fase di latenza

 Fase di crescita esponenziale

 Fase stazionaria

 Fase di morte

Cinetica di crescita

dX/dt = μ X

X = concentrazione della biomassa (g/L o numero di cellule), μ = velocità di crescita

Bisogna misurare la variazione della biomassa nel tempo = (dX/dt) X . Integrando X

0

μt

= X e . Ponendo in forma logaritmica si ha lnX = lnX + μt, μ è calcolata

0 0

sperimentalmente e corrisponde alla pendenza della retta (fase di crescita

esponenziale) -> tempo di duplicazione td = ln2/μ. Si raggiunge questa formula

integrando la variazione della biomassa minuto per minuto, questo corrisponde alla

pendenza della retta. La μ è la tangente alla fase esponenziale, è l’inclinazione della

retta tangente alla fase esponenziale di crescita; è costante perché quando cresce in

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fase esponenziale si assume che le cellule duplichino costantemente ogni tot minuti.

Dato che è la tangente è possibile determinare la μ, s vedo che c’è una variazione

costante (ovvero momento per momento) è possibile calcolare la μ e da questa posso

calcolare il tempo di duplicazione. La velocità è costante nella fase esponenziale,

questo dipende da un modello, sulla base di particolari assunzioni. Ma quali sono

queste assunzioni per calcolare la μ? È che la divisione cellulare sia binaria, la

crescita sia sincrona e che la crescita sia descritta da una fase esponenziale. Sapendo

che le assunzioni valgono per la natura del microrganismo, posso calcolare il tempo di

duplicazione campionando all’inizio e alla fine e dalle misure sperimentali calcolo la μ

che è la retta tangente alla fase esponenziale.

Se osservo nel terreno che ho un andamento di crescita auxica, tipologia di crescita

E. coli

riportata da Monod. Quando si fa crescere si ha il fenomeno di auxia. Se si fa

crescere il microrganismo con glucosio e con lattosio, questo utilizza prima il glucosio,

poi si ha un’induzione e la fase stazionaria del glucosio diventa la fase di latenza del

lattosio che prosegue con un’altra fase esponenziale e finisce con un’altra fase di

latenza. L’inclinazione della prima curva è maggiore dell’inclinazione della seconda

curva -> concetto di affinità! La μ dipende dal substrato limitante, perché le

condizioni di coltura delle due curve sono identiche, ma in presenza di glucosio il

microrganismo cresce più velocemente. Ci deve essere dipendenza tra μ e la

concentrazione del substrato limitante: se cresce su glucosio la pendenza è maggiore,

se cresce su lattosio la pendenza è minore. Quindi il substrato limitante non sono né

l’ossigeno né l’azoto, ma il glucosio e il lattosio.

Cinetica del consumo del substrato limitante la crescita: dX/dt = Y dS/dt

X/S

Dove S è il substrato limitante la crescita. Moltiplicando 1/X (ovvero normalizzando per

il valore della biomassa) si ottiene: dX/dt 1/X = Y dS/dt 1/X e quindi μ = Y q . Dove

X/S X/S S

q rappresenta la velocità specifica di consumo del substrato limitante: la velocità con

S

cui i microrganismi crescono dipende dalla velocità di consumo del substrato limitante

e dalla efficienza di conversione del substrato in biomassa.

relazione tra e concentrazione iniziale di S:

Quindi si ha una μ

La μ dipende dal microrganismo, dalla temperatura, dal pH e dalla composizione

 del brodo

Quando le condizioni sono costanti, μ è in funzione della concentrazione iniziale

 del substrato limitante e raggiunge un valore massimo μ (velocità di crescita

MAX

specifica massima)

Il modello matematico che descrive la relazione tra μ e S è l’equazione di Monod

Equazione di Monod

La μ = μ S / (K + S) dove μ = velocità di crescita specifica massima, S =

MAX S MAX

concentrazione substrato limitante, K = concentrazione del substrato a cui μ = 0.5

s

μ quando S è molto alto, μ tende verso μ . Se S è molto grande il rapporto tende

MAX MAX

ad 1 quindi in condizioni non imitanti μ tende a μ (valore soglia di saturazione). K è

MAX S

una costante di affinità, il microrganismo è più affine al glucosio rispetto al lattosio.

Una volta che sono state definite alcune costanti si può predire la curva di crescita, si

passa da modello descrittivo a modello predittivo e si valuta facendo esperimenti.

Resa (Yield) di conversione del substrato in biomassa e prodotto 26

Il coefficiente di resa cellulare (yield: Y ) è espresso come g di biomassa per g di

X/S

nutrienti consumati,

Y = Δx/ΔS. Il coefficiente di resa di prodotto (Y ) è espresso come g di prodotto per

X/S P/S

g di nutrienti consumati Y = ΔP/ΔS.

P/S

La resa dà la conversione del substrato nel prodotto.

Parametri quantitativi

Resa (YIELD): quantità di prodotto ottenuto dal substrato.

Velocità di crescita e produzione: parametri cinetici calcolati considerando il tempo.

Possiamo misurare la velocità di consumo del substrato e la formazione dei prodotti

per unità di volume (produttività volumetrica) o normalizzare per la biomassa

(produttività specifica).

SUBSTRATO -> REAZIONI INTRACELLULARI -> PRODOTTI + BIOMASSA

Tempo -> cinetica, cinetica di crescita, collegata alla μ, poi Ks, etc. Resa -> etanolo

rispetto al glucosio, resa del 10% utilizzo al 90% glucosio, resa di crescita e resa di

produzione. Produttività volumetrica: quanto prodotto ho alla fine della fermentazione,

quantità di prodotto per unità di volume, normalizzo il valore di produttività

volumetrica per la biomassa -> divido la produttività del prodotto per la quantità di

produttività specifica

cellule in un litro e ottengo la che dice che una certa quantità di

cellule produce una certa quantità di prodotto. Ma a cosa servono la produttività

volumetrica e quella specifica? Interessano per il recupero del prodotto; se

aumenta la produttività volumetrica facendo delle modificazioni, si passa da 80 g/L a

100 g/L, in seguito a manipolazioni, mi interessa sapere se queste manipolazioni

hanno portato a cambiare la capacità delle cellule di produrre o se hanno portato ad

un accrescimento delle cellule. La produttività specifica è decisamente aumentata se

ho la stessa quantità di cellule. Se invece ho prodotto più cellule ho reso il processo

capace di produrre più cellule per unità di volume, ho aumentato la resa della

E. coli

biomassa. Perché si vuole far crescere ad alta densità per produrre

proteine ricombinanti? Perché se aumento il numero di cellule per unità di volume

aumento anche la produttività volumetrica. Se ingegnerizzo E. coli rendendolo in

grado di produrre di più vado ad aumentare la produttività specifica di E. coli. Ma

E. coli

aumentando la produttività specifica di si diminuisce la produttività volumetrica

perché in queste determinate condizioni non cresce.

È possibile collegare la resa sul substrato (di crescita) -> dX/dt = Y dS/dt dove S è il

X/S

substrato limitante la crescita. Moltiplicando 1/X (ovvero normalizzando per il valore

della biomassa) si ottiene

dX/dt 1/X = Y dS/dt 1/X e μ = Y q dove q rappresenta la velocità specifica di

X/S X/S S S

consumo del substrato limitante: la velocità con cui i microrganismi crescono dipende

dalla velocità di consumo del substrato limitante e dalla efficienza di conversione del

substrato in biomassa.

Relazione cinetica tra crescita e formazione del prodotto dipende dal ruolo

del prodotto nel metabolismo cellulare

I prodotti hanno diversa cinetica che dipende dal loro ruolo nel metabolismo del

microrganismo. Se il prodotto è la biomassa -> la velocità di crescita e le rese

corrispondono, perché nel grafico abbiamo sull’asse y la [X] che corrisponde al

27

prodotto, quindi Y = Y . Il 50% del glucosio che do va a finire nella biomassa, l’altro

X/S P/S

50% viene ossidato. Questa è la cinetica più semplice perché cinetica e produzione

corrispondono. Se nel mentre misuro il glucosio vedo che man mano che viene

utilizzato cresce la biomassa.

Altri due casi di cinetica e di produzione:

Quando [X] non è uguale a [P], si hanno due curve diverse, si ha una cinetica di

 produzione associata alla crescita, perché l’andamento è analogo, il

microrganismo man mano che produce biomassa produce anche il prodotto;

classica dei prodotti del metabolismo energetico e dei prodotti del metabolismo

primario. I metaboliti primari: prodotti dal catabolismo (etanolo) o normali

intermediari (amminoacidi), biosintesi dei metaboliti primari durante la crescita

esponenziale. Perché vengono fatti l’etanolo o acido lattico? Perché il

microrganismo deve scaricare potere riducente per ricavare potere ossidante

per la glicolisi.

Quando si ha un antibiotico o un metabolita secondario, la cinetica di

 produzione è sempre non associata alla crescita; in genere la produzione inizia

quando il microrganismo entra in fase stazionaria, quindi quando la μ tende a

diventare costante il microrganismo inizia a produrre. È propria del metabolismo

secondario, dei metaboliti secondari, biosintesi del prodotto durante la

crescita stazionaria.

L’acido citrico che è un metabolita primario si accumula alla fine della fase

esponenziale e durante la fase stazionaria di crescita.

Andamento della fermentazione: 3 curve -> cellula, prodotto, substrato. C’è un

andamento simile tra crescita e produzione, serve una costante per mettere in

relazione velocità di crescita e velocità di produzione; se invece le due curve hanno un

andamento diverso la storia si complica.

Produzione del metabolita primario

dP/dt = Y dX/dt dove Y è il coefficiente di resa prodotto/biomassa riportato come g

P/X P/X

di prodotto per g di biomassa. Moltiplicando per 1/X si ottiene dP/dt 1/X = Y dX/dt 1/X

P/X

e abbiamo q = Y μ che è la produttività specifica. Dove q rappresenta la velocità

P P/X P

specifica di formazione del prodotto (misurata come g di prodotto per g di biomassa

nell’unità di tempo). Moltiplicando per la biomassa totale si ottiene la produttività

volumetrica (g di prodotto per volume nell’unità di tempo). R = q X

P

Produzione di prodotti parzialmente correlati con la crescita

dP/dt = α dX/dt + β X dove α e β sono costanti dipendenti dal processo.

FED-BATCH

Un processo di fed-batch è un processo batch basato sull’aggiunta (feeding) del

substrato limitante la crescita (zuccheri, precursori) alla coltura. La strategia fed-batch

è tipicamente usata in processi bio-industriali per raggiungere un’elevata densità

cellulare nel bioreattore. La soluzione da aggiungere è altamente concentrata per

evitare la diluizione del bioreattore. L’aggiunta controllata del nutriente influenza

direttamente la velocità di crescita della coltura. Il feeding viene introdotto in genere

quando il substrato iniziale è quasi totalmente consumato. Il volume della coltura e la

28

composizione del terreno cambiano durante la fermentazione. I nutrienti si aggiungono

esattamente quando se ne ha bisogno perché non è possibile aumentare di molto il

volume. Il fed-batch viene fatto quando il microrganismo tende ad entrare nell’ultima

fase della crescita esponenziale e tende ad entrare nella fase stazionaria. Facendo ciò

il microrganismo continua a crescere, non entra in fase stazionaria, ma la crescita con

cui procede è una crescita in cui la μ è diversa. La pendenza della fase di crescita

successiva è sempre ridotta rispetto alla μ che è diversa tra una fase e l’altra. Come

viene fatto un feeding fatto bene? Quando si dà il feeding (mL/min) bisogna darlo

molto concentrato per evitare che la curva cambi. Ma perché il glucosio rimane

costante nel mezzo anche se gliene aggiungo? Perché un buon feeding è quando

faccio consumare al microrganismo minuto per minuto tutto il glucosio che aggiungo,

perché lo posso fare? Perché si ha una biomassa che è arrivata al massimo, sfrutto

il fatto che la biomassa vitale è cresciuta già nel batch, ho una biomassa vitale

importante. Bisogna controllare dall’esterno quanto cresce il microrganismo, bisogna

controllare entro certi parametri fissi quanto glucosio dare e controllare momento per

momento. Ovviamente ci sono dei limiti di concentrazioni da dare al microrganismo.

Per la crescita il substrato limitante può essere il glucosio, per la produzione il

substrato limitante può essere l’azoto, se aggiungo nello stesso modo l’azoto anche la

curva di produzione varia come quando aggiungo glucosio che va a variare la curva di

crescita. Si dà un po’ di zucchero per mantenere la crescita cellulare, si dà azoto per

promuovere la produzione dei prodotti, come ad esempio per produrre gli

amminoacidi. (Feeding per produrre aa).

Vantaggi:

Prolungata fase di crescita e/o produzione

 Si evita repressione ad catabolita e problemi osmotici dovuti ad alte

 concentrazioni di zuccheri -> se si aumenta tanto il glucosio nel tempo zero si

incappa nel problema della pressione osmotica. Quando il glucosio diventa

molto concentrato si ritorna nella condizione del miele ad esempio, il glucosio

lega tutte le molecole d’acqua quindi il microrganismo non riesce a crescere. Ad

Saccharomyces

alte [zucchero] il collassa. Il concentrazione di glucosio nel

mezzo non è mai molto elevata. Quando ho una cinetica di produzione di un

metabolita secondario, perché un antibiotico viene prodotto nella fase

stazionaria? Per il ruolo che ha nel metabolismo del microrganismo. Il

microrganismo produce l’antibiotico quando non ha nutrienti. Gli antibiotici

vengono prodotti come forma di competizione quando i nutrienti scarseggiano.

