Biochimica generale - 2° parziale

Biologia molecolare

I protagonisti della biologia molecolare sono i nucleotidi, come gli amminoacidi per le

proteine

nucleotidi basa azotata

I sono costituiti da una che forma un legame di tipo glicosilico

zucchero pentoso, gruppo fosfato

ribosio deossiribosio,

con un che può essere o è un

pirimidina purina

Le basi azotate sono derivati di due precursori, la e la

adenina guanina

Tra le purine ci sono e

citosina, timina uracile

Tra le pirimidine ci sono e (RNA)

ribosio deossiribosio

L’unità fondamentale è il per RNA e

per DNA

Si trovano nella forma beta-furanosica RNA

DNA

Numerazione:

Per convezione gli atomi delle basi azotate

sono numeri e gli atomi degli zuccheri sono

numeri primi

La base azotata è legata alla zuccheri tramite

legame N-beta-glicosilico

un

Il legame è in 1’ dello zucchero con l’atomo in

9 della purina o l’atomo in 1 della pirimidina nucleoside

La base azotata più lo zucchero costituisce il = nucleotide senza gruppo fosfato

metilazioni

Nel DNA alcune basi possono essere modificate attraverso delle

Quindi nel DNA abbiamo anche:

Questa metilazione conferisce alla frequenza di DNA in cui è introdotta delle proprietà

particolari

Una metilazione può portare a una variazione del espressione genica della sequenza in cui

è coinvolta la metilazione (ad esempio può accedere o spegnere un segnale di trascrizione)

legami fosfodiesteri

I diversi nucleotidi a livello degli acidi nucleici si legano attraverso dei

Questi legame si instaura tra l’ossidrile in 3’ dello zucchero presente nel primo nucleotidi e

tra l’ossidrile in 5’ dello zucchero di un nucleitide successivo

Il gruppo fosfato quindi fa due legame esteri

Lo scheletro degli acidi nucleici è costituito da un'alternanza di gruppi fosforici e di residui

di pentosio, mentre le basi azotate possono essere considerate come gruppi laterali uniti

allo scheletro a intervalli regolari

Si ha una direzionalità data dal fatto che il

in direzione 5’-3’

DNA è sintetizzato

Quindi: -

L’estremità 5’ è al primo nucleotide

L’estremità 3’ è al ultimo nucleotide

Si utilizzano lettere per indicare le basi

azotate

Questa convezione è importante per le

banche date genomiche

SCRIVERE

SAPER

STRUTTURA PEPTIDE

DI UN

Scoperte sul DNA: Chargraff

Negli anni ‘50 il gruppo di ricerca di ha scoperto che:

• Le composizioni in basi del DNA è caratteristica per ogni specie

• Le molecole di DNA estratte da cellule diverse di uno stesso organismo hanno la stessa

composizione in basi (quindi ad esempio le foglie e radice di una stessa pianta hanno la

stessa composzione)

• La composizioni in basi non si modifica, ne con l’età, ne con lo stato nutrizionale, ne con

la variazione del ambiente A T

=

• In tutte le molecole, il numero di adenine era uguale al numero delle timine, e il numero

delle citosine era uguale al numero di guanine G

c =

Queste scoperte sono state molto importanti per capire la struttura del DNA

Cristallogia a raggi X: engine

~

cristallografia ai raggi X

La ha contribuito a rivelare

la struttura del DNA Rosalind Franklin

La cristallografia effettuata da ha

permesso ai ricercatori di comprendere la struttura elicoidale del DNA

La posizione degli atomi in una sostanza chimica cristallizzata può essere determinata in

base al quadro di diffrazione dei raggi X che l’hanno attraversata

Il quadro del DNA è estremamente regolare e ripetitivo

elicoidale ripetitiva

Da questa immagine si è visto che la molecola è (croce) e (3,4 Angstrom

e si ripete ogni 34 Angstrom)

Watson e Crick ipotizzarono che la forma del DNA era una doppia elica, ma non aveva

avuto nessuna prova, e grazie a Rosalind Franklin riuscivano a capirlo

Loro ipotizzarono che la catena degli zuccheri e fosfati su trovano nella parte esterna e le

basi azotate su vanno ad appigliare a due a due formando dei legami a idrogeno

Struttura del DNA di Watson e Crick

doppia elica

Le due catene formano una

All’esterno della elica ci sono delle catene costituite dalla alternanza di zucchero e fosfato

