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Processo di replicazione del DNA
SSB• = stabilizzano i singoli filamenti Topoisomerasi II• = rimuovono i superavvolgimenti dovuti all'apertura del DNA Dam metilasi• = è una proteina che metila le sequenze di DNA a livello di una sequenza GATC 1- Fase di inizio del processo di replicazione DnaA Il tutto inizia dalla Come fatta la DnaA: È costituita da almeno cinque subunità che legano i 5 siti R Attraverso l'idrolisi dell'ATP, è in grado di interconvertirsi in uno stato attivo che è capace di arrotolare il DNA legandosi ai siti R⑪ Questa spiralizzazione crea un superavvolgimento positivo capace di generare la denaturazione delle sequenze DUE (ricche di timina e quindi pochi legami a idrogeno e facile da denaturare) elicasi A livello di questa sequenza denaturata, la (o DnaB), grazie all'intervento della DnaC che fa una idrolisi dell'ATP, va a posizionarsi all'interno del disavvolgimento ⑬ disavvolgere La DnaB comincia a il DNA durante il suo movimento QuandoLa DnaB si lega in questi siti, viene reclutata la DNA polimerasi III che prende contatto con l'elicasi tramite la subunità tau. SSB stabilizzano i singoli filamenti di DNA, mantenendo i filamenti aperti. Appena si separano le due catene nel DNA, arrivano le topoisomerasi II. C'è anche la girasi, perché quando si apre il DNA si creano anche dei superavvolgimenti e quindi deve toglierli. Quando inizia il processo di replicazione, poi non può essere più interrotta o regolata. Quindi la fase di inizio è l'unica fase che viene dopo che inizia, poi tutto viene inseguito. Infatti, qui agiscono tutti i sistemi che regolano il ciclo cellulare, come il timing Dam. Il dell'inizio della replicazione è influenzato dalla metilazione da parte della metilasi di sequenze GATC del filamento neosintetizzato. Quindi nel filamento vecchio si ha tutte le sequenze che sono metilate, nel filamento nuovo le GATC non saranno ancora metilate.
Perché sono appena sintetizzate, e fino a che non vengono metilate, il DNA non può essere replicato nuovamente.
La regolazione della Dam metilasi avviene tramite la regolazione del ciclo cellulare.
Una volta che la DNA polimerasi si posiziona, inizia allungamento.
Quali sono le proteine che servono per questo processo:
- SSB = stabilizzano il filamento singolo
- Elicasi
- Primasi
- DNA polimerasi III
- DNA polimerasi I
- Ligasi
- Topoisomerasi
Sintesi per il filamento veloce: primasi sintetizza il primer. Dopo che la DNA polimerasi ha il primo nucleotide, va a sintetizzare in maniera continua il filamento veloce.
Sintesi per il filamento lento: si ha la formazione dei frammenti di Okazaki. Essendo un processo più lento, ci sono le SSB che mantengono stabile il filamento singolo. La primasi deve sintetizzare più primer essendoci più frammenti e gli altri due nucleotidi della DNA.
polimerasi vanno a sintetizzare il filamento della catena lentaLa difficoltà di questo meccanismo sta nel mantereinsieme la sintesi del filamento lento e quello piùandare Ivivelocee d ipuòfil lento,dal nonassogertatoveloce, perché il filamento veloce va più veloce di↓>quello lento ma comunque i nuclei della DNA APRONODSAVVOLGONOpolimerasi sono tutti tenuti insieme, quindi SAB. WEANOpossono staccarsiPer ovviare ciò la DNA polimerasi III ha unacoreografia specifica che coordina il tuttoInfatti un nucleo della DNA polimerasi vanno sulfilamento veloce, invece due nuclei della DNApolimerasi vanno sul filamento lento così per =riuscire a stare alla pari con la sintesi del filamentoveloceQuindi in maniera alternata i due nuclei della DNApolimerasi sintetizzano due frammenti di Okazaki 182modello a trombone,Per descrivere ciò si utlizza ildove il filamento veloce è disteso e il filamentolento è avvolto a
Come funziona la pinza beta della DNA polimerasi:
Nel filamento veloce, il complesso gamma posiziona a livello del nucleo della DNA polimerasi la prima pinza beta. Questa pinza beta rimane sempre attaccata al nucleo, non si stacca mai
Nel filamento lento, si la ha la DNA polimerasi che ha legato al suo nucleo la pinza beta e sintetizza il primo frammento ⑰. Quando finisce di sintetizzarlo, la primasi arriva, interagisce con la elicasi, e sintetizza il primer per un secondo filamento. Dopo aver sintetizzato il primer, la primasi poi si dissocia②
Il primer legato al DNA, ha una molecola di RNA che recluta la pinza beta che è posizionata sul complesso gamma. La pinza beta che era posizionata sul complesso gamma viene posizionata in prossimità del primer perché il complesso gamma si piega. Ora la pinza beta è posizionata sul primer del filamento di Okazaki che deve essere