Il microrganismo ha un sistema di regolazione che li impedisce di produrre

antibiotico finché ci sono tanti nutrienti, come sono fatti i terreni di

fermentazione? Sono ricchi, complessi quindi pieni di nutrienti. Se si riesce a

capire la concentrazione di glucosio da dare si ha un aumento della crescita e

della produzione e si mantiene costante la concentrazione di glucosio

Diminuisce la viscosità del brodo

 Diluizione dei metaboliti tossici

Svantaggi:

Elevato rischio di contaminazione

 Processo complesso, bisogna prevedere un feeding, fare un’analisi chiara,

 bisogna studiare tutto il sistema

Elevata instabilità genica, più duplicazioni si fanno fare al microrganismo più si

 possono avere mutazione o perdere costrutti ricombinanti 29

Fermentazione fed-batch a volume variabile

Considerando che:

La velocità specifica di crescita dipende

 unicamente dalla concentrazione del

substrato limitante

La concentrazione del substrato limitante

 durante il feed è costante

Le rese (yields) sono costanti durante tutto il

 tempo della fermentazione

IN CONTINUO

Prevede un sistema aperto sia per i nutrienti che

per la biomassa, viene aggiunta continuamente una soluzione sterile di nutrienti e

viene rimosso dal sistema sia terreno che biomassa formata. Si immette il nutriente

continuamente (ml/min), si ha un flusso in entrata ma si ha anche un flusso in uscita.

Si possono distinguere due tipi di fermentazione in continuo:

Plug flow reactor, entra il nutriente ed esce il prodotto, dato che non c’è

 agitazione si va a formare un gradiente di concentrazione. In questo tipo di

fermentazione in continuo, la coltura fluisce attraverso un reattore tubolare

senza mescolamento meccanico. La

composizione della soluzione contenente i

nutrienti, il numero di cellule, il trasferimento

di massa e la produttività variano a seconda

del punto in cui ci si trova nel sistema.

All’ingresso del reattore, le cellule devono

essere continuamente aggiunte insieme ai

nutrienti.

Turbidostato, il volume può variare ma

 rimane costante il valore della biomassa nel

sistema, per mantenere la concentrazione

cellulare

Chemostato, il volume è il parametro che rimane costate -> si fa entrare tanto

 volume per minuto quanto volume per minuto esce.

Sistema più utilizzato è il chemostato, tanto entra tanto esce.

Bioreattore mescolato omogeneamente: si può distinguere in chemostato o

turbidostato. CHEMOSTATO

È fatto da un reattore agitato meccanicamente che ha il suo motore, all’ingresso c’è

un sistema per immettere la soluzione nutriente e c’è un sistema per raccogliere la

fuoriuscita della soluzione nutriente. Questi sistemi sono utilizzati in maniera ridotta

negli impianti di fermentazione perché è difficile mantenere l’operatività del sistema.

Con questo sistema possono controllare la velocità di crescita (vantaggio), sistema che

continua a crescere ad una certa velocità di crescita e continua a produrre ad una

certa velocità di produzione. Il problema è che si rischia la contaminazione, le cellule

continuano a duplicare e di conseguenza aumentano le instabilità genetiche. Il sistema

deve essere assolutamente controllato, tanto entra tanto esce, se entra un terreno

30

particolato, se escono grumi di biomassa il chemostato tende a non andare

all’equilibrio. Non si fanno cicli di sterilizzazione, etc si fa continuamente andare nel

tempo, ma questo comporta problemi: contaminazione, mancanza di raggiuta

dell’equilibrio. Se si ha un reattore in continuo una volta raggiunto l’equilibrio questo

produce sempre. È un sistema che in continuo produce il prodotto. Servono dei sistemi

di Harvest quasi in continuo, ogni tot vanno fatti. In un chemostato si fornisce terreno

sterile ad una coltura omogenea e ben mescolata con la stessa velocità di flusso con

cui viene rimosso il terreno esaurito. Nella fase stazionaria, la crescita cellulare è

controllata aggiustando la concentrazione del substrato che viene fornito. Ad un certo

punto la concentrazione delle cellule, del substrato e del prodotto rimarranno costanti

nel tempo. Ogni substrato necessario (carboidrati, composti azotati, sali, O ) può

2

essere usato come fattore limitante. In un turbidostato, la crescita cellula è mantenuta

costante usando la torbidità per monitorare la concentrazione della biomassa in

maniera da regolare la velocità con cui vengono forniti i nutrienti.

Vantaggi:

Studi metabolici e fisiologici sono condotti in condizioni definite e costanti

 Densità e velocità di crescita possono cambiare indipendentemente

 Estensione della fase di crescita

 Massima produttività

 Rimozione metaboliti tossici

Svantaggi:

Alto rischio contaminazione

 Elevato costo iniziale

 Elevata instabilità genetica: mutazioni spontanee

 Non consigliabile per microorganismi filamentosi e terreni viscosi

Crescita nel chemostato

Nel chemostato, un flusso F passa attraverso il reattore che ha un volume operativo V.

Il flusso è sempre mantenuto costante (sia in ingresso sia in uscita) per mantenere il

-1

volume costante. Se D (h ) è la velocità di diluizione: D =F/V F = mL/h V = volume

operativo = mL. Se il volume è costante, il terreno fresco entra con una velocità di

diluizione D e la biomassa ed il terreno fermentativo escono con la stessa velocità di

diluizione. La quantità di biomassa dipende dalla concentrazione del substrato

limitante. Nella fermentazione in batch: dX/dt = μ X. Nella fermentazione in continuo:

crescita-effluente dX/dt = (μ X) – (D X) = (μ – D) X

Se μ > D la biomassa aumenta, se μ < D la biomassa diminuisce, se μ = D si ha

l’equilibrio. Con questo sistema di aggiustamenti si raggiunge l’equilibro. Il dX/dt è non

più variabile, la velocità di crescita diventa un parametro costante che è uguale alla

velocità di diluizione. La concentrazione di biomassa nel chemostato rimane costante

perché quello che entra è uguale a quello che esce. Fino a quanto posso aumentare la

D? C’è un limite biologico? Esiste una diluizione critica, aumentando il flusso di

nutrienti ci sarà un momento in cui non si può più fare il continuo. A cosa corrisponde

la diluzione critica? D = μ . Le cellule non riescono più a compensare quello che

CRIT MAX

metto dall’esterno, forzo il sistema, quindi devo sempre lavorare sotto la diluizione

critica.

Equazione di Monod all’equilibrio (steady state = stato stazionario) 31

D = μ

D = μ S / K + S

M S

S = concentrazione del substrato limitante la crescita. Il sistema è mantenuto costante

aggiungendo il substrato limitante con lo stesso flusso in ingresso ed in uscita.

S > > K -> D = μ

S crit MAX

μ e D rappresentano i limiti del sistema. Il chemostato lavora mantenendo D <

MAX crit

D , altrimenti ils sitema non rimane in equilibrio. Aumentando D quando D < μ la

crit

velocità di crescita aumenta, quando D > μ c’è un dilavamento (le cellule escono

molto velocemente e la velocità di crescita diminuisce). Aumentando la velocità di

diluizione nel tempo: aumenta lo sviluppo di batteri nel tempo e lo si fa fino a che non

si arriva alla μ .

CRIT PROCESSI

Fermentazione alcolica

Fermentazione tradizionale, utilizzata per produrre bevande alcoliche, lievito, utilizzata

nel settore alimentare. Viene vista come produzione di biofuel: fonte di energia

alternativa, macchine che vanno ad etanolo. Uso alimentare tradizionale ed uso

attuale per problemi energetici.

Saccharomyces cerevisiae: è un lievito, fungo, gruppo degli aspomiceti (spore durante

il ciclo meiotico).

Zymomonas mobilis: batterio, Gram negativo.

Questi due microrganismi sanno produrre alcol, ma dove si trovano in natura? Si

Saccharomyces

trovano sull’acino dell’uva. Rompendo l’acino d’uva entra a contatto

Zymomonas

con gli zuccheri ed inizia a fare la fermentazione. fa la stessa cosa ma

nella canna da zucchero, le bevande fermentate derivano dalla canna da zucchero (in

Brasile), fa la fermentazione alcolica della canna da zucchero.

Esiste un processo chimico competitivo che è l’idratazione catalitica dell’etilene. Le

produzioni di etanolo per via biologica non è competitiva nei confronti della produzione

chimica, non conviene produrre etanolo da biomassa anche se è più ecocompatibile,

più legato ad un discorso di approvvigionamento energetico.

L’etanolo fluidifica le membrane, fa sì che l’integrità della cellula venga meno perché

si scioglie la membrana. La tossicità aumenta con il numero degli atomi di carbonio.

C’è un limite biologico alla produzione di etanolo perché diventa tossico per lo stesso

produttore.

Fermentazione per la PRODUZIONE DI ALCOL 32

Saccharomyces cerevisiae Zymomonas mobilis

Due microrganismi: e

Produzione di etanolo per fini alimentari: vino, birra, liquori

Processo più importante è per la produzione di etanolo come biocombustibile. Su

questo processo il Brasile e gli Stati uniti hanno investito molto. Il bioetanolo è il

biofuel più prodotto al mondo.

Per la produzione di etanolo esiste un processo chimico competitivo: idratazione

catalitica dell’etilene.

Come si produce il bioetanolo? Lo si produce dalla biomassa, quindi la si recupera

e non si utilizza petrolio e non contribuisce all’emissione della CO2. Utilizzando la

biomassa, che fissa la CO2, si ha un bilancio netto (la CO2 che si genera viene ri-

fissata). I due aspetti importanti sono la fermentazione alcolica abbinata alla

degradazione dei substrati delle biomasse vegetali. Prima della fermentazione è

necessario sviluppare dei sistemi di degradazione della biomassa, perché i due

microrganismi non sanno idrolizzare da soli i substrati che vogliamo fornire al sistema

per produrre bioetanolo.

Due processi: produzione di etanolo di prima generazione -> hanno utilizzato

l’amido di mais per fare il bioetanolo. Questo tipo di etanolo prodotto dall’amido è

chiamato bioetanolo di prima generazione. Problema: siccome siamo in un’economia

globalizzata, il costo delle farine è aumentato e ha creato problemi di

approvvigionamento nei paesi in via di sviluppo. Importante creare etanolo di

seconda generazione -> mettere nella benzina i residui di biomasse che non

competono con le filiere alimentari. Se uso i sottoprodotti di lavorazione di farine

(crusca grano, paglia) non vado a competere con la filiera alimentare e riciclo

materiale organico. Produco etanolo da scarti. Dal punto di vista dei due

microrganismi, questi non sanno né degradare l’amido né la biomassa cellulosica,

quindi è importante il passaggio di degradazione di biomassa vegetale prima della

fermentazione alcolica. Concetto di bioraffineria: alternativa biologica alla raffineria

classica (chimica del petrolio) che produce sottoprodotti chimici del petrolio, plastiche.

Questo invece è un processo che va a produrre energia da altra biomassa.

Processo per ottenere etanolo green (o di seconda generazione):

Biomasse vengono pre-trattate in modo chimico-fisico

 Raccolta di biomasse vegetali con invio a bioraffineria

 Idrolisi enzimatica per ottenere zuccheri semplici

 Fermentazione alcolica nei fermentatori

 Distillazione dell’alcol e distribuzione dell’etanolo puro.

Agenti biologici e biotecnologici coinvolti: enzimi idrolitici (cellulasi, amilasi) e

microrganismi fermentanti (più comune il S.C., lievito della birra e del pane).

Microrganismo ideale per la produzione di etanolo deve:

Utilizzare un’ampia fonte di carbonio (polimeri come amido, cellulosa)

 Utilizzare fonti a basso costo e di facile riproducibilità

 Produrre etanolo con alte rese e alte produttività (per cellula e per unità di

 volume) -> due aspetti che limitano questo: tossicità dell’etanolo (scioglie le

membrane cellulari ad alte concentrazioni); come convertiamo il glucosio in

etanolo? Gli diano tanto zucchero, questo entra nella glicolisi, arriva a piruvato

e diventa etanolo, ma questo è limitato dal fatto che se continuo ad aumentare

la concentrazione di zucchero arrivo a stress osmotico (soluzione troppo densa

di zucchero -> acqua esce dalla cellula e muore)

Tollerare alte concentrazioni di etanolo

 33

Tollerare pressioni osmotiche causate dall’elevata concentrazione di substrato

 iniziale

Crescere a temperature relativamente elevate per ridurre il rischio di

 contaminazioni e per facilitare il recupero del prodotto -> evito di sterilizzare e

raffreddare

Flocculare facilmente per semplificare le operazioni di separazione della

 biomassa -> il processo deve costare poco, quindi posso evitare di fare

centrifugazione perché la biomassa sedimenta e posso distillare (aumento T,

etanolo evapora e si attacca a un piatto superiore separandosi dall’acqua)

Tutte queste caratteristiche le devo creare tramite il miglioramento del microrganismo

produttore, non esiste un microrganismo in natura con queste caratteristiche.

Saccharomyces cerevisiae

Lievito del pane, vino e birra

 È un fungo che appartiene agli ascomycota (microscopici e comprendono le

 muffe e i lieviti anche se non sono filamentosi ma tondeggianti)

Si riproducono per gemmazione

 Sono anaerobi facoltativi

 Modello eucariota per le vie metaboliche fermentative

 Usato per la produzione di biomassa e proteine eterologhe

 Si alternano cicli aploidi e diploidi. Forma cellule che provengono dalla divisione

 della cellula madre e possono avere una prima differenziazione asessuata, i due

tipi si fondono e iniziano la meiosi (riproduzione sessuata)

carlsbergensis

Il più famoso è il S.C., un altro famoso è il (per fare la birra).

 Saccharomyces cerevisiae

Microrganismi che utilizzano substrati diversi: il utilizza

glucosio, fruttosio e galattosio (monosaccaridi esosi) e il saccarosio, maltosio e

maltotriosio. Se utilizza disaccaridi e trisaccaridi avrà enzimi idrolitici che li rompono,

ma non ha enzimi che degradano polisaccaridi (come le amilasi). Il carlsbergensis ha

Saccharomyces cerevisiae.

stessa caratteristica del Alcuni lieviti, non molto comuni,

sanno fare alcol, ma meno degli altri due, con caratteristiche di substrati diversi.

Utilizzano per esempio monosaccaridi pentosi. Avranno rese minori di conversione di

Saccharomyces cerevisiae

glucosio in alcol ma sanno utilizzare substrati che non sa

utilizzare.

I fermentatori classici come Saccharomyces sanno utilizzare solo esosi, al

massimo disaccaridi e trisaccaridi. In natura recentemente sono stati isolati

lieviti che sanno utilizzare il lattosio, utile per convertire uno scarto in

etanolo. Ci sono lieviti che usano i pentosi, utile quando voglio usare per

esempio la paglia per produrre etanolo.