All’interno della elica ci sono le basi azotate che instaurano tra loro dei legame a idrogeno

e stabilizzano i collegamenti tra le due eliche

C’è l’appagliamento della timina con adenina e citosina con guanina

Per avere una struttura regolare e ordinata è necessario che le due catene di nucleotidi

corrano in direzione opposta, quindi una catena 3’-5’ e l’altra 5’-3’

antiparallele

Infatti le due catene sono scanalature

All’interno della struttura ci sono delle che sono alternante e di dimensioni

differenti, cioè una scanalatura maggiore che è più ampia e una minore più piccola

La struttura di un giro del elica completo consiste con una scalinatura maggiore e una minore

ed è alta 3,4Å, all’interno di questa scanalatura ci sono 10 basi sovrapposte, ognuna ruotata

rispetto all’altra di 36°

solco maggiore

Il serve come sito di interazione di proteine che legano il DNA

Quindi per questo c’è questa differenza

B

Questa è la struttura del DNA proposta da Watson e Crick

destrorso

È

P Z

P Z

P Z

Caratteristiche della struttura a doppia elica:

Ci sono legame che si instaurano tra le diverse basi azotate

due

Ci sono legame a idrogeno tra adenina e timina, quindi questo legame è più debole

tre

Ci sono legame a idrogeno tra guanina e citosina

Ci sono proprio questi appagliamenti perché permettono di ottenere una struttura che ha

una dimensione regolare = l’uno è lungo 11,1Å e l’altro è 10,8Å, quindi hanno dimensioni

simili

Se invece si mischiano le basi si ottengono dei legami a idrogeno che farebbero distorcere

la struttura

Rispetto all’asse immaginario della doppia elica, le basi azotate sono perpendicolari all’asse

centrale, invece gli zuccheri e fosfati sono paralleli

Le basi adiacenti distano tra loro di 3,4Å

Ogni base ruotate da quella precedente di 36°

Ci sono 10 basi ogni giro del elica

Oltre ai legami a idrogeno, la doppia elice è altamente

Van der Waals

stabilizzata dalla presenza di interazioni di tra

le basi azotate adiacenti

Tipologie di DNA:

Forma A

• = può essere riscontrata in campioni di DNA disidratati oppure

quando si ha dei ibridi di DNA-RNA

Forma Z

• = può essere presente in natura, soprattutto in corrispondenza

di una sequenza alternata di purine-pirimidine

Forma B

• = è quella più comune

Caratteristiche chimico-fisiche del doppia elica del DNA:

Come le proteine, il DNA può naturarsi e denatirarsi

Se si fornisce calore al elice del DNA si ha la denaturazione

del DNA, con la separazione dei due filamenti

Dopo che la sorgente di calore viene rimossa, la doppia

elica si riforma e si ha un processo di rinaturazione

Si dentatura reversibilmente

Curva di melting del DNA:

Questa curva è possibile studiarla tramite delle tecniche spettroscopiche

cambio

Durante il processo di denaturazione del DNA si ha un

dell’assorbimento della doppia elica, rispetto a quando è unita

Si ottiene una curva a sigmoide, come quella proteine

Tm

La è la tempertaura alla quale si ha il sruotolamento della doppia elica

Essendo una curva a sigmoide si capisce che è un processo cooperativo

La Tm dipende dal numero di T e A e C e G, perché tra una è tre e l’altra è due legami a

idrogeno. La quantità di calore per denaturare tre legami a idrogeno è maggiore

Al Tm dipende anche dalla forza ioniche dalla soluzione: maggiore è la forza ionica (cioè la

concentrazione salina) e più alta è la temperatura di melting, perché le cariche negative dei

gruppi fosforici sono protette dai cationi in soluzione e quindi c’è una maggiore stabilizzazione

della doppia elica

Acidi nucleici

Si dividono in DNA e RNA

Il DNA è organizzato all’interno delle cellule in cromosomi

Nelle cellule procariote c’è un unico cromosoma

Nelle cellule eucaristia i cromosomi sono all’interno del nucleo

La quantità di DNA che si può trovare all’interno di una cellula cambia in base al tipo di

cellule, aumentando la complessità del organismo aumenta anche il numero delle basi

Esempio Escherichia coli:

Il cromosoma di eschericca coli è lungo 1,7 nm e si trova all’intento di una cellla di 2micro

Ogni cellule eucariota si ha 2m di DNA. Un corpo adulto umano contiene 10^14 cellule

che corrisponde a 2X10^11Km (1,5X10^8Km distanza tra sole e terra)

