Biotecnologie delle Fermentazioni

BIOTECNOLOGIE DELLE FERMENTAZIONI

Libri: microbiologia industriale, biotecnology, biologia dei microrganismi (Brock).

Bisogna sapere le formule, tutte.

I microbi sono estremamente utili nella vita dell’uomo, utilizzati per scoprire nuovi beni

e servizi. Biotecnologie: usare conoscenze scientifiche per risolvere problemi.

Applicare le proprie conoscenze per risolvere un problema umano, animale o vegetale

a seconda dell’applicazioni (differenza biologia vs biotecnologia).

PARTE GENERALE

Microbiologia industriale e fermentazioni

Tecnologie molto antiche. Origine di queste tecniche? Di tipo alimentare, si

producevano degli alimenti sfruttando dei processi di fermentazione o di microbiologia.

Qual è la differenza tra pratica e scienza? È la conoscenza. Questa scienza è nata

alla fine dell’800. Il padre dell’applicazione è Pasteur, scienziato che inizia a capire che

dietro questi processi c’è qualcosa che bisogna comprendere. Cosa succede intorno

alla fine dell’800 nel mondo occidentale? La rivoluzione industriale; processo

fondamentale per le produzioni a livello industriale. Cosa succede in quegli anni?

Prima Guerra Mondiale, durante questa i processi fermentativi diventano fondamentali

per produrre i composti chimici, per produrre solventi chimici che servono per fare

esplosivi, la benzina. I processi fermentativi servono per produrre acetone, metanolo,

Convertire biomasse in prodotti chimici

butanolo, glicerolo. : ad esempio etanolo che fa

andare le macchine o biodiesel. Si usano i microbi per risolvere i problemi. Cosa

succede durante la Seconda Guerra Mondiale? Scoperta della penicillina! Nel

1928 Fleming scopre la penicillina il cui ruolo diventa fondamentale nella Seconda

Guerra Mondiale in quanto è diventata un’arma dell’asse anglo-americano per

sostenere i costi umani della guerra. Penicillina chiamata anche: proiettile magico,

perché era un’arma in più con cui hanno vinto la guerra. Inibisce i batteri, ma non fa

male all’uomo. Dalla penicillina si ha l’inizio delle biotecnologie farmaceutiche, si

capisce che i microbi possono produrre sostanze utili nell’industria farmaceutica.

Nasce da qui il periodo di scoperta di altri farmaci, di tutte le classi chimiche degli

antibiotici e inizia l’industria fermentativa; poi si inizia a capire che i microrganismi

possono produrre non solo gli antibiotici, ma anche altri farmaci quali ad esempio

antibatterici, antitumorali, vitamine, steroidi. 1980 scoperta, grazie a tutta la

tecnologia del DNA ricombinante, di utilizzare i microbi per produrre proteine umane,

proteine terapeutiche, vaccini, anticorpi. Nel secolo scorso per la produzione di

insulina si estraeva questa dal pancreas di bovini e suini, problemi: rigetto/allergia,

problema di malattie/infezioni dall’animale, procedura costosa. Gli americani iniziarono

a produrre insulina umana tramite le tecniche ricombinanti, in sistema controllato,

quindi si ha un farmaco veramente per tutti e molto pulito e controllato. L’insulina

prodotta oggi non è più l’insulina umana perché uno dei problemi dell’insulina è che ha

un picco e poi crolla, quella prodotta adesso è modificata ed è più stabile nel circolo

ematico. Come si produce l’insulina umana in E. Coli? Con un processo

fermentativo. Prima della scoperta di Pasteur i microrganismi furono visti per la prima

volta grazie al costruttore del microscopio, scoprì le lenti per il microscopio e disegnò i

lieviti. Pasteur ha coniato la parola “enzima”.

Produzione della birra 1

La produzione della birra avviene a partire dall’orzo, in alcuni paesi si utilizzano anche

il riso e il mais. Questi cereali, a differenza dell’uva, non contengono zuccheri

fermentabili ma solo amido. L’amido deve essere saccarificato, scisso cioè in maltosio

e glucosio che saranno poi fermentati. Tale scissione avviene grazie ad un enzima:

l’amilasi. Fortunatamente l’amilasi è presente negli stessi semi di orzo quando

germinano, quindi i semi vengono umidificati, lasciati germinare ed infine essiccati per

essere immagazzinati e lavorati successivamente. Questo orzo germinato secco si

chiama malto. La birra viene fatta dal malto, che cos’è il malto? Il malto è orzo

germinato, granaglie germinate; perché servono per fare la birra? Cosa succede

durante la germinazione dei semi? Perché il lievito non sa degradare i

polisaccaridi, quindi necessita di mono- o disaccaridi, se no non potrebbe crescere.