Nell’era post genomica ci conviene prendere i geni di lieviti che producono poco

Saccharomyces

etanolo e metterli in rendendolo capace di utilizzare lattosio e pentosi

-> ingegnerizzo un ceppo. Tutti questi lieviti e anche i ricombinanti non hanno la

capacità di idrolizzare i polimeri.

Zymomonas

Batterio Gram negativo bastoncellare, anaerobio facoltativo, affine

 filogeneticamente a pseudomonadali

Microaerofilo anaerobio, si trova sui frutti e sulle piante (succhi di agave, palme,

 canna da zucchero) in zone tropicali dove viene usato per la preparazione di

bevande tradizionali

Organismo industriale usato per la produzione di etanolo

 34

Crescono più velocemente degli eucarioti, ma produce meno biomassa. A causa del

fatto che non fanno la glicolisi producono 1 ATP al posto di uno. Sono tolleranti a

concentrazioni di zucchero più elevate, quindi possiamo immettere più zuccheri nel

processo. Sono più sensibili ai sali. Resistono di più all’etanolo (13%), mentre il

Saccharomyces cerevisiae

classico è intorno all’11%. Ampio range di pH e

temperatura ottimale più alta. Resa su glucosio circa al 97% della resa teorica contro il

Saccharomyces cerevisiae.

92% di Zymomonas

Il problema di è che utilizza solo glucosio, fruttosio e saccarosio. Quando

utilizza fruttosio e saccarosio produce anche altri prodotti collaterali quali di-

idrossiacetone, glicerolo, mannitolo in presenza di fruttosio e levani o sorbitolo ->

abbassa resa di etanolo su zucchero e fornisce prodotti che interferiscono con la

produzione di etanolo.

Fermentazione

Scaricare potere riducente su intermedio metabolico. Nel caso di produzione di etanolo

si scarica su piruvato. Le principali vie cataboliche sono glicolisi, con la quale si arriva

a piruvato, che è trasformato in Acetil-CoA. Se microrganismo mangia acidi grassi e

aa, i primi vengono scomposti in un unità di Acetil CoA che entra nel ciclo di Krebs, gli

aa sono convertiti in chetoacidi. Se microrganismo cresce solo su aspartato, il ciclo di

Krebs funziona sia per degradare la molecola sia come via anabolica.

Vie glicolitiche:

Glicolisi

 Via di Entner-Doudoroff

 PPP: via dei pentoso fosfati o shunt dell’esoso monofosfato

La via dei pentoso fosfati in una cellula normale serve per rifornimento di vie

anaboliche perché fornisce scheletri del carbonio a 5 atomi, per formare i nucleotidi, e

a 4 atomi. (Saccharomyces cerevisiae)

Le cellule classiche fanno la glicolisi e in parallelo fanno la

via dei pentoso fosfati per motivi anabolici. Zymomonas

La seconda via (ED) è una variante della glicolisi, usata da che produce

un solo ATP, al posto di 2. ED: ossidazione del glucosio con produzione di NADPH, si

forma il 6-fosfogluconato e da questo si forma per disidratazione il 2-cheto-3-deossi-6-

fosfogluconato, questo è idrolizzato da aldolasi che produce piruvato e gliceraldeide-

3-fosfato. Questo processo che porta a produzione di piruvato e G3P fa sì che si formi

una sola molecola di ATP netta. ZM sa fare solo questa via perché ha questi enzimi e

non ha enzimi di glicolisi. È una glicolisi meno energetica. Enzimi efficienti e veloci e la

glicolisi alternativa va molto velocemente. Ha comunque una variante della via dei

pentoso fosfati.

PPP: prima reazione uguale a reazione di ED (ossidazione di glucosio), seguita da

decarbossilazione che porta alla formazione di un pentoso che viene assemblato a

formare eptosi, triosi ecc.

Saccharomyces cerevisiae veloce trasformatore di glucosio in etanolo con

Zymomonas

glicolisi classica. converte glucosio in etanolo più velocemente

ma cresce di meno perché produce 1 ATP. In anaerobiosi i microrganismi non

sanno usare i pentosi, anche se hanno le vie dei pentoso fosfati usate per

l’anabolismo. Questa via converte i pentosi e ci consente di ottenere un 3+2

quando utilizziamo per degradare un pentoso che entra. Se faccio crescere

microrganismo solo su C5, come il lievito riesce a fermentarlo? Perché ha

Saccharomyces cerevisiae

enzimi che non ha. Gli enzimi che mancano

possono essere quelli di trasporto nella via dei pentoso fosfati, quelli di

35

Saccharomyces cerevisiae

conversione (xilosio in xilulosio per esemio). In e

Zymomonas studio la via dei pentoso fosfati per capire anche come devo

ingegnerizzarli.

Vie glicolitiche sono state studiate per sapere come andare a ingegnerizzare il

microrganismo.

Saccharomyces cerevisiae,

Quando manipolato geneticamente, riesce a mangiare i

pentosi, il metabolismo del pentoso mi genera una mole di piruvato, al posto di due, e

una di acetato. Quindi diventa poco efficiente e produce mento etanolo, e produce

pure acetato che non va nel ciclo di Krebs ma rimane come acetato. Acido acetico si

accumula nel mezzo, è tossico, abbassa il pH e aumenta la etero-fermentazione.

Quando uso la via dei pentoso fosfati come via catabolica, faccio crescere

microrganismo su pentoso. Quando un pentoso entra nella via e viene catabolizzato,

mi dà un 3+2.

Il ciclo di Krebs è una via catabolica, per consumare acetil CoA, ma funziona anche per

anabolismo. Quando funziona per anabolismo, per ripristinare il ciclo di Krebs vengono

usate le reazione anaplerotiche: da PEP si produce ossalacetato e un’altra

Negli anaerobi facoltativi, quando vivono in anaerobiosi, il ciclo di Krebs funziona per

l’anabolismo. Viene interrotto a livello di alfa-chetodeidrogenasi, non sarà più ciclico.

Il ciclo di Krebs funziona nel metabolismo anaerobico per creare potere riducente ed

ATP e nel metabolismo aerobico per produrre prodotti intermedi, funzionano anche le

reazioni anaplerotiche quando produce intermedi metabolici per vie di metabolismo

anabolico. Cosa succede negli aerobi? La piruvato deidrogenasi (produce

acetil_CoA) e poi la piruvato decarbossilasi (via anaplerotica). Mentre negli anaerobi:

glucosio arriva a piruvato con le vie glicolitiche, poi viene trasformato in acetaldeide

che viene trasformata in etanolo. La fermentazione classica per produzione di etanolo

Saccharomyces cerevisiae.

utilizza Dal piruvato si può formare anche lattato. Nello

schema della fermentazione anaerobia si hanno alcune reazioni nelle quali viene

scaricato potere riducente su un intermedio metabolico organico, che non è ossigeno.

Nella fermentazione alcolica viene scaricato su acetaldeide per la produzione di

etanolo. Nella fermentazione lattica il potere riducente viene scaricato sul piruvato per

trasformarlo in lattato. Il fine della diversità metabolica dei batteri è la necessità di

scaricare potere riducente in un metabolismo in cui l’accettore finale non è più

l’ossigeno. Lo scarico del potere riducente su un intermedio organico è chiamato

processo di fermentazione. Cosa si intende per fermentazione? Il potere

riducente è scaricato su un intermedio organico, un composto del

metabolismo. La fermentazione che porta al 2,3 butandiolo porta alla formazione

delle bioplastiche. Saccharomyces cerevisiae? Saccharomyces

Cosa succede al piruvato in

cerevisiae in anaerobiosi il piruvato viene decarbossilato, si forma acetaldeide (esce

CO2) e questo è l’accettore del potere riducente attraverso l’alcol deidrogenasi e

scarica il potere riducente di NADH e forma etanolo. Da 100 g di glucosio si ottengono

48.4 g di etanolo, 3.3 g di glicerolo e 46.6 g di CO . Oltre alla fonte di carbonio, il

2

2+

terreno deve contenere N, P, S, Ca ma anche fattori di crescita come biotina, inosina,

pantotenico. 2 ATP per mole di glucosio e due moli di etanolo, resa molto elevata

perché il processo avviene in maniera efficiente. La maggior parte del glucosio passa

attraverso questo flusso metabolico principale, una parte viene ridotto a glicerolo

oppure una parte può dare ossalacetato con una reazione anaplerotica producendo

succinil_CoA. In condizioni fisiologiche in anaerobiosi ha un’alta resa teorica, ma se si

36

va a forzare il sistema dando elevate concentrazioni di glucosio si possono avere due

problemi: problemi di pressione osmotica, omotolleranza, e una parte degli intermedi

“scappano” e vanno a formare glicerolo e acido succinico (questi sono dei

sottoprodotti che non sono voluti perché fanno perdere la resa della reazione). Si

Saccharomyces

creano dei sottoprodotti perché si ha un overflow metabolico.

cerevisiae +

deve scaricare il potere riducente perché vuole rigenerare NAD per andare

avanti nella glicolisi perché produce 2 ATP.

Competizione tra piruvato deidrogenasi e piruvato decarbossilasi. Se siamo in regime

di ossigeno la PDH trasforma piruvato in acetil_CoA, va incontro al ciclo di Krebs e

produrrà 38 ATP per mole di glucosio. In caso contrario la PDC va a formare 2

acetaldeide dalle quali si ottengono 2 etanolo, 2 ATP e 2 CO . Quando la resa di massa

2

in glucosio tra le due è molto diversa, stessa cosa per la resa di etanolo su glucosio.

EFFETTO PASTEUR IN LIEVITO

Pasteur si accorse che l’etanolo veniva prodotto in anaerobiosi. Cosa dice l’effetto

Pasteur? In assenza di ossigeno il lievito accelera il consumo di zucchero. Se si

immette ossigeno in una fermentazione anaerobica, le cellule iniziano ad utilizzarlo,

rallentano il consumo di glucosio e cessano l’accumulo di etanolo. Attività

fosfofruttochinasi è stimolata da ADP ed inibita da ATP in eccesso. Modulatori negativi

dello stesso enzima sono anche acido citrico e isocitrato, che indicano il

funzionamento del ciclo di Krebs. L’effetto Pasteur è che quando immetto ossigeno

diminuisce la produzione di etanolo e rallenta il consumo di glucosio. Se sono in

anaerobiosi e tolgo progressivamente l’ossigeno, si inizia a produrre etanolo e

aumenta il consumo di glucosio. Perché? Per compensare la scarsa produzione di ATP

che avviene in anaerobiosi. Questo effetto si riferisce al rallentamento dell’utilizzo di

glucosio quando si immette ossigeno in un ambiente anaerobico. Perché?

Saccharomyces cerevisiae può fare la glicolisi può lentamente se ha il ciclo di Krebs

funzionante, se invece non ce l’ha funzionante deve andare più veloce. Regolazione a

livello della PFK: la PFK è stimolata dall’ADP ed è rallentata dall’ATP. È fondamentale

quindi il bilancio ATP-ADP sulla fermentazione. Attività della PFK è stimolata da ADP ed

inibita da ATP in eccesso. I modulatori negativo dello stesso enzima sono anche acido

citrico e isocitrato.

EFFETTO GLUCOSIO O CRABTREE IN LIEVITO

Un’analisi successiva rispetto alle osservazioni di Pasteur. Quando si lavora in eccesso

di zucchero (concentrazioni non fisiologiche) cosa si ottiene? Si può produrre un po’

di etanolo anche in presenza di ossigeno. Se si ha poco ossigeno e si ha

concentrazione fisiologica di glucosio si ha la produzione di etanolo. Se si ha tanto

ossigeno e concentrazioni normali di glucosio si ha formazione di biomassa. Se si ha

poco ossigeno e si ha tanto glucosio si ha etanolo. Se si ha tanto glucosio e anche

tanto ossigeno si ha anche in questo caso etanolo (questo sarebbe la parte che non

torna). Qual è il meccanismo alla base? È una deregolazione tra la glicolisi e il ciclo

di Krebs, è un overflow metabolico. La glicolisi va veloce, si accumula acido piruvico e

una parte del pool va a formare acetaldeide o etanolo e una parte può uscire dalla

cellula. Che svantaggio ha? La fermentazione da omofermentante diventa

eterofermentante. Problema di recuperare etanolo da questi prodotti, l’acetaldeide e

l’acetato in elevate quantità diventano tossici. Quindi è un sistema sfruttato ma con

moderazione.

In ED si ha una minor produzione di biomassa e una maggior produzione di etanolo,

minor produzione di biomassa perché si ha meno produzione di ATP. Il ciclo: da

37

glucosio a glucosio 6P a acido 6 fofogluconico a 2 KDGP a gliceraldeide 3P e piruvato.

Il metabolismo ED del glucosio produce 2 NADH che vengono utilizzati

stechiometricamente per la produzione di etanolo. Produce una sola mole di ATP per

Zymomonas

mole di glucosio, ma ha livelli molto alti di enzimi e flussi glicolitici ed

etanologenici. Cresce bene in terreno minimo.

SACCHAROMYCES CEREVISIAE

TOSSICITA’ DELL’ETANOLO IN

Bassa tolleranza ad etanolo: etanolo è tossico in concentrazioni dall’8% al 18% a

seconda del ceppo e delle sue condizioni metaboliche. Interferisce con la stabilità delle

membrane cellulari. La fermentazione si arresta a concentrazioni intorno all’11% di

etanolo. L’etanolo fluidifica le membrane cellulari. Bisogna aumentare la resistenza dei

ceppi all’etanolo affinché non siano limitati dal prodotto finale. Le cellule di lievito che

crescono in presenza di etanolo aumentano la quantità di acidi grassi insaturi e a

Saccharomyces cerevisiae

lunga catena nelle membrane cellulari. ha un suo sistema

per compensare la tossicità dell’etanolo, fino ad un certo punto visto che cambia la

conformazione della membrana che diventa meno fluida a temperatura ambiente. Si

ha così una diminuzione della fluidità della membrana compensatorio all’effetto

fluidizzante dell’etanolo. Questo fenotipo della resistenza all’etanolo non può essere

aumentato. Com’è stato selezionato questo ceppo? È stato mutato il WT e poi è

stato selezionato quello maggiormente resistente. L’altro sistema di miglioramento dei

ceppi è stato quello di mutare e selezionare fenotipi con una resistenza maggiore alle

concentrazioni di glucosio.

