Biotecnologie delle Fermentazioni

X/S

Dove S è il substrato limitante la crescita. Moltiplicando 1/X (ovvero normalizzando per

il valore della biomassa) si ottiene: dX/dt 1/X = Y dS/dt 1/X e quindi μ = Y q . Dove

X/S X/S S

q rappresenta la velocità specifica di consumo del substrato limitante: la velocità con

S

cui i microrganismi crescono dipende dalla velocità di consumo del substrato limitante

e dalla efficienza di conversione del substrato in biomassa.

relazione tra e concentrazione iniziale di S:

Quindi si ha una μ

La μ dipende dal microrganismo, dalla temperatura, dal pH e dalla composizione

 del brodo

Quando le condizioni sono costanti, μ è in funzione della concentrazione iniziale

 del substrato limitante e raggiunge un valore massimo μ (velocità di crescita

MAX

specifica massima)

Il modello matematico che descrive la relazione tra μ e S è l’equazione di Monod



Equazione di Monod

La μ = μ S / (K + S) dove μ = velocità di crescita specifica massima, S =

MAX S MAX

concentrazione substrato limitante, K = concentrazione del substrato a cui μ = 0.5

s

μ quando S è molto alto, μ tende verso μ . Se S è molto grande il rapporto tende

MAX MAX

ad 1 quindi in condizioni non imitanti μ tende a μ (valore soglia di saturazione). K è

MAX S

una costante di affinità, il microrganismo è più affine al glucosio rispetto al lattosio.

Una volta che sono state definite alcune costanti si può predire la curva di crescita, si

passa da modello descrittivo a modello predittivo e si valuta facendo esperimenti.

Resa (Yield) di conversione del substrato in biomassa e prodotto 26

Il coefficiente di resa cellulare (yield: Y ) è espresso come g di biomassa per g di

X/S

nutrienti consumati,

Y = Δx/ΔS. Il coefficiente di resa di prodotto (Y ) è espresso come g di prodotto per

X/S P/S

g di nutrienti consumati Y = ΔP/ΔS.

P/S

La resa dà la conversione del substrato nel prodotto.

Parametri quantitativi

Resa (YIELD): quantità di prodotto ottenuto dal substrato.

Velocità di crescita e produzione: parametri cinetici calcolati considerando il tempo.

Possiamo misurare la velocità di consumo del substrato e la formazione dei prodotti

per unità di volume (produttività volumetrica) o normalizzare per la biomassa

(produttività specifica).

SUBSTRATO -> REAZIONI INTRACELLULARI -> PRODOTTI + BIOMASSA

Tempo -> cinetica, cinetica di crescita, collegata alla μ, poi Ks, etc. Resa -> etanolo

rispetto al glucosio, resa del 10% utilizzo al 90% glucosio, resa di crescita e resa di

produzione. Produttività volumetrica: quanto prodotto ho alla fine della fermentazione,

quantità di prodotto per unità di volume, normalizzo il valore di produttività

volumetrica per la biomassa -> divido la produttività del prodotto per la quantità di

produttività specifica

cellule in un litro e ottengo la che dice che una certa quantità di

cellule produce una certa quantità di prodotto. Ma a cosa servono la produttività

volumetrica e quella specifica? Interessano per il recupero del prodotto; se

aumenta la produttività volumetrica facendo delle modificazioni, si passa da 80 g/L a

100 g/L, in seguito a manipolazioni, mi interessa sapere se queste manipolazioni

hanno portato a cambiare la capacità delle cellule di produrre o se hanno portato ad

un accrescimento delle cellule. La produttività specifica è decisamente aumentata se

ho la stessa quantità di cellule. Se invece ho prodotto più cellule ho reso il processo

capace di produrre più cellule per unità di volume, ho aumentato la resa della

E. coli

biomassa. Perché si vuole far crescere ad alta densità per produrre

proteine ricombinanti? Perché se aumento il numero di cellule per unità di volume

aumento anche la produttività volumetrica. Se ingegnerizzo E. coli rendendolo in

grado di produrre di più vado ad aumentare la produttività specifica di E. coli. Ma

E. coli

aumentando la produttività specifica di si diminuisce la produttività volumetrica

perché in queste determinate condizioni non cresce.

È possibile collegare la resa sul substrato (di crescita) -> dX/dt = Y dS/dt dove S è il

X/S

substrato limitante la crescita. Moltiplicando 1/X (ovvero normalizzando per il valore

della biomassa) si ottiene

dX/dt 1/X = Y dS/dt 1/X e μ = Y q dove q rappresenta la velocità specifica di

X/S X/S S S

consumo del substrato limitante: la velocità con cui i microrganismi crescono dipende

dalla velocità di consumo del substrato limitante e dalla efficienza di conversione del

substrato in biomassa.

Relazione cinetica tra crescita e formazione del prodotto dipende dal ruolo

del prodotto nel metabolismo cellulare

I prodotti hanno diversa cinetica che dipende dal loro ruolo nel metabolismo del

microrganismo. Se il prodotto è la biomassa -> la velocità di crescita e le rese

corrispondono, perché nel grafico abbiamo sull’asse y la [X] che corrisponde al

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prodotto, quindi Y = Y . Il 50% del glucosio che do va a finire nella biomassa, l’altro

X/S P/S

50% viene ossidato. Questa è la cinetica più semplice perché cinetica e produzione

corrispondono. Se nel mentre misuro il glucosio vedo che man mano che viene

utilizzato cresce la biomassa.

