Biologia molecolare 2

RNA.

È molto interessante notare che l’aggiunta della coda di poli-A indica che la degradazione degli mRNA nei

procarioti e negli archea e quella nucleare degli eucarioti sono processi evolutivamente correlati. Ciò

indicherebbe che evolutivamente la poliadenilazione è nata nell’ambito della degradazione dei trascritti ma

negli eucarioti la presenza di comparti cellulari separati ha permesso di utilizzare la poliadenilazione per un

processo opposto di stabilizzazione dei trascritti nel citoplasma.

Non è comunque chiaro come TRAMP sia in grado di riconoscere la grande varietà di trascritti aberranti su

cui agisce, esso riconosce trascritti prodotti da ognuna delle tre RNA pol.. Dato che il numero di possibili

difetti di produzione degli RNA sono moltissimi, si pensa che il modello di funzionamento sia quello in cui i

substrati aberranti riconosciuti sono quelli che non riescono a formare una RNP in tempi “normali” (quindi

un modello basato sulla cinetica).

Un tipo di substrato identificato sono gli RNA in cui lo splicing è incompleto o errato, essi vengono trattenuti

dallo spliceosoma finchè lo splicing viene completato o finchè non vengono degradati da TRAMP.

La base con cui questi RNA vengono riconosciuti non è nota. Il secondo tipo di substrati che vengono

riconosciuti sono i trascritti non poliadenilati.

Anche i criptic unstable transcripts (CUT) già discussi sono soggetti a degradazione, la loro emivita infatti

è molto breve e la degradazione procede tramite poliadenilazione da parte del complesso TRAMP e

successiva degradazione. La loro emività è così breve che essi sono stati identificati in ceppi di lievito in cui

il macchinario di degradazione nucleare era stato reso inefficiente.

I CUT sono presenti in gran numero, una parte di essi sembra che possano essere prodotti da degli errori di

trascrizione da parte della RNA pol II, mentre altri sembra che possano avere un ruolo regolativo nei

confronti di altri geni o nella struttura della cromatina.

Il controllo di qualità a livello della traduzione degli mRNA viene effettuata da un

sistema di sorveglianza citoplasmatico

Alcuni difetti dell’mRNA possono essere rilevati solamente quando esso viene

tradotto, per questo si sono evoluti tre sistemi di sorveglianza (figura 22.13) che

rilevano eventi anomali di terminazione della traduzione.

Quando un ribosoma raggiunge un sito di terminazione, una coppia di fattori di

rilascio (eRF1 ed eRF2 negli eucarioti) entrano nel sito A del ribosoma mediando il

rilascio del polipeptide, dell’mRNA, del tRNA rimanente e dalle sub-unità del

ribosoma (figure 24.28 e 24.35).

Nonsense-mediated decay NMD (vedi anche quanto detto precedentemente):

Se un mRNA contiene un codone di STOP posizionato più di 50 nt a monte dell’ultima giunzione esone-

esone -oppure un 3’-UTR molto lungo viene degradato dal NMD.

NMD rappresenta, quindi, sia un meccanismo di controllo che di regolazione dell’emivita dei trascritti.

Terminazione ad un sito prematuro determina l’attivazione di un complesso multiproteico che ha come core

la ATP-dependent RNA helicase up frameshift 1 (UPF1), che recluta altre proteine:

1. UPF1 ha attività elicasica e ATPasica e si lega ad UPF2 ed UPF3 formando un complesso.

2. UPF2/3 non sono necessarie per la degradazione di tutti i trascritti.

3. UPF1 ha un’attività di binding aspecifica sull’mRNA e anche su noncoding RNAs.

Nel contesto di un mRNA citoplasmatico maturo, eIF4G e

PABPC si associano rispettivamente con il cap-5′ e con la coda

poli(A), consentendo al trascritto di adottare una conformazione

ad anello chiuso che stimola l'inizio della traduzione e,

presumibilmente, la terminazione.

• La giustapposizione di un codone di terminazione e la

poli-A binding protein previene il NMD.

• Tale vicinanza consente a PABPC di interagire

direttamente con eRF3 e precludere la formazione del

complesso UPF1- eRF3 sul ribosoma terminale (Fig.

1a).

Tuttavia, si è anche dimostrato che l'effetto soppressivo di PABPC sul NMD dipende dalla sua interazione

con il fattore di inizio della traduzione eucariotica 4G (eIF4G) il quale antagonizza NMD quando è

prossimale a un codone di terminazione.

Questi dati supportano un modello in cui la terminazione della traduzione efficiente è generalmente stimolata

e l'NMD viene evaso su mRNA con 3’-UTR brevi (Fig. 1a).

Questo potrebbe anche spiegare perché i codoni di terminazione 3’-prossimali non riescono a innescare un

NMD efficiente.

Al contrario, gli mRNA con 3′-UTR lunghi possono essere presi

di mira da NMD, probabilmente a causa dell'aumento del legame

UPF1 non specifico e perché la distanza spaziale tra il ribosoma

terminale e i terminali dell’mRNA, che sono collegati

dall'interazione PABPC– eIF4G, rende inefficiente la

terminazione della traduzione.

UPF1 potrebbe quindi interagire con eRF3 sul ribosoma terminale

e successivamente reclutare ulteriori fattori NMD (Fig. 1b).

È importante sottolineare che, tuttavia, non tutti i 3’-UTR lunghi attivano NMD probabilmente anche la

composizione, la struttura e le proteine associate della sequenza 3’-UTR contribuiscono al destino degli

mRNA.