TOSSICITA’ DELL’ETANOLO IN ZYMOMONAS MOBILIS

Maggiore tolleranza ad etanolo: etanolo è tossico in concentrazioni intorno al 13%. Le

cellule contengono membrane ricche di fosfolipidi con acidi grassi insaturi con un

contenuto particolarmente elevato di molecole sterolo-simili dette opanoidi. Quindi ha

una membrana già più resistente all’etanolo. Ovviamente si è cercato di migliorare le

proprietà di questi microrganismi cercando di potenziare dei fenotipi già predisposti.

SUBSTRATI UTILIZZATI DAI LIEVITI

Glucosio e fruttosio: entrano attraverso lo stesso trasportatore di membrana

 e come composti 6P entrano nella glicolisi. Sistema di fosforilazione associato al

trasporto.

Saccarosio: è idrolizzato in glucosio e fruttosio da INVERTASI esocellulari. I

 disaccaridi possono entrare o con dei sistemi di trasporto specializzati o

vengono idrolizzati all’esterno. L’invertasi si SC viene utilizzata per fare gli

sciroppi di frutta.

Mannosio (2-epimero del glucosio) e galattosio (4-epimero del glucosio):

 vengono convertiti in glucosio 6P.

Maltosio e lattosio: vengono trasportati all’interno della cellula e idrolizzati da

 glucosidasi intracellulari, ma solo alcuni lieviti.

Amido: non viene idrolizzato ma vi è necessità di aggiungere amilasi per

 l’idrolisi di maltodestrine più lunghe di maltotrioso e di isomaltosio. I lieviti non

sanno idrolizzare l’amido.

Cellulosa, emicellulosa, cellobiosio e molti pentosi: non vengono utilizzati.

 Solo alcuni lieviti utilizzano i pentosi. I lieviti non sanno idrolizzare cellulosa ed

emicellulosa.

SUBSTRATI PER LA FERMENTAZIONE 38

Ridotta possibilità di usare substrati a basso costo. Il substrato ideale per i lieviti sono

le melasse da barbabietole e da canna da zucchero che contengono: saccarosio,

raffinosio, fonti di azoto, elementi in tracce e vitamine. Z. mobilis produce anche

mannitolo e di-idrossiacetone fosfato da saccorosio. Bioetanolo di prima generazione:

pretrattamento di amidi. Bioetanolo di seconda generazione: pretrattamento materiale

ligneocellulosico.

Preparazione dei nutrienti

Il costo dei nutrienti conta per più del 50% del costo del processo.

Granaglie, tuberi o radici contenenti amido (etanolo di prima generazione):

 pretrattamento a caldo e a pressione, si cerca di evitare il più possibile solventi

e composti chimici e si usano degli enzimi per fare idrolisi enzimatica (questi

Aspergillus Aspergillus

enzimi vengono preparati da α-amilasi e glucoamilasi di

spp utilizzati poi per pretrattare la biomassa).

Legno e sottoprodotti della lavorazione del legno, residui agicoli, rifiuti urbani

 (etanolo di seconda generazione): pretrattamento per rottura meccanica, a

vapore, sotto pressione, seguito da idrolisi enzimatica con cellulasi di

Trichoderma reesei. La cellulosa è un polimero di zuccheri, l’emicellulosa è un

polimero di esosi e pentosi. Nel momento in cui si liberano gli zuccheri può

partire la glicolisi. La lignina è formata da propil-aromatici.

Acque bisulfitiche, sottoprodotto della lavorazione carta contenente

 principalmente pentosi.

Processi industriali per la produzione di etanolo

Preparazione della soluzione nutriente

 Fermentazione in batch o in semicontinuo

 Distillazione

Se la preparazione dei nutrienti costa il 50% circa, il 45% dei costi è occupato dalla

distillazione. Quindi bisogna ridurre anche i costi della distillazione. Se si vuole fare

etanolo di seconda generazione (non compete con filiere alimentari) il costo di questo

etanolo è maggiore di quello prodotto per via chimica.

Fermentazione tradizionale per la produzione di etanolo

3

Processo: in genere batch in reattori di 600m prima aerobiosi per produrre

 biomassa e poi anaerobiosi per produrre alcol

Substrato: idrolizzato di amido o melasse

 6

Agente: lievito al 3% di inoculo (3x10 cellule/ml)

 Temperatura controllata a 30-35°C. Necessità di raffreddamento

 pH controllato con aggiunta di acidi a pH 4.0-4.5 (sopra 5 si rischia

 contaminazione da lattobacilli).

12h, 10-20g (dw)/l; 10% v/v etanolo, 1.9 g/lxh

 Sino a 95% della resa teorica su melasse di buona qualità

Processo di seconda generazione

Recupero della biomassa

 Pretrattamento

 Idrolisi enzimatica per ottenere zuccheri semplici

 Fermentazione

 Distillazione

 39

Ricircolo della biomassa a volte

 Problema: rimane della lignina, non viene utilizzata come fonte di carbonio,

 quindi è un sottoprodotto di questo processo. La lignina è un composto poco

biodegradabile

Miglioramento dei ceppi di lievito

Selezione resistenti a concentrazioni crescenti di etanolo, i quali hanno spesso

 membrane con acidi grassi più lunghi e maggior concentrazioni di steroli

(mutagenesi, fusione protoplasti)

Selezione di buoni flocculatori e lieviti killer (fusione di protoplasti)

 Bacillus subtilis Saccharomyces cerevisiae

Αlfa-amilasi di in per permettere

 idrolisi di amido a 40°C (trasformazione con DNA ricombinante)

Ingegneria metabolica per aumentare la capacità di utilizzare substrati a

 basso costo, ad esempio pentosi quali xilosio componente della emicellulosa.

Pichia

Mutanti che utilizzano xilosio sono stati ottenuti introducendo geni di

stipitis Saccharomyces cerevisiae.

in Zymomonas mobilis

Miglioramenti di

Ingegneria metabolica: introduzione mediante DNA ricombinante di geni per il

trasporto e l’utilizzo di xilosio ed arabinosio provenienti da emicellulose.

Miglioramento di processo 3

Sistemi semi-continui con SC e ZM in due fermentatori (circa 70m ) con riciclo di

biomassa. Per il lievito si fermenta in alte concentrazioni di zucchero e condizioni di

microaerazione (0.2-5 mg O /g peso secco x h). In riciclo di biomassa si recupera circa

2

l’80% della biomassa e si accorciano i tempi di fermentazione. Processi in continuo o

Saccharomyces cerevisiae

con cellule immobilizzate (Giappone): in calcio alginato o

gel di poliacrilammide. Problematicità legata alla contaminazione.

DISTILLAZIONE

Sistema che richiede energia perché serve calore per distillare. È un punto cruciale per

rendere competitivo il processo. Purezza richiesta:

92.4% come solvente per industria chimica, cosmetica e farmaceutica

 99.2% come carburante

Assoluta assenza di sostanze organolettiche non desiderate per bevande alcoliche.

LA PRODUZIONE DELLA BIRRA

La produzione della birra avviene a partire dall’orzo: in alcuni paesi si utilizzano anche

il riso ed il masi. Questi cereali, a differenza dell’uva, non contengono zuccheri

fermentabili ma solo amido. L’amido deve essere saccarificato, scisso cioè in maltosio

e glucosio che saranno poi fermentati. Tale scissione avviene grazie ad un enzima:

amilasi. Fortunatamente l’amilasi è presente negli stessi semi di orzo quando

germinano: quindi i semi vengono umidificati, lasciati germinare ed infine essiccati per

essere immagazzinati e lavorati successivamente. Questo orzo germinato secco si

chiama malto.

LA PRODUZIONE DEL VINO 40

Vino fatto con il lievito, prima fatto con il lievito naturale che si trovava sugli acini. La

differenza tra bianco e rosso può dipendere dagli acini ma anche dal trattamento che

subiscono. Lo champagne ad esempio è un vino rifermentato quindi con un aumento

di CO . I solfiti servono per eliminare la popolazione microbica naturale.

2

LA PRODUZIONE DEL LIEVITO PER LA PANIFICAZIONE

Saccharomyces cerevisiae GRAS

Substrato: melasse con addizioni di Sali di ammonio, idrolizzati proteici, biotina,

 fosfati, vitamine, antischiuma. Il lievito non sa idrolizzare le proteine né

assimilare nitriti e nitrati 3

Fermentazioni fortemente ossigenate da 50-350 m in fed-batch per controllare

 la concentrazione di zucchero (< 50 g/l), ma anche limitare la necessità di

raffreddamento e l’ossigenazione. In genere si applica un feeding esponenziale

Inoculi seriali, la produzione non richiede mantenimento sterilità

 Temperatura 28-30°C, pH 4.5, 15 ora fino all’accumulo di 50-60 g di peso secco

 La biomassa deve essere vitale, con alta e stabile attività fermentativa e poter

 essere conservata in pasta o essiccata

Separazione per centrifugazione o filtrazione rotativa sottovuoto, lavaggio ed

 eventualmente essicazione.

FERMENTAZIONE LATTICA

Il piruvato viene trasformato con un passaggio di riduzione in lattato. Il lattato è un

prodotto interessante e la fermentazione lattica è una delle fermentazioni alimentari

tradizionali. Uno dei prodotti più antichi di fermentazione. Oggi il 70% dell’acido lattico

di utilizzo industriale viene prodotto per via fermentativa e si ricicla la biomassa per

abbassare i costi di produzione. L’acido lattico è utilizzato nell’industria chimica per

materie plastiche e vernici, nell’industria tessile, nell’industria alimentare e

farmaceutica. L’utilizzo più innovativo che ha fatto rivedere la fermentazione lattica

con tecnologia moderne (DNA ricombinante) è la produzione di polilattato:

bioplastica! Utilizzo più recente e più importante per la produzione delle bioplastiche,

la produzione di bioplastiche è in espansione perché si vogliono produrre prodotti

biodegradabili. I batteri lattici hanno un ruolo molto importante nell’industria casearia

e alimentare. I batteri lattici producono batteriocine (peptidi antimicrobici) e

polisaccaridi (aiutano lo sviluppo della corretta flora intestinale). I batteri lattici

vengono utilizzati anche nell’industria dei probiotici. L’acido lattico (prodotto della

fermentazione) viene utilizzato come produttore chimico e l’utilizzo più importante

adesso è quello per studiare il polilattato.

Cosa sono i batteri lattici? Bifidobacterium),

Vari microrganismi, Gram positivi, a basso contenuto di GC (tranne il

sono immobili, asporigeni e hanno richieste nutrizionali complesse. Hanno perso la

capacità di produrre alcuni amminoacidi in quanto vivono in ambienti ricchi. Hanno dei

genomi molto piccolo, 2 megabasi, hanno perso delle basi di DNA perché si sono

adattati agli ambienti ricchi. Quindi non basta un terreno minimo. In genere sono

fermentativi stretti, sono microrganismi che non respirano mai, non scaricano mai gli

elettroni sull’ossigeno, non hanno citocromi e porfirine, hanno solo la fosforilazione a

livello del substrato. Però sono aerotolleranti, possono crescere in presenza di aria

anche se non utilizzano l’ossigeno. Ci sono 3 tipologie dal punto di vista del

metabolismo per la fermentazione lattica: 41

Omolattico: produce acido lattico attraverso la via glicolitica. È il processo

 industriale, ciò che serve per produrre acido lattico industriale.

Eterolattica: produce oltre ad acido lattico anche altri prodotti quali CO , acido

 2

acetico ed etanolo ed utilizza la via dei pentoso fosfati (anche come via

catabolica, di solito viene utilizzata per l’anabolismo). Studiata per la parte di

produzione dei formaggi.

Omolattica facoltativa: se ha glucosio lo trasforma tutto in acido lattico, se gli

 si danno altri zuccheri riesci ad assorbirli e li trasforma in altri composti, grazie

Bifidobacterium,

alle permeasi. Tipica di è un batterio importante nella flora.

Utilizzata nell’industria farmaceutica.

Omolattica

Dalla glicolisi si hanno due moli di piruvato, il piruvato funziona come accettore del

potere riducente, viene ridotto il suo gruppo chetonico e introducono un gruppo

alcolico. Si ottiene l’acido 3 idrossipiruvico = lattato. Cosa succede quando si

riduce un chetone ad alcol? Il chetone ha un doppio legame e viene trasformato

con un carbonio a legame si va a formare un enantiomero, perché il carbonio diventa

chirale (L o D). Vantaggio che rende competitiva la produzione di lattato rispetto a

quello industriale perché la biochimica è enantioselettiva mentre la chimica no. Per

fare il polilattato bisogna avere solo o L o D se no il sistema non funziona. Nella

diversità microbica dei batteri lattici ci sono quelli che fanno solo la D, solo la L o

entrambi (racemi). L-lattato è quello che viene richiesto industrialmente, utilizzato

come conservante, anche nella sintesi della polilattato.

Terreni di fermentazione

C: sciroppo di glucosio (da idrolisi di amido, i batteri lattici non sono in grado di

 idrolizzare l’amido quindi serve già idrolizzato), melasse, siero di latte (aumento

della concentrazione di glucosio dal 6% al 18% per selezione di mutanti)

N: miscele di aminoacidi o idrolizzati di proteine, perché non hanno neanche le

 proteasi che vengono secrete (quelle interne le hanno)

P: fosfati

 Fattori di crescita: vitamine del gruppo B, biotina, pantotenica, aminoacidi

 CaCO : tampone a pH acidi, mantiene pH tra 5.5 e 6.5, perché si aggiunge?

 3

Per due fattori: da una parte la componente del carbonato tampona il mezzo,

impedisce che il pH scenda troppo, dall’altra il Ca forma un sale con l’acido

lattico e questo sale precipita. Il calcio lattato è una sorta di polverina bianca

che precipita e si ha una rimozione dell’effetto tossico, è un modo di iniziare il

downstream già durante la fermentazione. Mettendo carbonato al tempo zero

della fermentazione ha un effetto benefico.