sintetizzatoe il nucleo della DNA polimerasi ha finito di sintetizzare il frammento di Okazaki precendente,perché incontro il primer precedete e capisce che deve staccarsi e che ha finito ③Ora il nucleo della DNA polimerasi che ha finito di sintetizzare il frammento, si aggancia alla pinza beta che è appena stata posizionata, così per iniziare a sintetizzare il nuovo filamento di Okazaki PIEACOMPLISutNUCLOPOLIDNA LAVORANO MODOIN NUCEDVeAlternatoCome fa la pinza beta a sposarsi ed ad andare sul DNA:La pinza beta quando è legata al complesso gamma, si trova nella sua conformazione apertaSulle subbunita tau del complesso gamma ci sono dei siti di legame per l’ATP ③⑪Quando il complesso gamma lega l’ATP, la pinza rimane aperta e riesce a infilarsi nel primer⑬②Quando pinza si lega al primer, si ha l’idrolisi del ATP che comporta la chiusura della pinza e il⑰distacco del complesso gamma dal complesso primer-pinza beta⑬Rimozione deiprimer: ~DNA90Il primer sono sintetizzati dalle primasi pH 20 ·H-----10 35 3framento5 drarscoNdinvoDNA polimerasi ILa ha il compito di rimuovere con la sua attività esonucleasica 5’-3’ ilprimer RNA e lo sostituisce con DNAQuindi la DNA polimerasi I rimuove tutti i primer sul filamento lento (visto sopra)Cosa fa la ligasi: it358ligasiLa deve unire tutti i frammenti di Okazaki, andando ad unire l’OH libero in 3’ con ilfosfato del 5’ del frammento successivoMeccanismo: adenilatoLa ligasi presenta un residuo importante di lisina, con l’NH3 libero, in grado di venircon una molecola di AMP o NAD; questo determina l’aggiunta di un adenin ribosio fosfato e lacomplesso enzima-AMPformazione un *Il trasferimento di AMP dell’enzima inducel’attivazione del fosfato in 5’, presente alivello dell’interruzione e si forma unintermedioLa DNA ligasi, a questo punto, permette,l’attacco nucleofilo da parte dell’OH
in 3’ alivello del fosfato, con la liberazione dellamolecola di AMP e la formazione dellegame fosfodiestereo, sigillandol’interruzioneL’adenilazione dell’enzima e l’adenilazionedel gruppo fosfato serve ad attivare ilgruppo fosfato che rimane libero 3- Fase di terminazione del processo di replicazione Si ha le due forcelle che vanno avanti in senso orario e antiorario, e si muovono fino a chesequenza TER,non trovano delle che sono delle sequenze di terminazioni Sono delle coppie multiple di una sequenza di 20 coppie di basiproteina Tus Queste sequenze TER sono un sito di legame per laIl complesso proteine tus con sequenze TER sono in grado di interrompere la sintesi Quando si arriva alla fine della duplicazione succede che i duefilamenti rimangono concatenati, e per togliere latopoisomerasi IIconcatenazione c’è l’azione della in cui si hail taglio di due filamenti e quindi si la toglie la concetenazione Tutto quello detto finora riguarda laduplicazione nei procarioti/eucarioti
Replicazione degli I principi generali che sono alla base del processo di duplicazione del DNA nei procarioti sono rispettati anche per la cellula eucariotica, ma nascono alcune problematiche da risolvere:
- Dimensione dei cromosomi = sono più grandi
- Presenza dei nucleosomi = gli istoni devono essere anche loro dissavvolti e riformati durante il processo di replicazione
- Telomeri
Dimensione dei cromosomi
Per risolvere questo problema ci sono più siti di origine della replicazione. In ciascun punto di origine partono due forcelle, e poi ci sarà l'incontro delle due forcelle adiacenti. I siti di origine della replicazione sono chiamati (non più oriC), e queste regioni di DNA sono riconosciute da una proteina a (non più DnaA).
Cambiano le DNA polimerasi eucariotiche
Nelle eucariotiche ci sono più tipi di DNA polimerasi:
- DNA polimerasi A = serve per la sintesi
- DNA polimerasi delta = serve per il filamento lento
- DNA polimerasi epsilon = serve per il filamento veloce
Anche qui ci sono le DNA polimerasi delta e epsilon hanno attività di proof reading. L'unica che non ha attività di proof reading è la DNA polimerasi A che sintetizza i primer.
Proteine implicate nel processo di duplicazione:
- proteina PCNA: ha la stessa funzione della pinza beta della DNA polimerasi III, quindi quella di legare il DNA e tenere la DNA polimerasi delta in posizione corretta
- proteina RPA: ha la funzione di legare il DNA a singolo filamento, ed è il rispettivo delle SSB
- proteina RFC: ha la funzione del complesso gamma e quindi permette il posizionamento della PCNA (è l'analogo della pinza)
Si ha l'antigene T che corrisponde alla elicasi.
Nel filamento veloce si ha DNA polimerasi delta con la PCNA (pinza a beta) e RFC (complesso gamma).
Nel filamento lento si ha la primasi, si ha la DNA polimerasi delta e epsilon.
subisce degradazione durante la replicazione del DNA. La telomerasi è un enzima che aggiunge sequenze ripetute di DNA al telomero, compensando la perdita di DNA durante la replicazione.
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