Composizione del DNA negli eucarioti:

I genomi degli eucarioti hanno una densità genica ridotta

La densità genetica è la quantità di geni all’interno di una determinata sequenza

Quando l’organismo aumento di complessità, all’interno dello stesso numero di basi si ha

una densità genica che si riduce via via

DNA che codifica 2-4%

In media nel uomo la quantità di le proteine rappresenta solo del

interno genoma sequenza

Oltre alle regioni codificanti, nel DNA si trovano anche delle

introniche, sequenze ripetute, sequenze intergeniche

delle delle

Negli eucarioti, il 98,5% sono delle sequenze che non codificano

La frequenza che confidano sono solo 1%

L’organizzazione e il contenuto del genoma umano:

Sequenze ripetute

Corrispondono al 54% de DNA

Ci sono frequenze altemete ripetitive che non vengono mai trascritte

Ci sono frequenze moderatamente ripetitive che codificano per delle RNA che sono

presenti in alte concetrazione, che sono il RNA-transfer e RNA-ribosimiale spostarsi

trasposoni

Ci sono i che sono delle sequenza mobili che hanno la capacità di al

interno del genoma. Se questi trasposoni si inseriscono in posti particolari possono portare a

patologie

Ci sono trasposoni a DNA e retrotrasposoni

I trasponi sono il 45% del DNA

Possono derivare da infezioni virali di retrovirus acquisite dai nostri antenati

Il trasferimento dei trasposoni può avvenire in due tipi:

• Il trasposone viene tagliato dal suo punto di origine e viene trasferito da un altra parte

• Il trasposome può essere sposato dopo che viene duplicato, e poi può essere

trasferito in un altro sito

Quindi può avvenire con o senza duplicazione

Esempio dell’attivazione dei trasponi = cariossidi del mais

I genomi delle piante sono molto ricchi di trasposoni

la trasposizione cause una variazioni della pigmentazione

Nel 1940 Barbara McClintock (Nobel per la Medicina nel 1983) scoprì gli “elementi di

controllo” nel mais. I trasposoni sono alcuni elementi genetici presenti nei cromosomi capaci

durante lo sviluppo di spostarsi da una posizione all'altra del genoma

La diversa colorazione delle cariossidi del mais è il risultato dell'azione dei trasposoni

I trasposoni, che vennero individuati inizialmente studiando i chicchi del mais, sono presenti in

tutti gli esseri viventi, sia in quelli più sviluppati, come l'uomo, sia nei batteri

Tutto ciò avviene in maniera casuale

Ipotesi sull'origine e la funzione del DNA non codificante:

• Rimasugli di pseudogeni, che nel corso dell'evoluzione hanno perso la loro funzione,

anche a causa di eventuali frammentazioni della sequenza codificante

• Il DNA non codificante ha una funzione protettiva nei confronti delle regioni codificanti

Dal momento che il DNA è continuamente esposto a danni casuali da parte di agenti

esterni (c’è meno probabilità)

• Il DNA non codificante è una sorta di riserva di sequenze al momento non codificate, ma

dalle quali potrebbe emergere un qualche gene in grado di conferire vantaggio

all'organismo

• Parte del DNA non codificante è ritenuto essere, più semplicemente, un elemento

spaziatore tra geni

• Alcune regioni di DNA non codificante hanno una funzione regolatoria, controllano

l'espressione di alcuni geni o lo sviluppo di un organismo dallo stato embrionale a quello

adulto

Organizzazione del DNA

C’è una organizzazione sofisticata in modo tale che tutte le molecole di DNA riescono a

essere insieme all’interno del nucleo

telomeri

Il serve per stabilizzare il cromosoma e vengono prodotto dalle telomerasi

centromero

Il serve durante il processo di divisone cellulare

sequenze uniche

Tra queste due zone ci sono le che costituiscono i geni

Sono entrambi zone costituite da sequenze ripetute

Ci sono i punti dove origina il processo di replicazione (numerose negli eucarioti)