Impianti industriali per la produzione di acido lattico

3

Reattori in acciaio inossidabile da 100-120 m , non sono necessariamente anaerobi,

temperatura 45-60°C, pH ottimale 5.5-8.0, circa 72 ore con rese del 85-95%. Processo

in batch con leggera agitazione meccanica, non è necessaria sterilizzazione

soprattutto con termofili. Il lattato viene recuperato dissolvendo il calcio lattato

attraverso un processo di riscaldamento, filtrando e poi precipitazione del calcio

aggiungendo acido solforico e si va a formare il sale dell’acido solforico. È un

downstream molto semplice e ben definito. Ulteriore concentrazione e purificazione a

seconda degli usi. Rischio di contaminazione da fagi perché i fagi possono essere

nell’aria, esistono tanti fagi dei batteri lattici. 42

Punti critici di questo processo

Tossicità del pH acido

 Contaminazione da fagi

 Costo del processo, perché è un composto che costa un sacco

Metodi per migliorare questo processo:

Selezione di mutanti resistenti a pH acido, metodo che funziona di più è

 mutagenesi e selezione: si introducono mutageni che portano danni al DNA e si

selezionano i mutanti; si chiama quick & dirty, approccio molto efficace,

soprattutto quando un fenotipo è dovuto a meccanismi molecolari non legati ad

un unico gene o a dei geni non bene identificabili

Allontanamento in continuo dell’acido lattico

 Selezione resistenti ai fagi e termofili

 Produzione in lieviti e funghi ricombinanti con più ampia gamma di substrati e

 più resistenti agli acidi. Naturalmente i lieviti non producono acido lattico.

Perché quindi si è voluto ingegnerizzare i lieviti? perché resistono bene a

pH acido. Vengono ingegnerizzati introducendo un gene per la lattato

deidrogenasi (il flusso di elettroni va verso la produzione di lattato) e knocked

out in piruvato decarbossilasi. Sono stati screenati 12000 ceppi batterici per

scegliere quelli che resistono di più agli acidi organici e alle alte temperature.

Sono stati selezionati 9 lieviti e in questi sono stati eliminati gli enzimi per

trasformare il piruvato in acetaldeide e sono stati introdotti i geni per la lattato

deidrogenasi derivanti dal Lactobacillus. Il polilattato in circa un mese viene

degradato dai batteri.

Altri produttori

Ci sono dei funghi filamentosi che sanno produrre lattato in forma L, ad esempio

Rhizopus oryzae.

Streptococcus, lactococcus: omofermentatni, forma L

 Leuconostoc: eterofermentanti, forma D

 Pediococcus: omofermentanti, DL

 Lactobacillus: omofermentanti, eterofermentanti, D o L a seconda della specie

Nello yogurt ci sono degli omofermentanti.

Quali sono le differenze tra gli omofermentanti e gli eterofermentanti?

Le differenze sono dovute alla presenza o assenza dell’aldolasi, enzima chiave della

glicolisi che scinde il fruttosio difosfato in trioso monofosfati. I batteri lattici

eterofermentanti non hanno l’aldolasi e quindi ossidano il glucosio 6P a gluconato 6P,

che viene decarbossilato a pentoso fosfati (come via catabolica) e quest’ultimo viene

scisso dalla fosfochetolasi in trioso fosfato e acetilfosfato. Il composto a 5C viene

scisso in un composto a 3 (gliceraldeide 3P che va a formare piruvato) e in un

composto a 2. Quando si forma acetilfosfato, nei microrganismi fermentanti anaerobi,

questo può andare incontro a due vie: non va nell’acetil_CoA perché non hanno il ciclo

di Krebs; quindi questo composto cede il P ad alta energia ad ADP e si forma ATP e

acetato (nel caso in cui serva ATP), se invece il microrganismo ha bisogno di scaricare

ancora potere riducente, l’acetilfosfato viene ridotto ad acetaldeide che produce

l’etanolo. Questi sono i prodotti che determinano il concetto di eterofermentazione.

L’eterofermentazione cosa produce? L’acetaldeide è uno degli aromi dello yogurt,

43

anche l’acetato dà un aroma diverso; in eccesso di ammonio dal piruvato si forma

alanina che è caratteristica di alcune fermentazioni dei formaggi o sempre degli

yogurt. Eterofermentazione = più vie metaboliche!

2 moli di acido piruvico si condensano e vanno a formare acetalattato + CO ad opera

2

dell’acetolattato sintetasi, poi va incontro ad una reazione di decarbossilazione e si va

a formare acetoina e il gruppo alcolico dell’acetoina può essere ridotto oppure

ossidato.

La biomassa dei batteri lattici è importante per la conservazione dei derivati

alimentari. Effetto protettivo per abbassamento pH (successione popolazioni di batteri

lattici). Produzione di batteriocine antimicrobiche ed esopolisaccaridi. Produzoine di

sostanze aromatizzanti, produzione di yogurt, burro e formaggi.

Per quanto riguarda i formaggi:

Nel latte ci sono i batteri lattici che acidificano il latte e questo comporta una

precipitazione di grassi e proteine; in questo modo si formano la cagliata e il siero di

latte (utilizzato come prodotto di riciclo). La cagliata poi va incontro ad una

successione microbica a seconda del formaggio che si vuole fare. Per produrre ad

Propionibacterium:

esempio l’Emmenthal si utilizza il è un Gram positivo, asporigeno,

immobile, ad alto contenuto di GC, in grado di utilizzare l’acido lattico e produrre acido

propionico, acetato e CO , utilizzato per produrre i buchi del formaggio. Il lattato viene

2

riconvertito in piruvato, questo viene decarbossilato con la formazione del potere

riducente e con la formazione di acetil_CoA. Quest’ultimo viene poi convertito in

acetato. Il piruvato viene convertito in propionato grazie al potere riducente, dato che

il potere riducente (derivante dall’acetil_CoA) viene scaricato sul piruvato si va a

riformare potere ossidante e si forma anche ATP nella trasformazione da acetil_CoA ad

acetato.

SUBSTRATI

I precursori che sono la fonte dei monomeri per tutti i componenti delle cellule

derivano dalle vie principali: glicolisi, ciclo di Krebs e vie strettamente correlate. Tutti i

substrati di crescita per i microrganismi dopo un limitato numero di reazioni, entrano

nelle principali reazioni per fornire all’organismo i precursori metabolici.

Catabolismo microbico nei chemioeterotrofi

La biomassa è formata per il 99% da polimeri e non da monomeri, perché è formata

da polimeri? Perché se no l’acqua entrerebbe e farebbe esplodere la cellula a causa

44

dello stress osmotico. Nella biomassa quindi troviamo le proteine, i lipidi, gli acidi

nucleici e i polisaccaridi. Le proteine vengono scisse in lipidi e questi vengono

idrolizzati in aminoacidi. I lipidi vengono scissi in acidi grassi e glicerolo, il glicerolo

entra nella glicolisi. Quando si fa crescere un microrganismo su un acido grasso

cosa succede? L’acido grasso deve essere beta-ossidato. I polisaccaridi invece

vengono scissi in zuccheri, poi piruvato e infine trasformato in acetato.

Fonti di carbonio diverse dal glucosio

Pentosi e esosi entrano nella glicolisi e nel PPP

 Disaccaridi possono entrare ed essere idrolizzati in monosaccaridi all’interno

 della cellula o essere idrolizzati all’esterno ed entrare come monosaccaridi

Polisaccaridi vengono idrolizzati esternamente alla cellula grazie alla

 secrezione di enzimi idrolitici ad alcuni gruppi microbici

Proteine, le proteasi si dividono in esocellulari ed endocellulari, il ruolo di

 quest’ultime è quello di gestire il turnover delle proteine, che è un’attività

fondamentale della cellula. Vengono idrolizzate esternamente alla cellula grazie

alla secrezione di enzimi idrolitici da alcuni gruppi microbici

Lipidi sono idrolizzati dalla lipasi. Il glicerolo entra nella glicolisi e gli acidi grassi

 sono degradati in acetato via β-ossidazione

Per idrolizzare l’amido servono una serie di enzimi in quanto questo è legato con

legami α 1-4. L’amido inoltre si può trovare anche ramificato. Per idrolizzare l’amido

Bacillus.

c’è l’α-amilasi che deriva soprattutto da Per liquefare l’amido ci sono la β-

amilasi, la glucoamilasi. Per rendere l’amido disponibile per SC bisogna sottoporlo ad

un processo chiamato saccarificazione dell’amido a pH 4.5 a 60°C. per degradare

l’amido serve un cocktail di enzimi. (Pre-trattamento dell’amido).

La cellulosa è un altro polimero del glucosio, i glucosi sono legati con un legame β 1-

4. È un materiale resistente alla degradazione batterica. La cellulosa viene degradata

da funghi decompositori del legno, da batteri aerobi tipo Mixobatteri, da batteri

anaerobi tipo clostridi nel suolo o batteri del rumine (tutti questi hanno le cellulasi).

Endo-β-glucanasi, eso-β-glucanasi, α, β-glucosidasi.

Le emicellulose sono fatte ad esempio da pentosi come ad esempio lo xilosio, anche

per degradare queste bisogna utilizzare un cocktail di enzimi.

La chitina è un polimero di N-acetilglucosamina che si trova negli esoscheletri, nelle

pareti cellulari dei funghi, è un biopolimero e anche questo non è facilmente

degradabile. Un gruppo di batteri che può degradarla sono gli Attinomiceti. La chitina

viene idrolizzata dalle chitinasi. La chitina è presente anche in alcuni batteri tipo il

Vibrio.

FERMENTAZIONE ACETONBUTILICA

Terzo e ultimo processo anaerobio. È un’eterofermentazione.

Glucosio -> trioso fosfato -> piruvato -> 2 acetil_CoA -> acetoacetil_CoA ->

butirril_CoA o acetone.

Fermentazione tipica dei Clostridi, questa fermentazione parte da acetil_CoA

condensando due moli di acetil_CoA. 45

Clostridi

Gram positivi, a basso contenuto di GC, anaerobi obbligati, sporigeni, mobili. Non

hanno citocromi né catena di trasporto di elettroni a livello della membrana e quindi

hanno fosforilazione a livello del substrato per produrre energia. Sono produttori

Clostridium acetobutylicum.

industriali di acidi e solventi. Il più importante è il In

genere sono conservati come spore che sopravvivono in presenza di ossigeno, i

microrganismi in forma vegetativa sono sensibili all’ossigeno molecolare perché non

hanno neanche gli enzimi che detossificano i derivati del metabolismo dell’ossigeno. E’

C. thermocellum).

un gruppo abbastanza eterogeneo, alcuni sono termoresistenti (

Alcuni ceppi di clostridi sanno degradare le cellulose. In genere sono suddivisi in

proteolitici e/o saccarolitici, quelli che sanno fermentare bene gli aminoacidi e le

proteine e che sanno fermentare glucosio, amido, destrine (quindi secernono amilasi).

Questi microrganismi possono aggredire substrati complessi. Da una parte sono degli

idrolitici, ma il fatto che sono eterofermentanti non è un vero vantaggio, sono difficili

da gestire a livello di un processo fermentativo industriale perché bisogna separare i

C. butylicum C. acetobutylicum

prodotti. Più importanti sono e perché producono

acetone, butirrato, acetato, butanolo, H , CO , non sono solo acidogenici sono anche

2 2 C. thermocellum

solventogenici (prodotti di interesse industriale). Altro importante è

perché degrada cellulosa e produce etanolo, ma solo su terreno ben definiti, se no

ritorna ad essere eterofermentante.

Prodotti fermentativi da clostridi:

Acido butirrico e acetico, H , CO

 2 2

Acetone e butanolo, H , CO

 2 2

Acetone, butanolo e isopropanolo, H , CO

 2 2

Etanolo, acetato, H , CO e lattato da termofili e produttori cellulasi

 2 2

Weizmann era un chimico russo che era scappato in Svizzera, poi fu preso

dall’università di Manchester. Durante la prima guerra mondiale l’Inghilterra

necessitava della produzione di acetone come precursore dell’esplosivo

trinitrotoluene. Weizmann isolò i clostridi. Dal 1945 inizia la sintesi molto competitiva

dei derivati del petrolio. Nel 1975 ci fu una crisi energetica che ha portato a rivalutare

la via fermentativa perché sia l’acetone che il butanolo vengono prodotti a basso

costo. Weizmann è anche il primo presidente di Israele.

Utilizzi:

Butanolo -> gomma sintetica, solvente vernici, grassi, recentemente come

 biofuel alternativo all’etanolo

Acetone -> solvente oli, grassi, resine, plastica

 Prodotti fermentativi indesiderati: isopropanolo, acido acetico, acido butirrico,

 acido acetoacetico ed etanolo, CO e H

2 2

Biochimica del processo

I clostridi arrivano al piruvato tramite via glicolitica normale. Il piruvato è il pool da cui

vengono prodotti lattato, etanolo, mentre nei clostridi il piruvato diventa acetil_CoA,

non avviene con la piruvato deidrogenasi classica! Ma avviene tramite piruvato

ferrodossina (accettore finale di elettroni nella catena di trasporto degli elettroni)

ossideruttasi: decarbossila il piruvato, è un complesso enzimatico particolare che

+

scarica gli elettroni sull’H , come sotto prodotto di questa reazione si forma CO . È uno

2

dei punti biologici in cui si produce idrogeno molecolare, forma di energia pulita.