Come sono fatti i semi di orzo? Carboidrati, amido che viene saccarificato ovvero

scisso in maltosio e glucosio che saranno poi fermentati. Quando il seme germina

produce delle amilasi che iniziano a degradare l’amido e rendono disponibili gli

Saccharomyces

zuccheri semplici e solo allora riesce a produrre l’alcol. Se non si

Saccharomyces

rompe l’acino d’uva non riesce ad entrare in contatto con gli zuccheri;

quindi vanno rotti meccanicamente. Quando si vuole produrre alcol da biomasse/rifiuti

bisogna dare a questi degli zuccheri liberi.

La produzione del pane

Farina impastata con acqua e lievito, con eventuale aggiunta di zucchero per far

partire la fermentazione, fornisce l’amido per i lieviti; la CO prodotta, restando

2

imprigionata nell’impasto, ne causa il rigonfiamento e conferisce al pane la sua

caratteristica sofficità. I lieviti per la panificazione appartengono alla specie

Saccharomyces cerevisiae e derivano storicamente dai ceppi utilizzati in birreria.

Attualmente il lievito viene prodotto in modo industriale per soddisfare le accresciute

esigenze di panificazione.

La produzione di formaggi, burro e yogurt

Si basa sull’utilizzo di batteri lattici. Formaggi: coagulazione delle proteine del latte e

successiva maturazione per i formaggi semi-stagionati e stagionati. La coagulazione

avviene grazie ad un enzima, la rennina, estratto dallo stomaco dei vitelli, che caglia

il latte. La cagliata è sottoposta poi a maturazione in centinaia di modi differenti che

consentono di produrre i diversi formaggi. Il siero è ad alto impatto contaminante: dato

ai maiali o convertito in altri processi fermentativi. Il formaggio poi subisce una serie di

trasformazioni. La rennina veniva presa dallo stomaco dei vitelli, ormai viene fatta con

DNA ricombinante. È una procedura che garantisce una qualità migliore.

Concetto di sterilità

Lavorare con popolazioni microbiche non contaminate da altri microrganismi. All’inizio

la sterilità veniva assicurata dallo stesso etanolo, la produzione di acido lattico si

autodifende da altri microrganismi. L’acido lattico dello yogurt impedisce la

contaminazione da altri microrganismi, in quanto può risultare un po’ tossico nei

confronti degli altri batteri/funghi. Successivamente si lavora in sterilità forzata, dopo

che è stato introdotto il concetto farmaceutico. Si parla di sterilità assoluta dalla

penicillina in poi.

La produzione di acido citrico

Come veniva fatta alla fine dell’800? Tramite estratti di limoni o bergamotti. Poi si

è scoperto che l’acido citrico poteva essere estratto da un fungo (1900). L’acido citrico

2

è un antiossidante, viene utilizzato come conservante, utilizzato anche nelle creme e

nell’industria farmaceutica (antiossidante, stabilizzante). La fermentazione dal fungo

iniziò nel 1930, si passò dalla coltura statica alla coltura sommersa; sommergendo si

ha un’elevata produzione di acido citrico.

Penicillina

Apre la via all’industria farmaceutica. Gli inglesi iniziarono a produrre la penicillina,

trasformazione del concetto del vassoio: strato di agar, sopra il fungo, poi si estraeva

fungo e terreno e si otteneva la penicillina. Nei rifugi anti-bombardamento c’erano

degli scaffali con bottiglie piatte in cui si inoculava il fungo. Problema del supply

(rifornimento): problema del rifornire. Inglesi non riuscivano a produrre dosi sufficienti,

quindi fecero un accordo con gli americani. Gli americani avevano le industrie

chimiche con la coltura sommersa, quindi si utilizzò questa tecnica per produrre la

penicillina in dosi massicce. Crescita ad alta densità.

Classico reattore agitato meccanicamente, agita il brodo di fermentazione di coltura

ad alta densità cellulare in coltura liquida. La coltura sommersa è sterile. Con lo

sviluppo degli antibiotici si è sviluppata la regolazione sia per farmaci di sintesi che

Golden age

farmaci naturali (per questi è fondamentale la sterilità). : scoperta degli

antibiotici e sviluppo delle biotecnologie farmaceutica: penicillina, streptomicina,

clorotetraciclina, ossitetraciclina, eritromicina, tetraciclina, non solo antibiotici, ma

anche immunosoppressori, antitumorali, statine, insetticidi (river blind).