Il DNA essendo molto lungo ha un compattamento ben preciso

superavvolgimenti

Ci sono i che possono essere rappresentati come

il filo di un telefono

Sia prima un avvolgimento dato dal filo del telefono e poi questo filo si

superavvolge

Alcuni ricercatori hanno visto che il DNA circolare quando è

superavvolto occupata uno spazio minore

3CCUPA

SPAZIO

PIU

Con il superavvolgimento si crea anche una tensione strutturale, perché se il DNA è

rilassato sarebbe lineare

Il superavvolgimento si ha solo quando si ha una superficie chiusa

Anche se il DNA è lineare ma è talmente lungo che si comporta

come se fosse una superficie chiusa

Il primo livello di avvolgimento è dato dalla doppia elica

Il secondo livello di avvolgimento è dato dal superavvolgimento

Due tipi di superavvolgimenti: negativi o positivi

Il DNA può andare incontro a superavvolgimenti che possono

essere negativi o positivi

negativi

I superavvolgimenti sono quelli che fanno ruotare il DNA attorno al suo asse in

direzione sinistrorsa e favoriscono l’apertura della doppia elica (ad esempio durante la

replicazione che bisogna aprire la doppia elica del DNA), visto che il DNA ha andamento

destrorso positivi

I superavvolgimenti il DNA ruota in direzione destrorsa e

questo causa un superriavvolgimento perché seguono la direzione

del avvolgimento del DNA

Tutto ciò avviene se il filo viene mantenuto a uno estremità fermo

I superavvolgimenti del DNA avvengono quando il DNA è sottoposto a una deformazione

strutturale, ad esempio quando durante la replicazione in cui la doppia elica viene separata

costante,

Il numero totale degli avvolgimenti rimane perché se si apre la doppia elica si

formerà un superavvolgimento più avanti, a meno che non si rompono uno dei due filamenti

Topologia:

topologia

La è una delle più importanti branche della matematica moderna. Si caratterizza

come lo studio delle proprietà delle figure e delle forme che non cambiano quando viene

effettuata una deformazione senza "strappi", "sovrapposizioni" o "incollature"

La topologia permette anche di studiare il numero di legame topologico del DNA

numero di legame topologico

Il è il numero di volte che un filamento deve essere passato

attraverso l’altro affinché le due catene possano separarsi l’una dall’altra (LK= linking number)

twist writhe

Questo numero è dato dalla somma di due componenti geometriche, il e il

Twist

Il è l’avvolgimento, cioè il numero di volte che un filamento deve girare intorno all’altro

(nel DNA B è di 10,5)

Writhe

Il numero di sono i superavvolgimenti, cioè è la torsione che è il numero di incroci

dell’asse longitudinale su se stesso e /o il numero di spirali nel DNA

Il numero di legame topologico LK rimane costante se non si ha rotture

plectonemico solenoide

Il Writhe può essere o a

plectonemico

• di natura = in cui l’asse longitudinale della

doppia elica è avvolto su se stesso, ed è caratteistico per

le piccole molecole di DNA

a solenoide

• di natura = in cui l’asse longitudinale della

doppia elica è avvolto come attorno un cilindro, ed è

caratteristico del DNA dei cromosomi

topoisomerasi

Regolazione del superavvolgimento = altamente regolato

Il superavvolgimento è un processo che

Ci sono degli enzimi che hanno il compito di aumetare o diminuire il grado di disavvolgimento,

non essendo il DNA è una struttura immobile

topoisomerasi

Questi enzimi si chiamano e servono per aumetare o diminuire il grado di

avvolgimento del DNA (rilassano il DNA)

Due tipi di topoisomerasi: AUMENTALE

Topoisomerasi di tipo I

• = si ha la rottura di un unica catena di DNA

Topoisomerasi di tipo II

• = si ha la rottura di entrambe la catene di DNA e si utlizza ATP

↳ armINUSCELK

Esiste anche una particolare topoisomerasi batterica di tipo II che invece che rilassare il DNA,

aumentano il suo avvolgimento

Come funziona la topoisomerasi di tipo I:

Si ha una proteina che può esistere in una conformazione chiusa o aperta

Nella conformazione chiusa c’è una tirosina reattiva che fa un attacco sul legame

fosfodiestereo di un filamento di DNA, e crea un legame covalente tra l’OH della tirosina e il

⑰ ②

fosfato. Questo provoca la rottura del legame fosfodiestereo del DNA ⑰

⑬

Questo legame comporta una modifica conformazionale e permette il passaggio del filamento

intatto attraverso il taglio 5

Ora si ha la reazione contraria, quindi l’OH fa un attacco Nu e si ha la riformazione del legame

fosfodiestereo, e si riunisce il filamento di DNA che era stato tagliato

Quindi lo rompe, la proteina cambia la conformazione e si apre, permette il passaggio del

altro filamento intatto e poi si richiude

È un processo che non serve ATP e si aumenta l’avvolgim