46

Questo non è uno step fermentativo perché gli elettroni non vengono scaricati su un

composto organico, ma su un composto inorganico. Il piruvato diventa acetil_CoA,

cosa succede quando si ha acetato attivato? Si converte il legame ad alta

energia in fosfato produce ATP da ADP (è una via possibile, non è detto che la faccia,

Clostridium).

dipende dal bilancio energetico ossidoriduttivo del Quindi da acetil_CoA

43-

diventa acetil_P che viene convertito in acetato cedendo il P0 all’ADP che va a

formare ADP. Oppure acetil_CoA si condensa con un’altra molecola di acetil_CoA e si

va a formare acetoacetil_CoA (acetoacetato attivato) e da qui inizia la produzione di

diversi composti. I Clostridi acetogenici producono buttirato, acetato e a volte etanolo;

i Clostridi solventogenici producono acetone e isopropanolo. Nei Clostridi acetogenici

l’acetoacetil_CoA accetta potere riducente e si riduce a β-idrossibutirril_CoA, con NADH

+ +

+ H -> NAD . Poi si ha la disidratazione e diventa crotonil_CoA, questo accetta potere

riducente e si riduce in butirril_CoA. Quest’ultimo cede CoA all’acetato per farlo

diventare acetil_CoA e si produce butirrato. L’acetil_CoA prodotto produrrà ATP. I

Clostridi seguono questa via perché così scaricano potere riducente e producono ATP.

Un po’ di Clostridi da acetil_CoA possono produrre etanolo, partendo da acetato e non

da piruvato.

Per produrre acetone c’è un complesso enzimatico che prende l’acetoacetil_CoA

scarica il CoA sull’acetil_CoA che andrà a formare ATP, si forma acetoacetato. Questo

viene decarbossilato (perché quando non è attivato con il CoA che lo stabilizza va

incontro a decarbossilazione quasi spontaneamente) e diventa acetone. L’acetone può

accettare potere riducente e si fa a formare isopropanolo. Se abbiamo un ceppo che

produce propanolo si identifica l’enzima, il gene e si fa un knockout genetico, per

togliere questa reazione.

Per produrre butanolo, quando si ha la formazione di butirril_CoA da crotonil_CoA, il

butirril_CoA accetta potere riducente con la fuoriuscita di CoA e con la produzione di

butirraladeide. Anche quest’ultimo accetta potere riducente e va a formare butanolo

(da gruppo acido diventa aldeide e diventa alcol).

Sostanzialmente ci sono nei solventogenici 4 enzimi: due che convertono

acetoacetil_CoA in acetone e due che riducono il butirril_CoA in butanolo. Quando si

produce acetone si produce sempre etanolo. Gli acetogenici sanno fare solo gli acidi.

Non si riesce dai Clostridi solventogenici a produrre un solo prodotto, questi a seconda

della condizioni utilizzano le varie vie per produrre ATP e scaricare potere riducente.

Clostridium acetonbutylicum

Problema di degenerazione del ceppo: il perdeva la

capacità di produrre solventi! Per mantenere la capacità solventogenica dovevano

ripartire dalla spore e ridurre al massimo i passaggi di precoltura e bisogna lavorare

molto bene sul pH della soluzione, perché la variazione del pH riduce la capacità di

produrre solventi. Qual è la spiegazione molecolare di questa degenerazione?

Clostridium acetonbutylicum ha un grosso plasmide e su questo ci sono i geni per la

solventogenesi, infatti questo plasmide si chiama Sol. Quindi perché si perdono i geni

per la solventogenesi? Perché il plasmide si può riprodurre più velocemente rispetto al

Clostridium e quindi perde la sua capacità. Per mantenere il plasmidi si cerca di

modulare il pH.

Cosa succede nella fermentazione acetobutilica? Viene sempre seguito il pH. Si

C.

parte da un pH quasi neutro e scende verso 5 poi leggermente risale. Nel

acetonbutylicum, la prima fase di fermentazione è la fermentazione acetogenica, nelle

prime 20 ore quindi si ha la produzione di acetato e butirrato, il pH scende poi deve

47

innescarsi la solventogenesi e questo è legato al valore di pH. Si innesca la

solventogenesi l’acetato viene recuperato in parte, il butirrato viene recuperato e

convertito in butanolo. Si producono acetone ed etanolo.

Come avviene la fermentazione?

Si conservano le spore in sabbia o in terra e possono vivere anche per 30 anni.

Terreni di fermentazione

C < 6%, i Clostridi non sono carbonio tolleranti -> mosti di cereali (patata, riso,

 grano) con aggiunta di azoto organico. Melassa con aggiunta di corn steep

liquor; sottoprodotti della lavorazione del legno, siero di latte e Sali acidi

organici.

N organico

 Fattori di crescita -> biotina, p-amminobenzoico, aspartico, etc

 CaCO -> tampone a pH acidi, ma non bisogna tamponare troppo se no non si

 3

innesca la solventogenesi

Quali sono le limitazioni del processo fermentativo per la produzione di

butanolo?

Bassa concentrazione finale di butanolo, tossico a 12-13 g/l

 Bassa selettività del processo verso il butanolo ovvero troppi altri prodotti:

 etanolo, acetone, acido acetico e acido butirrico

Bassa produttività del processo batch ma difficoltà ad usare sistemi in continuo

 a causa del fenomeno di degenerazione del ceppo

Costi troppo elevati di recupero del prodotto

Impianti industriali per la produzione di acetone e butanolo

C. acetonbutylicum 3

in reattori anaerobi da 90 m , temperatura 34-25°C, pH iniziale

5.8-6.0, circa 36 ore, leggere agitazione con Co , processo batch. Terreno fermentativo

2

a base di melassa con addizione di corn steep liquor. Basso inoculo, molti passaggi. I

solventi vengono recuperati attraverso un processo di distillazione e frazionamento in

continuo. Recentemente gas stripping è preferito, gorgogliando CO . CO viene

2 2

convertita a CO liquida o ghiaccio secco. Rischio di contaminazione da lattici e fagi.

2

Rese da un fermentatore di 90 m 3

Prodotto % di conversione dello Quantità prodotta (kg)

zucchero fermentabile

ABE (Acetone, Butanolo, 6:3:1 1053, 526, 175

Etanolo)

CO 50 2900

2

H 2 117

2

Geni per la solventogenesi ad, ctfA, ctfB, adc)

I 4 geni per la produzione di acetone e butanolo ( sono su un

plasmide circolare di 192-200kb. Mutanti degenerati hanno perso il plasmide e

possono essere complementari da un plasmide vettore degli stessi geni. I geni sono

solR

organizzati in un operone controllato dal codificante una proteine repressore della

solR

trascrizione. Mutante ricombinante con inattivato produce 240 mM butanolo e

SolR

140 mM acetone (superamento soglia butanolo 160-180 mM). è un mutante alto

48

produttore, ma questo comporta un’elevata concentrazione di butanolo che è tossico;

quindi servono dei mutanti resistenza al butanolo.

Miglioramento dei ceppi

Selezione resistenti ad acetone e soprattutto a butanolo (tossico a 13 g/l).

 Mutante per mutagenesi chimica resistente a 19 g/l

Selezione resistenti a fagi

Ingegneria metabolica

Stabilizzazione del plasmide PSOL1, integrazione multicopia dei geni per la

 solventogenesi sul cromosoma, inattivazione repressore, inattivazione vie

metaboliche ramificate

Inibizione dell’enzima idrogenasi: flusso metabolico anticipato vero la

 solventogenesi. E. coli.

Trasferimento geni ed espressione in

Miglioramento del processo

Passando dalla fermentazione batch alla fermentazione in continuo e semicontinuo

con rimozione continua del butanolo. In natura esistono dei Clostridi che sono

solventogenici e che hanno i geni della solventogenesi già nel cromosoma.

Batteri

Zymomonas mobilis Glucosio, fruttosio, saccarosio

Clostridium thermocellum Glucosio, cellobiosio, cellulosa

C. thermohydrosulfuricum Glucosio, xilosio, saccarosio, cellobiosio,

amido

Thermoanaerobium brockii Glucosio, saccarosio, cellobiosio

Thermobacteroides acetoethylicus Glucosio, saccarosio, cellobiosio

Saccharomyces, Zymomonas mobilis, Zymomonas anaerobica hanno la piruvato

decarbossilasi poi ad opera dell’alcol deidrogenasi producono etanolo. I clostridi,

batteri lattici, enterobatteri non hanno la piruvato decarbossilasi, l’acetil_CoA è

l’ultimo precursore per la formazione di etanolo.

Vantaggi dei Clostridi

Producono cellulasi, amilasi

 Possono essere termofili

Svantaggi

 Producono troppi prodotti tipo acidi organici ed altri alcoli, questo rende

complesso e costoso il recupero del prodotto

 Bassa tolleranza ad etanolo

ACIDI ORGANICI

Dal punto di vista metabolico si passa ad una categoria diversa, si parla di prodotti di

ossidazione incompleta. Questi sono processi in aerobiosi, se un microrganismo

secerne un acido organico che può essere l’acido acetico/acido citrico/aminoacido, il

49

glucosio non viene completamente ossidato perché se no non avremmo l’accumulo di

questi prodotti. Per il microrganismo si parla di perdita metabolica, perché non si ha

l’utilizzo di questi composti per le vie anaboliche. Produzioni molto limitate, ma con

controlli genetici sui microrganismi si va ad alterare il loro metabolismo per evitare

questa perdita metabolica. Devono essere secreti perché altrimenti nella cellula

verrebbero o catabolizzati o anabolizzati, invece devono essere “buttati fuori” perché

siamo noi che li utilizziamo. I microrganismi sono tutti aerobi e il potere riducente

viene trasferito all’ossigeno, quindi respirano; in questa catena si sottrae un composto

organico -> danno dal punto di vista metabolico. I più importanti:

Gluconobacter, Acetobacter

Acido acetico,

 Aspergillus niger

Acido citrico,

 Corynebacterium glutammicum

Acido glutammico,

ACIDO ACETICO CH -COOH

3

Dove serve?

Industria chimica (gomme, plastiche, fibre, coloranti, insetticidi, materiale

 fotografico)

Industria farmaceutica

 Industria alimentare

Vogliamo un processo che produce solo acido acetico per renderlo competitivo con la

produzione chimica, quindi le fermentazioni anaerobie non sono adeguate perché sono

eterofermentanti.

Gluconobacter Acetobacter

Batteri acetici: e

Gram negativi, acido tolleranti, bastoncelli, flagellati

 Aerobi obbligati che crescono sulla superficie di piante e frutti

 Gluconobacter oxidans trasforma etanolo in acido acetico e non ha ciclo di

 Krebs completo, spesso questo acetato non può essere introdotto nel ciclo di

Krebs e ulteriormente ossidato quindi viene rilasciato nel mezzo; sa fare la

glicolisi ma quando arriva ad acetato non sa andare oltre

Acetobacter aceti, A. pasteurianus, A. peroxidans trasformano etanolo in acido

 acetico che possono poi convertire a CO e H O attraverso il ciclo di Krebs

2 2

Gluconobacter), Acetobacter

(overoxidizers = rispetto a ma non ha la glicolisi

quindi non sa utilizzare glucosio

Acetobacter

Hanno una catena respiratoria particolare: etanolo (substrato del metabolismo) viene

ossidato ad acetaldeide, questa viene ossidata ad acido acetico. È un sistema basato

sull’ubichinone che rilascia gli elettroni sulla catena respiratoria e quindi produce ATP.

Le deidrogenasi sembrano essere associate sequenzialmente alla membrana

citoplasmatica e connesse alla catena di trasporto di elettroni. Questi microrganismi

possono attivare il ciclo di Krebs e anche riassorbire acetato e convertirlo in CO e H O.

2 2

In genere non utilizzano glucosio.

Gluconobacter oxidans

Trasforma il glucosio via il ciclo ossidativo dei pentoso fosfati in gliceraldeide 3P, che a

sua volta viene convertita in acido piruvico e poi in acetato, che viene secreto. Oppure

ossida etanolo ad acido acetico o altri polialcoli e zuccheri (ad esempio glucosio in

50

acido gluconico, sorbitolo a sorbosio per la sintesi dell’acido ascorbico) dati come

substrato. Questo microrganismo non ha il ciclo di Krebs completo (manca la succinato

deidrogenasi).

Produzione dell’aceto

Resa: 1 mole di acido acetico da 1 mole di etanolo e 6 ATP in presenza di

concentrazioni non limitanti di ossigeno. Da 1 litro di vino al 12% di etanolo e si ottiene

un litro di acido acetico al 12.4%. Sia etanolo che acido acetico devono essere presenti

nelle giuste concentrazioni: acido acetico viene prodotto al massimo nel 13-14% v/v

nei ceppi selezionati. Inoculo in genere da colture liquide precedenti. Si instaurano

colture miste nella produzione di aceto alimentare. La produzione industriale viene

fatta con un ceppo solo.

Processi e reattori di fermentazione

Processo tradizionale: vasche areate con biofilm superficiale, temperatura 29-35°C o

tini di legno opportunatamente costruiti. Generatore d’aceto: fermentazione in

continuo con l’alcol a goccia. Non è un reattore agitato meccanicamente. C’è un

contenitore all’interno di questo vengono messi truciolati di legno sterilizzati. La

sospensione alcolica si lascia passare, si inietta una sospensione alcolica attraverso

degli iniettori, arriva dall’alto -> l’alcol entra a goccia, bisogna prevedere

l’introduzione di aria, c’è un sistema di raffreddamento perché questo processo crea

calore, c’è anche una camera di raccolta. L’etanolo viene introdotto, l’acido acetico

viene rimosso, se non si ha la conversione totale la sospensione viene riproposta ai

microrganismi da convertire definitivamente se no si toglie tutto e si rimette altro

alcol. Durante questa conversione si genera comunque ATP quindi la biomassa

continua ad aumentare e a favorire la conversione. Pian piano la conversione va

all’equilibro. Qual è il limite? Non si possono fare volumi troppo grossi perché

bisogna mettere l’aria che deve areare tutto e si ci sono dei punti di anaerobiosi non si

ha la conversione, elemento fondamentale = ossigenazione. Altro elemento

fondamentale = bisogna regolare il substrato.

Processo semicontinuo industriale: in reattori areati e agitati meccanicamente di

3

acciaio (fino a 50 m ) a 40°C: controllo automatico della concentrazione di acido

acetico ed etanolo e rimozione 50-60% del volume quando etanolo scende sotto soglia

frings:

critica del 0.05-0.3%. Acetatore fermentazione sommersa col metodo a bolle.