NMD è stimolato quando il codone di

terminazione si trova a monte dell’EJC che è

depositato a circa 24 nt a monte della maggior

parte delle giunzioni esone-esone Un EJC

legato a 3′-UTR stimola NMD perché si

associa a UPF3 e UPF2, promuovendo la

formazione del complesso UPF1-UPF2-UPF3

(Fig. 1b).

Si ritiene che gli EJC posizionati all'interno

delle ORF e all'interno dei primi ~30 nt del 3′-

UTR si dissocino come conseguenza del primo

ciclo di traduzione.

Gli EJC, invece, nel 3′-UTR rimangono

attaccati all'mRNA. Pertanto, si prevede che un

codone di terminazione situato a più di 50-55

nt a monte dell'ultima giunzione esone-esone

venga riconosciuto come PTC.

Degradazione dell'mRNA indotta da PTC

Dopo l'associazione di UPF1 con eRF3 sul ribosoma terminale, un complesso proteico si assembla per

attivare NMD. L'ordine degli eventi non è ben stabilito e può differire tra i diversi substrati di mRNA.

Complesso transitorio associato al ribosoma costituito da eRF1- eRF3, UPF1, l'RNA elicasi DEAH box

polipeptide 34 (DHX34) e SMG1C (comprendente il complesso chinasi SMG1 e i suoi regolatori SMG8 e

SMG9). DHX34 dissocia DHX34-UPF1-SMG1C da eRF1-eRF3 associato al ribosoma e facilita invece la

sua associazione con UPF2-UPF3-EJC31 (Fig. 1c).

Ciò causa:

DHX34 dissocia DHX34-UPF1-SMG1C da eRF1-eRF3 associato al ribosoma e facilita invece la sua

o associazione con UPF2-UPF3-EJC31 (Fig. 1c); ciò causa…

Interruzione della traduzione -fosforilazione mediata da SMG1 di UPF1.

o Interruzione di ulteriori eventi di inizio della traduzione.

o Facilita il reclutamento di fattori responsabili della degradazione dell'mRNA.

o

Se si genera un costrutto tale da poter legare una PABP in vicinanza di un sito di stop prematuro, questo

trascritto non viene riconosciuto per la degradazione.

L’importanza del 3’-UTR è testimoniato anche

in Drosophila, in C. elegans e in certi geni di

mammifero in cui il riconoscimento del

prematuro termination codon avviene

indipendentemente dagli exon-junction complex.

Riducendo il livello di Upf1 in mutanti generati

appositamente si è verificato che il livello di

alcuni trascritti aumenta, il che indicherebbe che

alcuni trascritti sono normalmente degradati

tramite questo meccanismo (ad esempio alcuni

trascritti con 3’- UTR molto lunghi, alcuni

mRNA sottoposti a splicing alternativo).

Figure 22.14

Two mechanisms by which a termination codon is recognized as premature. (A) In mammals, the presence of

an Exon Junction Complex downstream of a termination codon targets the mRNA for NMD. (B) In probably

all eukaryotes, an abnormally long 3' UTR is recognized by the distance between the termination codon and

the poly(A)-PABP complex. In either case, the Upf1 protein binds to the terminating ribosome to trigger

decay.

Figure 22.15

Effect of tethering a PABP near to a premature termination codon. A PABP gene was altered to express a

phage RNA-binding domain. Its binding site was engineered into a test NMD substrate gene. The tethered

PABP prevented the usual rapid degradation of this mRNA by NMD. This method has many applications in

molecular biology.

Nonstop decay (NSD) (figura 22.13 al centro): questo meccanismo degrada i trascritti che mancano di un

codone di stop in-frame e nei quali i ribosomi finiscono nel poli-A e quindi entrano in stallo.

È interessante notare che c’è un’elevata percentuale (5-10%) di trascritti poliadenilati prematuramente in siti

criptici di poliadenilazione situati a monte del vero sito di poliadenilazione. Questi substrati vengono gestiti

da delle proteine dette Ski, in particolare Ski7 ha un domino GTPasico simile a quello di eEF3 (eukaryotic

elongation factor 3) e si lega al ribosoma nel sito A per stimolare il rilascio.

Il reclutamento di altre Ski proteins e dell’exosoma agiscono poi per determinare la degradazione 3’-5’. In

altri casi probabilmente le PABP vengono rimosse dal ribosoma e questo determina il successivo decapping e

degradazione 5’-3’.

È interessante notare che in Escherichia coli esiste un meccanismo particolare basato su un RNA non

codificante che riesce a liberare i ribosomi che sono in stallo sui trascritti, agisce sia da tRNA che da mRNA

fornendo un codone di stop che libera i ribosomi e determina la sintesi di un polipeptide che marca la

proteina per la degradazione.

No-go decay (NGD) (figura 22.13 in basso): è un meccanismo identificato per ora solo in lievito. Si è visto

che a livello di alcuni substrati molto difficili (strutture secondarie oppure codoni “rari”) il ribosoma può

entrare in stallo. In questi casi possono intervenire delle proteine che liberano il ribosoma ed inducono un

taglio endonucleasico che causa poi la degradazione da parte dell’exosoma e di Xrn1.

Sembra che la presenza di questi siti “difficili” nei trascritti non sia casuale e sia conservata evolutivamente,

ciò potrebbe indicare che questo rappresenta un mezzo per regolare l’emivita di certi trascritti particolari.

Alcuni mRNA eucariotici sono localizzati in alcune regioni specifiche della cellula

Molti mRNA escono nel citoplasma, diffondono e probabilmente vengono tradotti in proteine in regioni

casuali, il loro prodotto proteico non occupa una posizione specifica nella cellula. Per centinaia di mRNA

invece è stata identificata una regione specifica in cui essi risiedono nel citoplasma, probabilmente questa è

una piccola frazione del totale dei trascritti