Biologia Molecolare parte 2

I fattori basali (proteine) si assemblano formando il complesso di pre-inizio (PIC):

1) TFIID: primo fattore che si lega al promotore, contiene TBP (sufficiente per promuovere la

trascrizione basale in vitro) e TAF (bersaglio di proteine attivatrici che aumentano il livello della

trascrizione).

TBP è una proteine particolare che si lega come una sella sul DNA, interagendo con il solco

minore; è un monomero con un asse di simmetria che divide in due regioni simmetriche e che si

lega alla TATA box piegando il DNA di circa 80°, questa piegatura facilita l’interazione di altri fattori

nella regione del promotore, inoltre permette al DNA del promotore di avvolgersi intorno alla

polimerasi.

2)TFIIA: si lega stabilizzando il complesso TFIIID-DNA ed impedendo il legame di repressori che

potrebbero interferire con la formazione del complesso di pre-inizio.

3)TFIIB: si lega, ha il compito di posizionare precisamente Pol II sul sito di inizio; esso interagisce

con TBP e il DNA, a causa della piegatura, è in grado di interagire con la polimerasi che si associa

al complesso aiutata da TFIIF. TFIIB ha un ruolo importante anche nelle fasi iniziali di sintesi

dell’RNA: quando l’RNA supera i 5/6 nt deve competere con TFIIIB per lo spazio nella cavità con

Pol II, se TFIIB ha la meglio si ha una sintesi abortiva e la trascrizione deve re-iniziare, se invece la

catene crescente riesce a superare i 6 nt TFIIB viene espluso da Pol II che così si può staccare e

può iniziare la fase di allungamento.

La coda C-terminale di Pol II è libera e non modificata, quando si forma il complesso con l’RNA

polimerasi intervengono due fattori:

-TFIIE: recluta TFIIH nel complesso

-TFIIH: formato da diverse subunità, apre il DNA, mediante la sua attività elicasi ATP-indipendente

formando il complessi di trascrizione aperto, fosforila il CTD promuovendo così il distacco di Pol II

dal promotore e permettendo l’inizio della fase di allungamento della trascrizione.

Le modificazioni post-traduzionali della coda di CTD sono anche essenziali per reclutare, nella

fase di allungamento, le varie componenti che permettono la maturazione dell’RNA, come gli

enzimi che formano il cappuccio e l’apparato di splicing.

Formazione del complesso di pre-inizio di Pol II: legame di TFIID, TFIIA, TFIIB poi la polimerasi

viene reclutata sul promtoore insieme a TFIIF, si legano poi TFIIE e TFIIH, che con la sua attività

elicasica apre il DNA formando il complesso aperto. TFIIH fosforila CTD di Pol II, che può staccarsi

e proseguire nella fase di allungamento.

Ruolo degli altri fattori proteici:

i saggi in vitro si possono eseguire usando una serie minima di fattori di trascrizione basale ed il

nucleo purificato della Pol II, tuttavia la stimolazione è a bassi livelli; il DNA è normalmente

impacchettato in nucleosomi e nella cromatina, l’inizio della trascrizione in vivo richiede

l’intervendo di altri fattori proteici quali il complesso mediatore, proteine regolatrici della trascrizione

(attivatori) ed enzimi che rimodellano la cromatina.

Mediatore: formato da 20 subunità, si lega al complesso di inizio trasportando l’RNA polimerasi,

questa è legata direttamente al mediatore che interagisce con il CTD, mascherandolo; il ruolo del

mediatore p di fare da ponte tra gli attivatori legati a monte ed il complesso d’inizio, inoltre alcune

sue subunità possono avere un ruolo nella repressione della trascrizione.

Il mediatore stimola la trascrizione in un sistema purificato, anche in assenza di un attivatori.

mediatore: complesso proteico di grandi dimensioni che funziona come

un ponte molecolare tra gli attivatori della trascrizione e la RNA pol II; è espresso ubiquitariamente

dal lievito ai mammiferi (7 subunità omologhe lievito-uomo), tipico degli eucarioti

il complesso del mediatore aiuta la polimerasi a

legarsi ai promotori attraverso l’interazione con fattori già legati agli elementi vicini al sito d’inizio e

agli enhancer; interazione con TFIID è essenziale per assemblare un complesso attivo, si pensa

che TFIID rimanga legato al promotore per facilitare il successivo assemblaggio di un altro

complesso di trascrizione.

Struttura di Pol II e allungamento:

Pol II è costituita da più subunità che generano una forma a pinza che si apre e chiude sul DNA

inglobandolo in una lunga scanalatura nella struttura dell’oloenzima; la parte superiore della pinza

è più mobile e permette l’ingresso del DNA.

La brusca curvatura che il filamento stampo del DNA subisce, a causa della struttura a muro,

permette di esporre la base non appaiata nel sito attivo, in modo che sia pronta ad appaiarsi con il

nuovo nucleotide che entrerà nel complesso.

L’RNA Pol II riconosce il giusto nucleotide che deve essere aggiunto alla catena attraverso il

dominio proteico Trigger Loop, esso riconoscere e discrimina il nucleotide corretto per evitare errori

di sintesi e promuove la formazione del legame fosfodiestere e l’avanzamento della polimerasi.

Il trigger loop posiziona il nuovo nucleotide nel sito attivo in modo che, se l’appaiamento è corretto,

il nucleotide riesce a posizionarsi correttamente rispetto al 3’OH della molecola di RNA nascente e

al nucleotide complementare nel filamento stampo del DNA.