Recupero acido acetico per filtrazione e rimozione biomassa. In alcuni casi viene

decolorato con sali di ferrocianuro. Agitazione meccanica, c’è una grossa serpentina

che serve per il raffreddamento perché si genera molto calore e i batteri sono molto

sensibili al calore, oltre alla camicia c’è anche la serpentina, l’acqua deve essere

mantenuta a 30°C. ci sono valvole di regolazione dell’areazione, c’è un antischiuma.

Viene introdotto l’etanolo in blocco e si toglie il prodotto, l’acido acetico. Tolto l’acido

acetico si riaggiunge un altro blocco di etanolo, è un semicontinuo.

ACIDO CITRICO

Produzione storica, iniziata dai grossi complessi farmaceutici negli Stati Uniti alle fino

dell’800. OH

HOOC-CH -C-CH -COOH

2 2

COOH 51

60% per industria alimentare come conservante e acidulante

 10% per industria farmaceutica e cosmetica come anticoagulante, veicolante

 metalli e conservante

25% per industria chimica come antischiuma, trattamento tessuti

 Nei detergenti come sostitutivo polifosfati

 Come metallo citrato nell’industria dei metalli (chelante metalli)

Produzione

1893 si scopre che è prodotto da fughi filamentosi quali aspergilli e penicilli

 Aspergillus niger

1917 Currie scoprì che produce grandi quantità di acido citrico

 in eccesso di glucosio e carenza di azoto e fosforo e a pH acido. Si crea uno

stress metabolico, perché? Perché c’è tanto carbonio ma non ci sono

abbastanza fosforo e azoto per convertire il carbonio.

1923 prima applicazione fermentativa in coltura statica

 1930 prima fermentazione in coltura sommersa

 Oggi 99% della produzione mondiale avviene per via microbica

Produttori industriali

Aspergillus niger

Mutanti di a partire da melasse. Resistenti ad alte

 concentrazione di glucosio, ad analoghi del glucosio (il microrganismo viene

ingannato e viene deregolato da repressione da catabolita), a pH acidi (perché

si produce tanto acido), ad inibitori della catena respiratoria, a fluoracetato.

Selezione fenotipica: selezione per un fenotipo, ovvero la resistenza a glucosio;

la maggior parte dei ceppi industriali è stata prodotta con questa mutazione.

Antimetaboliti: composti che mimano l’azione del composto principale che sono

tossici. Cellule mutate che non sentono più il glucosio non sentono più neanche

il metabolita.

Yarrowia lipolytica

Lieviti quali a partire da paraffine

 Aspergillus niger

Ciclo di Krebs di è stato studiato molto, ha delle reazioni

anaplerotiche molto potenziate: piruvato convertito in ossalacetato grazie alla piruvato

carbossilasi. Nell’idiofase (fase stazionaria), attività della citrato sintetasi aumenta di

10 volte, mentre si riduce quella dell’aconitasi e dell’isocitrato deidrogenasi. Si riduce

l’attività dell’α-chetoglutarato deidrogenasi. Il citrato inibisce la fosfofruttochinasi

mentre la deficienza di ioni manganese e ferro, l’eccesso di ioni ammonio

antagonizzano l’inibizione della PFK (per aumentare l’efficienza). Lavorando in assenza

di manganese e ferro in eccesso di ammonio e pH molto bassi riusciamo ad avere

delle rese stazionarie di crescita fino al 94%.

Biosintesi dell’acido citrico

Metabolita primaria prodotto nella idiofase in condizioni di stress: alte concentrazioni

di glucosio (100-250 g/l), pH minore di 2.8, concentrazione subottimali di ferro e di

manganese nei confronti della crescita ed ottimale di magnesio e zinco (cofattori che

servono anche per la citrato sintasi), areazione alta e costante. In queste condizioni,

funzionano la glicolisi, il ciclo di Krebs e le reazioni anaplerotiche che riforniscono di

ossalacetato. Su alcani o acetato, si attiva il ciclo del gliossilato (altro modo per

rifornire di ossalacetato) con induzione della isocitrato liasi e malato sintetasi represse

dal glucosio.

Fattori critici 52

Fonte di carbonio e sua concentrazione, deve essere molto elevata per poter

 permettere la produzione di acido citrico, ma bisogna anche fare attenzione

perché se ci sono concentrazioni molto elevate si produce fruttosio 2,6 difosfato

che è un attivatore di fosfofruttochinasi

Presenza metalli in tracce

 pH

Regolazione

Una presenza di alte concentrazioni di glucosio (> 50 g/l) si produce fruttosio 2,6

difosfato che è un potente attivatore di fosfofruttochinasi. Le concentrazioni di

manganese di 2 μg/l inibiscono la produzione. Le concentrazioni di ferro di 200 μg/l

Aspergillus

inibiscono la produzione. A pH > 4 si accumula acido gluconico. L’ è un

eucariota quindi il ciclo di Krebs è compartimentalizzato nel mitocondrio, quindi una

volta prodotto il citrato questo deve uscire dal mitocondrio e dalle cellule; ci sono dei

sistemi di secrezione per quando l’acido citrico è in eccesso.

Time corse della produzione di acido citrico in presenza di melasse: tempo sull’asse

delle X e vari parametri sull’asse delle Y. La crescita è abbastanza lenta, è un

microrganismo filamentoso. Durante la fase lag il saccarosio viene idrolizzato; si

accumulano nel mezzo glucosio e fruttosio che vengono mangiati dal microrganismo.

Si può vedere una curva diauxica della fase di crescita del mycelium. L’acido gluconico

è sempre un sotto prodotto di questa fermentazione e per evitare la produzione di

questo acido bisogna lavorare a pH molto acidi.

Terreni di coltura

C: melasse pre-trattate con ferrocianuro per rimuovere ioni, amido, sciroppi di

 saccarosio, glucosio ad alta concentrazione

N: ammonio

 pH di circa 2 favorisce l’accumulo di acido citrico e il mantenimento della

 sterilità in coltura

Bisogna fare attenzione all’acqua che potrebbe contenere sali minerali

 indesiderati, uno dei punti critici di questa fermentazione è la presenza di sali,

composti che inibiscono l’accumulo di acido citrico.

Processi industriali

Inoculo da spore la cui concentrazione è critica

 Fermentazione in superficie in stato solido su vassoi contenenti polpa di patate

 o granaglie addizionate ad amilasi, a 28-30°C per 5-8 giorni (Koji process)

Fermentazione in superficie in stato liquido sempre su vassoi con melasse

 addizionate di vari sali a 30°C sotto ventilazione: dopo circa 30 ore di trofofase

a pH 4.4-5, pH scende intorno a 2-3 ed incomincia l’idiofase e produzione di

acido. Il processo dura 8-12 giorni

Fermentazione in coltura sommersa in reattori air-lift o agitati meccanicamente

 3 3

da 120-220 m al 20-25% di ossigeno. Può arrivare a 18 kg/m al giorno e il

processo dura 3-4 giorni. In alcuni processi fed-batch con ioni ammonio

Centrifuga o filtro rotativo per eliminare micelio e precipitazione a pH 7 a 70-

 90°C in presenza di calcio, il sale precipita (si separa dal liquido) e si risospende

in soluzione acidificata, si passa su carbone attivo e scambiatore di ioni e poi si

fa cristallizzare. Processo abbastanza semplice di downstream.

Punti critici (microrganismo) 53

Instabilità del ceppo

 Concentrazione e morfologia dell’inoculo

 Morfologia della coltura produttiva (piccoli pellets di diametro massimo di 0.1-

 0.2 mm di diametro), i pellets troppo grandi impediscono che arrivi l’ossigeno in

tutto il pellet

Regime di ossigeno costante, diventa problematico man mano che il

 microrganismo cresce, si creano situazioni locali di stress da ossigeno

Sensibilità ai metalli

 Produzione di prodotti collaterali tipo gluconato in condizioni di pH superiore a 4

Le ulteriori attività che vengono fatte per migliorare la produzione di acido citrico

sono: Lo studio delle interazioni glicolisi e ciclo di Krebs e la sua regolazione, continua

 regolazione e miglioramento delle vie anaplerotiche

La costruzione di ceppi di lievito ingegnerizzati per produrre acido citrico,

 E. coli

sistemi eterologhi per l’ingegnerizzazione sono i più studiati: lievito e

Produzione di altri acidi organici

A. niger

Itaconico da

 Rhizopus nigricans

Fumarico da

 A. ventii

Malico da

 A. niger

Succinico da

 A. oryzae

Kojico da

 A. ventii

Gallico da

Produzione di D-gluconato

87.000 tonnellate per anno. La produzione di acido citrico è una delle più antiche,

quindi il problema della produzione di gluconato c’è fin dall’inizio. Ma il gluconato

serve a qualcosa? È un modo per produrre un mercato del gluconato, adesso viene

utilizzato come additivo alimentare, nell’industria tessile e della carta e in medicina.

A. niger in presenza di alte concentrazioni di ossigeno e di glucosio ossida il glucosio a

Gluconobacter suboxydans.

gluconato. Produce anche lattonasi. Prodotto anche da Il

gluconato viene recuperato tramite precipitazione di calcio gluconato a freddo e per

A. niger

aggiunta di acido solforico o per scambio ionico dal sodio gluconato. ossida il

glucosio a gluconolattone, scaricando gli elettroni sul FAD il quale a sua volta scarica

gli elettroni sull’O che diventa H O ; reazione catalizzata dalla glucosio ossidasi.

2 2 2

Successivamente il gluconolattone si apre, tramite una reazione spontanea o reazione

catalizzata dalla lattonasi, si ha l’idratazione e si ottiene acido gluconico. La glucosio

ossidasi è in questo caso extracellulare e si inattiva a pH inferiori a 4. Si aggiunge

calcio carbonato alla fermentazione o NaOH per mantenere alto il pH e si forma calcio

o sodio gluconato. La glucosio ossidasi è una flavoproteina che trasferisce gli elettroni

all’ossigeno producendo H O che poi viene scissa dalla catalasi in H O e O .

2 2 2 2

Produzione fermentativa

Per produrre gluconato si utilizzano concentrazioni molto elevate di glucosio,

 120-150 g/l

Quantità limitanti di azoto e fosforo

 30-35°C pH 6.5 mantenuto con aggiunta di calcio carbonato o idrossido di sodio

 Reattore agitato meccanicamente e ossigenato

 54

ACIDO GLUTAMMICO

La produzione di aminoacidi è una produzione estremamente importante per il settore

fermentativo, è un mercato molto in crescita. L’acido glutammico è un insipidente, è il

maggior componente ad esempio dei dadi.

Industria alimentare (60%): aromi (glutammato monosodico), antiossidanti (L-

 triptofano) e dolcificanti (aspartame: L-aspartil-L-fenilalanina metil estere)

Additivi alimentari (31%): animali hanno bisogno di aminoacidi essenziali quali

 lisina, metionina, triptofano, leucina, isoleucina, valina, arginina, treonina e

fenilalanina. Le piante sono abbastanza carenti di lisina, metionina e triptofano

e treonina

Integratori di medicine di infusioni (4%)

 Industria cosmetica e chimica

 Precursori di pesticidi ed insetticidi

Questi aminoacidi vengono prodotti per via biologica e poi vengono condensati tra di

loro per via chimica. Qual è il vantaggio della produzione con la via biologica? È

una via enantioselettiva, produce l’aminoacido L, mentre utilizzando la via chimica

classica si producono i racemi. È un problema! Problema evidenziato dalla storia

dell’acido glutammico: se prodotto in via L è insipidente, se prodotto in forma D non fa

niente. La sintesi chimica non è specifica.

Metodi di produzione

Estrazione da idrolizzati di proteine, ad esempio L-cisteina. Metodo molto

 impegnativo, con rese molto basse e costi elevati

Sintesi chimica, ad esempio glicina o metionina racema. La glicina è l’unico

 aminoacido che non ha un centro chirale, quindi si può produrre in forma L o in

forma D

Trasformazione biologica di substrati poco costosi, ad esempio L-serina da

 glicina. Conversioni con cellule ed enzimi immobilizzati, ad esempio acilasi,

racemasi, L-idantoinasi. Vengono utilizzati catalizzatori enzimatici o cellule che

contengono questi catalizzatori. Questo è il processo di competizione della

fermentazione

Fermentazione, il microrganismo over-produce l’aminoacido

L’acido glutammico è l’acido maggiormente prodotto al mondo in forma L.

Da dove vengono gli aminoacidi? Tutti gli aminoacidi vengono sintetizzati dai

precursori che si formano durante le vie cataboliche. Ad esempio l’acido glutammico

viene prodotto da un intermedio del ciclo di Krebs, l’α-chetoglutarato. L’aspartato

viene prodotto dall’ossalacetato. La lisina proviene dall’aspartato insieme ad altri

aminoacidi che derivano da esso. Il triptofano deriva dalla via dei pentoso fosfati,

serve un eritrosio (4C) che va a formare il gruppo degli aminoacidi aromatici.

Monosodio L-glutammato (MSG)

1908: monosodio L-glutammato scoperto in Giappone da Ikeda, prodotto da idrolisi

delle proteine e per vie chimica come racemo (isomero D non ha gusto). 1957:

isolamento di un batterio in grado di secernere L-glutammato, inizio della produzione

fermentativa di molti aminoacidi. 1970: produzione per via fermentativa anche di

nucleotidi come esaltatori di sapidità. 55

Corynebacterium glutammicum

Gram positivo

 (actinomycetales)

Alto contenuto GC

 Non miceliare

 Asporigeno

 Aerobio

 Produttore industriale di aminoacidi e nucleotidi

 Isolo da suolo durante uno screening in terreno minerale. Secerne L-glutammato

 in assenza di biotina, in condizioni di stress quindi

Ceppi per L-glutammato Actinomcyetales: Corynebacterium,

Altre specie appartenenti a generi dell’ordine

Brevibacterium, Arthobacter, Microbacterium. Gram positivi, asporigeni, immobili,

richiedono biotina e hanno basso o nulla attività della α-chetoglutarato deidrogenasi,

mentre hanno alta attività della glutammato deidrogenasi. Attualmente si usano

Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum

mutanti di e con bassa attività

della isocitrato liasi e mutanti che producono e secernono L-glutammato anche in

presenza di biotina e possono quindi usare substrati come melasse.