Altri due casi di cinetica e di produzione:

Quando [X] non è uguale a [P], si hanno due curve diverse, si ha una cinetica di

 produzione associata alla crescita, perché l’andamento è analogo, il

microrganismo man mano che produce biomassa produce anche il prodotto;

classica dei prodotti del metabolismo energetico e dei prodotti del metabolismo

primario. I metaboliti primari: prodotti dal catabolismo (etanolo) o normali

intermediari (amminoacidi), biosintesi dei metaboliti primari durante la crescita

esponenziale. Perché vengono fatti l’etanolo o acido lattico? Perché il

microrganismo deve scaricare potere riducente per ricavare potere ossidante

per la glicolisi.

Quando si ha un antibiotico o un metabolita secondario, la cinetica di

 produzione è sempre non associata alla crescita; in genere la produzione inizia

quando il microrganismo entra in fase stazionaria, quindi quando la μ tende a

diventare costante il microrganismo inizia a produrre. È propria del metabolismo

secondario, dei metaboliti secondari, biosintesi del prodotto durante la

crescita stazionaria.

L’acido citrico che è un metabolita primario si accumula alla fine della fase

esponenziale e durante la fase stazionaria di crescita.

Andamento della fermentazione: 3 curve -> cellula, prodotto, substrato. C’è un

andamento simile tra crescita e produzione, serve una costante per mettere in

relazione velocità di crescita e velocità di produzione; se invece le due curve hanno un

andamento diverso la storia si complica.

Produzione del metabolita primario

dP/dt = Y dX/dt dove Y è il coefficiente di resa prodotto/biomassa riportato come g

P/X P/X

di prodotto per g di biomassa. Moltiplicando per 1/X si ottiene dP/dt 1/X = Y dX/dt 1/X

P/X

e abbiamo q = Y μ che è la produttività specifica. Dove q rappresenta la velocità

P P/X P

specifica di formazione del prodotto (misurata come g di prodotto per g di biomassa

nell’unità di tempo). Moltiplicando per la biomassa totale si ottiene la produttività

volumetrica (g di prodotto per volume nell’unità di tempo). R = q X

P

Produzione di prodotti parzialmente correlati con la crescita

dP/dt = α dX/dt + β X dove α e β sono costanti dipendenti dal processo.

FED-BATCH

Un processo di fed-batch è un processo batch basato sull’aggiunta (feeding) del

substrato limitante la crescita (zuccheri, precursori) alla coltura. La strategia fed-batch

è tipicamente usata in processi bio-industriali per raggiungere un’elevata densità

cellulare nel bioreattore. La soluzione da aggiungere è altamente concentrata per

evitare la diluizione del bioreattore. L’aggiunta controllata del nutriente influenza

direttamente la velocità di crescita della coltura. Il feeding viene introdotto in genere

quando il substrato iniziale è quasi totalmente consumato. Il volume della coltura e la

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composizione del terreno cambiano durante la fermentazione. I nutrienti si aggiungono

esattamente quando se ne ha bisogno perché non è possibile aumentare di molto il

volume. Il fed-batch viene fatto quando il microrganismo tende ad entrare nell’ultima

fase della crescita esponenziale e tende ad entrare nella fase stazionaria. Facendo ciò

il microrganismo continua a crescere, non entra in fase stazionaria, ma la crescita con

cui procede è una crescita in cui la μ è diversa. La pendenza della fase di crescita

successiva è sempre ridotta rispetto alla μ che è diversa tra una fase e l’altra. Come

viene fatto un feeding fatto bene? Quando si dà il feeding (mL/min) bisogna darlo

molto concentrato per evitare che la curva cambi. Ma perché il glucosio rimane

costante nel mezzo anche se gliene aggiungo? Perché un buon feeding è quando

faccio consumare al microrganismo minuto per minuto tutto il glucosio che aggiungo,

perché lo posso fare? Perché si ha una biomassa che è arrivata al massimo, sfrutto

il fatto che la biomassa vitale è cresciuta già nel batch, ho una biomassa vitale

importante. Bisogna controllare dall’esterno quanto cresce il microrganismo, bisogna

controllare entro certi parametri fissi quanto glucosio dare e controllare momento per

momento. Ovviamente ci sono dei limiti di concentrazioni da dare al microrganismo.

Per la crescita il substrato limitante può essere il glucosio, per la produzione il

substrato limitante può essere l’azoto, se aggiungo nello stesso modo l’azoto anche la

curva di produzione varia come quando aggiungo glucosio che va a variare la curva di

crescita. Si dà un po’ di zucchero per mantenere la crescita cellulare, si dà azoto per

promuovere la produzione dei prodotti, come ad esempio per produrre gli

amminoacidi. (Feeding per produrre aa).

Vantaggi:

Prolungata fase di crescita e/o produzione

 Si evita repressione ad catabolita e problemi osmotici dovuti ad alte

 concentrazioni di zuccheri -> se si aumenta tanto il glucosio nel tempo zero si

incappa nel problema della pressione osmotica. Quando il glucosio diventa

molto concentrato si ritorna nella condizione del miele ad ese