Il trigger loop promuove l’attacco del nucleofilo rispetto al 3’OH e il distacco del pirofosfato, inoltre

promuove l’avanzamento dell’enzima: dopo che si è formato il legame fosfodiestere, questa

struttura ritorna nella posizione iniziale riformando il sito A vuoto ed interagendo con altri domini

proteici, che connettendo le due subunità grandi della pinza promuovono l’avanzamento

dell’enzima.

Una volta che la polimerasi ha superato la sintesi abortiva e si è staccata dal promotore e dalla

maggior parte dei fattori basali, inizia la fase di allungamento della trascrizione.

Quando la polimerasi ha superato la sintesi abortiva e si è staccata dal promotore e dalla maggior

parte dei fattori di trascrzione, inizia la fase di allungamento della trascrizione (vengono reclutati

diversi fattori tra cui TFIIS e SPT5).

Sono presenti dei fattori di allungamento che permettono alla polimerasi di procedere e superare

eventuali rallentamenti sul DNA come per esempio: il fattore TFIIS

Regolazione: della trascrizione:

- la regolazione della trascrizione è modulata da proteine specifiche dette Fattori di regolazione

-la funziona di molte di queste proteine regolatrici è a sua volta regolata in risposta a stimoli esterni

-questo apparato di attivatori, co-ativatori e repressori permette il controllo della maggior parte

degli mRNA, sia stimolando il livello basale di espressione, sia modificando lo stato della cromatina

Gli elementi distali sono gli Enhancer (amplificatori) contengono molti elementi o sequenze di

riconoscimento alle quali si legano i fattori di trascrizione con funzione attivatrice; quando gli

attivatori si legano all’enhancer si forma l’Enhanceosoma: esso entra in comunicazione con le

regioni prossimali del promotore, attraverso la formazione di un ansa sul DNA allorché gli attivatori

legati all’enhancer interagiscono con il mediatore, che a sua volta richiama Pol II e ne facilita il

legame ai fattori basali di trascrizione.

Regio apparantamente distanti a livelli di sequenza di DNSA, sono in realtà fisicamente vicine a

causa della struttura ad ansa dei cromosomi eucariotici.

Alcune caratteristiche degli enhancer:

- possono funzionare in entrambi dli orientamenti rispesso alla direazione della trascrizione

-possono trovarsi sia a monte che a valle del gene controllato

- possono essere localizzati negli introni dello stesso gene che viene controllato

- hanno sequenze specifiche per gli attivatori trascrizionali

La specificità della trascrizione può essere controllata sia dalla regione del promotore sia

dall’enhancer; in alcuni casi la specificità è data dal promotore e l’enhancer è usato per aumentare

il livello del messaggio prodotto, in altri casi il promotore del gene è attivato solo se anche

l’enhancer è attivato.

Molti fattori di trascrizione con funzion attivatrice si legano agli enhancer, che sono elementi distali

del promotore:

- quando un complesso di attivatori si lega ad un enhancer si ha la formazione dell’Enhancesoma

Silencer: funzionano come gli enhancer legando repressori, invece che attivatori; i repressori

possono mascherare la regione di attivazione agli attivatori o competere con il legame sul

mediatore.

Isolatori: gruppo di elementi di controllo che agiscono in cis sul DNA, sono posizionati in modo da

influenzare l’azione degli enhancer contigui; in alcuni casi sono usati per isolare in una direzione

l’azione di un enhancer che potrebbe influenzare due promotori diversi.

Gli isolatori hanno una doppia funzione: agiscono impedendo l’attivazione o la repressione di un

gene da parte di un enhancer o silencer agiscono come marcatori di confine tra una zona

eterocromatinica ed una eucromatidica. Nel caso della struttura della cromatina, un isolatore

contiene siti di legame per proteine che impediscono il propagarsi e l’espandersi della regioni

eterocromatiniche

.

Struttura modulare e domini dei fattori di trascrizione:

-dominio di legame al DNA (classificazione degli attivatori)

-dominio di connessione (linker)

-dominio di attivazione vero e proprio

-dominio di dimerizzazione

-dominio di legame ai ligandi

-dominio di localizzazione nucleare

-dominio di esportazione nucleare

Ogni dominio si comporta come un modulo separato che funziona in modo indipendente

I fattori di trascrizione possono essere suddivisi in:

-attivatori (positivi)

-repressori (negativi)

Domini funzionali dei trans-attivatori: domini di legame

I fattori trascrizionali sono classificati in base al tipo di dominio di legame:

-le interazioni tra le proteine e il DNA sono dovute principalmente a legami idrogeno e ad

interazioni idrofobiche

-sono stati caratterizzati diversi motivi strutturali:

elica-giro-elica e omeodominio, domionio a dita di zinco, domini a cerniera di leucina, dominio

elica-ansa-elica

Controllo combinatoriale della trascrizione:

Utilizzando un numero limitato di fattori è possibili ottenere un controllo combinatoriale

amplificando il numero di possibilità; le combinazione che si possono avere con diverse sequenze

di riconoscimento e con la dimerizzazione di diversi monomeri, sono molto numerose

Meccanismo di azione degli attivatori e dei repressori:

Nel controllo negativo degli eucarioti esistono molti meccanismi di azione, oltre a quelli visti nei

procarioti:

Nel controllo positivo degli eucarioti si possono identificare tre classi di attivatori:

1)Veri attivaotri, agiscono formando contatti con l’apparato basale sul pr