Biologia Molecolare parte 2

Biologia molecolare: secondo esonero

Trascrizione negli eucarioti

Negli eucarioti ci sono tre diverse RNA polimerasi:

• RNA polimerasi I: Trascrive i geni per l’rRNA (ribosomi), localizzata nel nucleolo.
• RNA polimerasi II: Trascrive i precursori dell’mRNA e miRNA (piccoli RNA implicati nella regolazione post-trascrizionale attraverso il meccanismo dell’interferenza), alcuni snRNA (processano mRNA) localizzata nel nucleoplasma.
• RNA polimerasi III: Trascrive i geni per rRNA 5S, tRNA e piccoli RNA coinvolti nella formazione delle molecole di RNA mature (snRNA U6 per splicing, RNA 7SL parte del complesso SRP); localizzata nel nucleoplasma.

Ogni polimerasi funziona in associazione con fattori specifici che riconoscono elementi in cis sul DNA nella regione del promotore. I promotori di Pol I e Pol III sono semplici, con elementi vicini al sito di inizio della trascrizione, mentre per Pol II il promotore può essere molto esteso e riflette la diversità dei geni trascritti.

Negli eucarioti l’espressione genica è regolata a diversi livelli. Le cellule contengono gli stessi geni e la diversità nella specializzazione è ottenuta attraverso un accurato controllo dell’espressione genica e la regolazione di vari geni. La risposta di ogni cellula a stimoli fisiologici e ambientali richiede un accurato controllo della risposta a questi stimoli.

Meccanismo di trascrizione

Il meccanismo di trascrizione del DNA tra procarioti ed eucarioti è simile, ma negli eucarioti il processo è più complesso a causa delle numerose funzioni e specializzazioni che ogni cellula eucariotica deve poter realizzare:

• Lo stampo è cromatina (modulazione del grado di compattezza della cromatina), essa costituisce un ostacolo per l’RNA polimerasi e per i fattori di trascrizione che devono riconoscere e legarsi a specifiche sequenze di DNA, promotore. L’impacchettamento è fondamentale per rendere inaccessibili o disponibili le sequenze di DNA con cui interagiscono le RNA polimerasi e le proteine regolative che ne influenzano l’attività.
• RNA polimerasi non si può legare da sola al promotore (come avviene invece nei batteri), i fattori di trascrizione sono fondamentali per il suo reclutamento sul DNA.
• L’RNA polimerasi richiede fattori proteici per legare il promotore ed iniziare la trascrizione.
• 3 RNA polimerasi (nei vegetali ci sono anche: RNA polIVa e RNA polIVb con un ruolo nel silenziamento dei geni).
• I geni sono regolati e trascritti singolarmente (mentre nei batteri sono organizzati in operoni e trascritti come mRNA policistronico).

Le polimerasi eucariotiche sono formate da 12 subunità che formano un complesso proteico. Alcune sono omologhe (β’, β, α1, α2 e ω; sono quindi presenti in tutte le polimerasi procariotiche ed eucariotiche), le polimerasi eucariotiche hanno in comune altre subunità a differenza di quelle procariotiche. Altre subunità sono specifiche per ciascuno dei tre enzimi.

Pol II ha il CTD (dominio C-terminale) nella subunità Rpb1: è una lunga coda C-terminale non strutturata, formata da ripetizioni di una sequenza. Esso è diverso per funzione e struttura dall’α-CTD procariotico, ha un ruolo funzionale nella formazione del complesso di trascrizione e nel distacco dell’enzima dal promotore. La funzione del CTD è regolata dallo stato di fosforilazione dei suoi residui.

Confronto tra polimerasi eucariotiche e procariotiche

Confronto tra le 3 polimerasi eucariotiche e la polimerasi di E. Coli: le polimerasi eucariotiche sono formate da 12 subunità:

• 5 subunità sono omologhe a quelle procariotiche.
• Le 3 pol eucariotiche hanno alcune subunità in comune che sono assenti in quella procariota.
• Le 3 pol eucariotiche hanno alcune subunità specifiche per ciascuna di esse.
• La subunità Rpb1 di pol II presenta CTD formato da ripetizioni della sequenza Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser; questo dominio è assente nella polimerasi procariota dove invece troviamo un dominio C-terminale sulla subunità α (α-CTD) coinvolto nel riconoscimento delle sequenze a monte di alcuni promotori.

Promotore e fattori di trascrizione dell’RNA pol I

Pol I trascrive i geni per gli RNA ribosomiali, essi sono presenti in copie multiple uguali tra loro e organizzati in operoni ripetuti in tandem, localizzati su uno o più cromosomi. Questi geni sono separati da spaziatori che contengono il promotore del gene a valle; dal promotore viene trascritta una molecola di RNA precursore che contiene grandi e piccoli RNA che vengono successivamente separati.

Il promotore del precursore degli rRNA è formato da due regioni:

• TSS: Tratto che si sovrappone al sito d’inizio della trascrizione che costituisce il nucleo del promotore (core), ricco di basi GC nella regione -40 -20 e ricco di AT intorno alla regione di inizio.
• UCE / UPE: Elemento più a monte, si estende dal nucleoide, ricco di GC.

La formazione del complesso di inizio richiede due fattori trascrizionali ausiliari:

• SL1: Complesso multiproteico formato da 4 subunità proteiche: 1 subunità TBP (TATA binding protein, componente essenziale dei complessi di inizio di tutte e 3 le polimerasi) e 3 subunità TAF (TBP associated factors, altri fattori di associazione specifici per Pol I). Si lega al DNA riconoscendo una sequenza specifica, ma il suo reclutamento sul promotore è mediato da interazioni con UBF: una volta sul promotore, SL1 contatta direttamente il DNA e promuove la trascrizione, reclutando Pol I.
• UBF (Upstream Binding Factor): Proteina che si lega al DNA con domini multipli del tipo HMG e interagisce direttamente con il core del promotore e con l’elemento UCE; la regione C-terminale di UBF serve per l’attivazione della trascrizione ed è fosforilata.

Il dominio C-terminale di UBF e il suo stato di fosforilazione influenzano il legame con SL1. Un dimero di UBF si lega a UCE e al core del promotore.