Produzione di enzimi industriali

Nel 1894 produzione del primo enzima industriale ad uso farmaceutico -> amilasi,

enzima che degrada l’amido, per aiutare le diete con problemi di intolleranza o

digestione, introdotta per favorire consumo di carboidrati nella dieta umana. 1915

primo impiego di proteasi nei detergenti, ora si utilizzano anche le lipasi. 1965 uso

della rennina nei processi di caseificazione. 1967 uso della glucosio isomerasi per

la produzione di fruttosio, molto usata nell’industria alimentare perché scinde il

saccarosio. Saccarosio: glucosio + fruttosio. La scissione del saccarosio dà il fruttosio

che è più dolce. Dagli anni ’70-80 lipasi, proteasi, etc nei detergenti.

Reattori

Scala di studio -> per i laboratori. Scala pilota -> reattori grandi. Scala di produzione

-> molto più elevata. Per produrre antibiotici, enzimi, etanolo, queste sono le scale:

studio – pilota – produzione. Sempre reattori agitati meccanicamente, hanno un grado

di complessità variabile. 3

Prodotti Volume in m

Proteine da DNA ricombinante 0.5-50

Lievito panificazione, birra, etc 100-250

Aminoacidi 100-250

Antibiotici 80-200

Enzimi industriali 80-250

Evoluzione nell’ultimo secolo con le tecnologie del DNA ricombinante: non solo hanno

permesso di scoprire nuovi prodotti e hanno permesso di rivedere i prodotti precedenti

con un’altra ottica. I prodotti sono stati ottimizzati grazie alle tecnologie ricombinanti.

Elenco dei primi prodotti approvati dalla FDA (organo regolatorio per il mercato

farmaceutico e cibo, autorità maggiormente riconosciuta in America): insulina umana,

3

ormone umano della crescita, α-interferone, primo vaccino ricombinante, tPA-

attivatore del plasminogeno, eritropoietina, G-CSF fattore stimolazione granulociti.

Vaccino ricombinante molto importante è quello contro l’epatite B.

Oggi le biotecnologie hanno un impatto significativo in vari settori produttivi:

Biotecnologie rosse, medicina e farmaceutica tramite nuove metodologie

 diagnostiche e farmaci proteici;

Biotecnologie verdi, miglioramento delle coltivazioni più diffuse, piante

 transgeniche, per produrre bioenergia;

Biotecnologie bianche, ambito industriale per produrre processi più

 economici, meno inquinanti ad esempio per produrre le bioplastiche, sostituire

processi chimici tradizionali con produzioni di tipo biotecnologico. Biotecnologie

bianche producono anche biofuels e biogas.

Fermentazione

Pasteur: vita senza aria, metabolismo anaerobio, prodotti del metabolismo anaerobio

(etanolo, acido lattico, acetone e butanolo). Le ossidoriduzione scaricano gli elettroni

su un intermedio metabolico, processo di fermentazione in senso stretto. In un

contesto industriale il termine si riferisce a processi microbici su larga scala eseguiti in

condizioni sia aerobie che anaerobie. Dalla penicillina in poi vengono chiamati processi

fermentativi tutti quei processi che utilizzano i fermentatori. Nella respirazione

l’accettore finale degli elettroni è l’ossigeno.

Tipologia di processi:

Prodotto biomassa del microrganismo, esempio bisogna produrre il lievito c’è

 un’industria fermentativa che ha come scopo la produzione della cellula di

lievito;

Prodotto è la bioconversione (la cellula serve come catalizzatore) di una cellula

 tramite un substrato, ad esempio conversione degli steroidi;

Prodotto che interessa non è la cellula, ma è un prodotto della cellula -> alcol,

 enzimi, antibiotici, additivi del cibo, acidi.

Microrganismi industriali

Specialisti metabolici in grado di generare uno o più prodotti con rese molto alte e in

colture su larga scala. Derivano dall’ambiente naturale in cui vivono in comunità con

altri microrganismi, ma sono stati mutati e manipolati geneticamente e sono molto

diversi dai ceppi “selvaggi” (wild type = isolato originale) da cui derivano. Sono

conservati in collezioni private (difficili accedervi perché sono “proprietà” delle

industrie e servono per abbattere il costo di produzione di un prodotto) e pubbliche

(conservano in genere i wild type) e sono spesso brevettati. Con il miglioramento dei

microrganismi industriali si parla di addizione di qualità.

Caratteristiche ideali di un microrganismo industriale:

Dotato di metabolismo desiderato

 Facilmente coltivabile in terreni poco costosi e su larga scala

 Alte rese

 Geneticamente manipolabile

 Non patogeno

 4

Microrganismi: qualcosa che non si vede e infatti necessitiamo di un microscopio per

vederli. I microrganismi sono: alghe (eucariota), protozoi (eucariota), funghi

(eucariota), batteri (procariota), Archea (procariota), virus (acellulare). Noi parleremo

di produzioni da funghi e da batteri. Alghe e Archea sono importanti dal punto di vista

delle biotecnologie.