C. glutammicum

L’enzima α-chetoglutarato deidrogenasi è ridotto nel e questo ha

capacità di fare forti vie anaplerotiche del ciclo di Krebs. I batteri classici hanno una

C. glutammicum

via sola per formare ossalacetato: ha la piruvato deidrogenasi e

piruvato carbossilasi e PEP carbossilasi (quindi lui ne ha 3 di vie anaplerotiche),

B.subtilis E. coli

ha piruvato carbossilasi, ha PEP carbossilasi. Perché questo

microrganismo accumula glutammato? Perché ha poca disponibilità di azoto

quindi appena riesce accumula ammonio. La via del glutammato è una delle vie che

tutti i batteri usano per accumulare NH in composti organici. Solo che tutti i batteri lo

3 E. coli

sanno fare, ma non si trovano mai in questa situazione perché ad esempio ad

che vive nell’intestino arrivano già aminoacidi fatti. Mentre quelli presenti nel terreno,

nei suoli devono accumulare sotto forma di NH .

3

Caratteristiche: bassa attività dell’α-chetoglutarato deidrogenasi, quindi ha potenziato

le vie anaplerotiche ovvero quelle catalizzate dalla PEP carbossilasi e dalla piruvato

carbossilasi.

Attiva anche il ciclo del gliossilato, serve per assimilare l’acetato, in questo batterio

funziona il ciclo anche se la fonte di carbonio non è acido acetico. È un ciclo

deregolato. In più ha l’enzima malico quindi da piruvato si può produrre malato.

Reazione da α-chetoglutarato a glutammato

L’α-chetoglutarato (5C, 2 gruppi acidi, un chetone in α rispetto a uno dei due gruppi

acidi) va incontro ad una amminazione riduttiva e diventa un α-aminoacido ad opera

4+

dalla glutammato deidrogenasi che introduce NH e utilizza potere riducente, NADPH

+

-> NADP . Il glutammato va incontro ad una ammidazione catalizzata dalla

glutammina sintetasi che utilizza ATP e si ottiene la glutammina. Il gruppo ammonio

portato da glutammina e glutammato può entrare nel ciclo degli aminoacidi.

Gli interventi che si fanno sul microrganismo dal punto di vista genetico e del processo

sono dovuti al fatto che vogliamo che la reazione si formi alla produzione di acido

glutammico e che non vada oltre fino alla glutammina. Come si interviene? Facendo

un feeding di ammonio, concentrazioni che servono per produrre glutammato senza

56

dare quelle concentrazioni di ammonio che servirebbero per produrre la glutammina.

La sorgente di ammonio è uno di quei composti che va regolato durante la produzione

di aminoacido. Perché non possiamo fare il knockout della glutammina

sintetasi? Perché è un enzima essenziale, deve essere comunque prodotta!

Permeabilità delle cellule e secrezione glutammato

I microrganismi che producono acido glutammico in assenza di biotina hanno le

membrane scompensate e questo permette una permeabilità tale che man mano che

si produce glutammato queste lo buttano fuori.

Deficienza di biotina, coenzima essenziale per la sintesi dell’acido oleico

 componente dei fosfolipidi

Deficienza di acido oleico in auxotrofi per acido oleico, microrganismi con

 mutazioni che non sanno produrre acido oleico

Deficienza di glicerolo in auxotrofi per il glicerolo

 Addizione di acidi grassi saturi (C16-C18) o di loro derivati, sistema di

 saturazione della biosintesi, vanno a saturare la formazione dei trigliceridi della

membrana, competono con l’acido oleico

Addizioni di penicillina o di anestetici locali

Terreni di fermentazione

Per produrre acido glutammico hanno bisogno di una fonte di carbonio (acetato,

glucosio, fruttosio, melasse e idrolizzati di amido). Se utilizziamo melasse, vanno presi

mutanti o condizioni di fermentazione che permettano la presenza di biotina. Si fa un

feeding di ammoniaca gassosa o sciolta in acqua. L’ammoniaca deve entrare nella

reazione. Va ben dosata, perché se si dà troppa ammoniaca abbiamo la presenza di un

altro gruppo di NH e produce glutammina. Quando introduciamo ammoniaca l’NH

3 3

+

prende un H dal mezzo e ha un effetto di riduzione di acidità del mezzo (effetto

tamponante). Possiamo usare urea, però i condizioni di pH acido e ammonio in

eccesso si forma la glutammina. Vengono aggiunti fattori di crescita come biotina

(essenziale per la crescita ma negativa per la produzione di acido glutammico),

cisteina e tiamina. Ossigeno importane, perché la fermentazione è aerobica. Sotto la

concentrazione critica di ossigeno, si producono prodotti collaterali come lattato e

succinato, al di sopra della concentrazione critica si accumula alfa – chetoglutarato.

Grafico: lieve Lag dovuto al fatto che il primo α – chetoglutarato è dovuto al ciclo di

Krebs.

La produttività volumetrica arriva fino ai 150 g/L.

3

Si usano fermentatori fino a 500 m . Processo fed-batch. 16 h di vegetativo e 6% di

inoculo in produttivo a base di melasse. pH tra 7-8. Temperatura sui 30°C. Si controlla

la CO nei gas di scarico, glutammato e feeding di glucosio. Fermentazione fermata

2

dopo 40-60 ore. Biomassa eliminata e sale di ammonio passato su resina a scambio

ionico da cui viene recuperato. L’ammonio può essere riciclato per distillazione per

essere addizionato ad altre fermentazioni.

Fermentatore agitato meccanicamente. Fermentatore di inoculo ha via di inoculo che

inocula il fermentatore di produzione. Esce aria esausta sulla quale viene fatta analisi

di CO . Il brodo esce e va verso un reattore di Hardest. Nutrienti sterilizzati con

2

sistema di sterilizzazione in continuo. Antischiuma con sterilizzatore in batch.

Zucchero in tank dove viene sterilizzato in continuo, arriva ad un buffer tank.

Ammonio introdotto tramite sistema di introduzione dell’aria. 57

Produzione su diversi substrati e con diversi ceppi: processo classico fatto con melasse

C. glutamicum.

da barbabietola e il microrganismo è Vi sono generi affini nell’ordine

Attinomycetales

degli e sono attinomiceti filamentosi e non filamentosi e nemmeno

sporigeni (tutti sanno produrre acido glutammico usando diversi substrati, come

alcani, acido benzoico, metanolo, etc.). Si usano sotto prodotti chimici (tossici e

contaminanti) per produrre qualcosa di utile. Le rese possono essere più basse, ma

questi processi possono avere una loro applicazione all’interno del concetto di

decontaminazione e bioraffineria.

L – LISINA

Amminoacido basico. Aa essenziale usato principalmente come additivo alimentare

degli animali. Non sappiamo produrre lisina per cui la assimiliamo con la dieta.

Utilizzata nell’industria farmaceutica e cosmetica. Secondo aa prodotto al mondo.

C. glutammicum

È ad essere usato per produrre la L – Lisina. Gli auxotrofi di questo

microrganismo sono usati per produrre diversi aa. Per produrre bene un aa, già nelle

prime fasi di sviluppo, ci si è resi conto che si poteva lavorare con gli auxotrofi. Se

C. glutammicum

voglio produrre un aa, cercherò di fare auxotrofi per aa competitivi. Il

è stato usato per produrre, lisina, valina, fenilalanina, tirosina e triptofano.

E. Coli.

Microrganismo meno regolato per la produzione di aa, rispetto ad esempio a

Inizialmente hanno fatto selezioni di auxotrofi. Perché si aumenta la produzione di

aa facendo auxotrofi per altri aa? La sintesi di un aa aromatico deriva da

condensazione di eritrosio e intermedio di metabolismo primario (PEP).

Se dal metabolismo primario abbiamo una condensazione che va verso 3 vie che

portano alla produzione di 3 aa diversi, ma ne blocco due -> potenzio la sintesi di aa

che compete con aa in cui introduco mutanti. Quindi il microrganismo per esempio non

sintetizza più Phe e Tyr e quindi il flusso va verso la produzione di triptofano.

I tre aa aromatici (fenilalanina, tirosina, triptofano) derivano da trioso (intermedio di

glicolisi) e tetroso (da via dei pentoso fosfati) -> 4 + 3 si uniscono a formare Shikimate

(C7). Se introduce Phe e Tyr il flusso va verso la produzione di triptofano.

Per quanto riguarda la lisina, questa arriva da intermedio a 7 carboni (DAP). È un aa a

6 atomi di carbonio e due gruppi amminici. Viene da diaminopimelico (aa non

proteogenico), molto importante perché nei batteri va a finire nella parete cellulare. Il

piruvato (a 3 C) si condensa con aspartato (4C) e va a formare la lisina. Quindi i due

precursori sono piruvato e aspartato. Aspartato arriva da amminazione di ossalacetato

(intermedio del ciclo di Krebs). Aspartato è precursore anche di metionina, treonina e

isoleucina. Se voglio che tutto l’aspartato vada a formare lisina, farò degli auxotrofi per

la metionina e per la treonina.

Se faccio auxotrofi per questo gruppo di aa, devo fornire questi aa al mutante,

altrimenti non cresce.

L’omoserina è un intermedio metabolico che sta alla radice della produzione di

composti amminoacidici.

Mutanti introdotti facendo mutagenesi e selezione, ora per fare un auxotrofo faccio un

knock out genico. Di cosa ho bisogno per fare intervento di ingegneria? Sequenza di

biosintesi, enzimi coinvolti nella biosintesi, sequenza di geni di biosintesi e avere

vettore per introduzione di cassetta o alterazione di una base per alterare il gene e

produrre un auxotrofo.

Mutagenesi e selezione: introduco danno genetico e seleziono fenotipo auxotrofo. Il

fenotipo che sto cercando crescerà in un terreno in cui sono presenti tutti gli aa, ma

non crescerà su terreno in cui manca l’aa per il quale presenta l’auxotrofia. Lo

seleziono per confronto con mutanti che crescono sulla piastra ricca. Laddove non c’è

la colonia e dovrebbe esserci vuol dire che è un auxotrofo -> replica plating. Gli

approcci di strain improvement sono stati selezione di auxotrofi, mutanti resistenti

58

ad antimetabolita, fusione di protoplasti con ceppo parentale per riacquistare vigore e

variazioni di dosaggio genico per ricombinazione genetica.

Aspartato subisce una serie di reazioni che producono un intermedio da cui derivano

metionina, isoleucina e treonina. Si condensa con piruvato, seguono una serie di

reazioni fino alla formazione di lisina (SAPERE FORMULA LISINA).

Regolazione di produzione di L-Lisina e L-Treonina

in C. glutammicum E. coli.

Nel caso della lisina, produzione e Nel primo i circuiti di

regolazione sono più semplici, per cui questo microrganismo è deregolato rispetto a E.

coli. Non è propriamente deregolato, ma è cresciuto così. Naturalmente ha evoluto

E. coli,

meno sistemi di regolazione della sintesi di aa. Non ha la regolazione di molto

C. glutammicum

più complicata. Questo rendo un buon microrganismo per la

produzione industriale di aa. È naturalmente deregolato perché E. Coli cresce

nell’intestino e le proteine sono già digerite dalle proteasi, quindi gli arrivano degli aa

già pronti. Se arriva Phe interrompe la biosintesi di quell’aa, ma ovviamente gli aa gli

arrivano in base a ciò che mangiamo, quini interrompe quella biosintesi ma non la

biosintesi di altri aa. È per questo che ha evoluto un sistema di regolazione molto fine

C. glutammicum

e complicato. deve aspettare attività proteolitica, sa fissare ammonio,

quindi tutta la regolazione di Coli non gli serve.

Sintesi di lisina

Regolazione nella produzione di aa: feedback inibition -> prodotto finale inibisce la sua

biosintesi. Avviene a due livelli: prodotto finale può inibire attività di enzima all’inizio

della biosintesi o può inibire la trascrizione di operone. Quando ho aa e non voglio

sintetizzarne più, il prodotto finale inibisce enzima all’inizio della biosintesi o inibisce la

trascrizione di geni che formano operone biosintetico.

Da acido aspartico, abbiamo chinasi che lo fosforila, abbiamo enzima che lo trasforma

in un aldeide aspartico. Secondo enzima che porta l’aldeide a omoserina, che diventa

isoleucina oppure metionina.

Enzimi principali: quello che fosforila l’aspartato e quello che forma l’omoserina. Se

trovano auxotrofo di omoserina, non si verrebbero a formare isoleucina, metionina e

treonina.

C. glutammicum

In ci sono due regolazioni: inibizione enzimatica da prodotto finale e

repressione di espressione. La lisina, sul primo enzima della biosintesi, lo inibisce a

livello allosterico. Man mano che si produce lisina, interagisce con enzima, lo modifica

e blocca la sua attività. Sullo stesso enzima agisce la treonina, che si accumula e lo

inibisce, ma inibisce anche il secondo enzima, perché ha eccesso di treonina ma non

di lisina. Inibizione parziale di sintesi di lisina, e totale di treonina. La metionina

inibisce la trascrizione del gene. Inibizione allosterica è immediata, quella genica è più

lenta, ma una volta attuata funziona.

In E. Coli la regolazione è molto complessa. La lisina quando si accumula fa tre cose

diverse: inibisce il primo enzima, inibisce la trascrizione del gene e inibisce anche

enzima che sta a livello della sua ramificazione. La metionina inibisce anche il primo

enzima della reazione. L’isoleucina si inibisce. La treonina inibisce il primo e il secondo

enzima. C’è un terzo livello di regolazione: presenza di isozimi. Ulteriore modulazione.

Coli ha 3 aspartato chinasi che rispondono a regolazioni di aa in modo diverso. Quindi

se non funziona una funziona l’altra, ma magari con velocità diversa e in condizioni

diverse di nutrienti. E ha due enzimi a livello dell’omoserina deidrogenasi. Se faccio

auxotrofo per omoserina ho il vantaggio di rimuovere i circuiti regolatori. Il concetto

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95

PESO

1.08 MB

AUTORE

elaisa9

PUBBLICATO

6 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biotecnologie molecolari e industriali
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher elaisa9 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biotecnologia delle fermentazioni e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Insubria Como Varese - Uninsubria o del prof Marinelli Flavia.

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