La diversità microbica è del tutto sconosciuta! La biomassa della terra è costituita per

il 60% da biomassa microbica. Meno dell’1% delle specie microbiche è stato

identificato e coltivato.

Diversità batterica: circa 3000-4000 specie di batteri sono stati descritti, ma si

 stima che ne siano presenti da 30000 a 3000000.

Diversità virale: 500 tipi di virus descritti su circa 5000 stimati.

 Diversità dei funghi: circa 72000 funghi sono conservati nelle collezioni e un

 totale di 150000 sono stati descritti. Si stima che siano esistenti 1.5 milioni di

specie.

Protozoi: dei circa 100000-20000 esistenti 40000 sono stati descritti.



Valore della diversità microbica

Comprensione delle strategie e limiti della vita

 Ruolo dei microrganismi nei cicli dei nutrienti e negli ecosistemi

 Indice per monitorare e predire i cambiamenti climatici

 Ruolo nella conservazione e mantenimento degli organismi superiori (dalla

 simbiosi alla patogenicità)

Comunità microbica come modello di interazioni biologiche e storia evolutiva

 Riserva di geni, nuovi prodotti, nuove proteine

 Perché ci interessano i microbi? Perché danno possibilità nelle

 biotecnologie? Perché l’evoluzione dei microbi è stata di adattarsi a tutte le

condizioni di vita, l’evoluzione dei macrorganismi è stata diverse, è stata

crescere in complessità strutturale (tessuti, strutture, molto richiedenti dal

punto di vista energetico). I microbi rimangono piccoli, possono vivere in

condizioni in cui l’energia è pressoché zero, possono vivere in siccità, possono

vivere in condizioni di quiescenza. Varietà substrati organici e inorganici e

condizioni fisiche di vita (diversità fisiologica microbica):

Temperatura da 0°C a 100°C

 pH da < 1 a > 11

 Concentrazione ionica variabile (acque dolci e acque salate)

 Condizioni aerobiche e anaerobiche

 Varietà di substrati organici e inorganici



Prodotti e processi microbici

Biomassa (SCP)

 Prodotti del metabolismo anaerobio (etanolo, acido lattico, acetone e butanolo)

 Prodotti di ossidazioni incomplete (aceto)

 Metaboliti primari (aminoacidi, nucleosidi)

 Metaboliti secondari (antibiotici, antivirali, antitumorali, erbicidi, pigmenti)

 Enzimi (macromolecole)

 Proteine (macromolecole)

 Vaccini polisaccaridi (macromolecole)

 Acidi grassi (macromolecole)

 Bioconversioni e biocatalisi (enzimi e cellule)

 5

Diversità metabolica microbica

Alghe e alcuni gruppi batterici utilizzano energia solare (FOTOSINTETICI) e fissano la

CO (NUTRIZIONE AUTOTROFA), fotoautotrofi come le piante. Funghi e molti batteri

2

e quasi tutti gli archea utilizzano energia chimica (CHEMIOTROFI) e utilizzano

composti organici come fonte di C (NUTRIZIONE ETEROTROFA O

ORGANOTROFICA), chemioeterotrofi come gli animali. Tipo di metabolismo: da dove

si prende energia, da dove il carbonio e dove vengono scaricati gli elettroni.

Gli animali prendono energia dall’ossidazione di composti organici; prendono il

carbonio, ossigeno e idrogeno dall’ossidazione dei composti organici. Per produrre

energia si fa il cosiddetto catabolismo delle sostanze organiche. Il catabolismo riduce

la complessità biochimica, da questo processo fuoriescono degli intermedi che servono

per l’anabolismo. Modello animale: energia da energia chimica da ossidazione dei

substrati inorganici. Dove si scaricano gli elettroni? Nei chemioeterotrofi gli

elettroni finiscono quasi tutti all’ossigeno tranne nel caso dell’acido lattico nei tessuti;

per periodi intermedi gli elettroni finiscono sul piruvato. Metabolismo chemioeterotrofo

può essere respiratorio, ma anche fermentativo. Da dove prendono energia le

piante? Dalla luce, sono foto. Da dove prendono gli scheletri del carbonio?

Fissano la CO . I microrganismi possono combinare le varie tipologie! Non sono ci sono

2

i chemioeterotrofi (come le cellule del cervello umane chemioeterotrofe obbligate o del

tessuto muscolare chemioeterotrofi fermentanti) ci sono anche i fotoautotrofi, ma

possono essere anche combinati. Un microrganismo può prendere energia dalla luce e