Biochimica generale

Francesca Nasatti - Biochimica generale

Importanza degli elementi nei sistemi biologici

Per avere la vita abbiamo bisogno di elementi inquieti. Selettività basata sulle caratteristiche di una specie chimica e la sua interazione con macchine che scelgono quale molecola trasportare (macromolecole). Macromolecole informazionali: formate in un ordine preciso monodimensionale che permette di acquisire livelli superiori di struttura-->funzione. Serve organizzazione di singole molecole, di materia in qualcosa di strutturato che esprima la possibilità di svolgere un'attività. (Caratteristica essenziale dei sistemi biologici che non avviene in provetta)

Aspetti fisici

Le cellule si organizzano a formare tessuti che si organizzano in un organismo (esiste grazie alla strutturazione ordinata di diversi tessuti… e caratterizzati da eventi chimici specifici: tessuti-cellule-organelli). Per fare sì che tutto avvenga secondo le necessità dell'organismo (o in qualsiasi altro sistema complesso) c'è bisogno di un sistema di trasporto di informazioni che funziona tra tessuti, organi, cellule, comparti cellulari. Strutture complesse altamente organizzate finalizzate a una funzione.

Aspetti termodinamici

Nei sistemi biologici la cinetica svolge un ruolo prevalente. La capacità di trasformare il caos in ordine (energia informazionale) è propria dell'essere umano(?). Energia richiesta per aumentare lo stato d'ordine di un sistema.

Acqua

Componente più importante dei sistemi biologici. La distribuzione asimmetrica della carica rende la molecola polare (l'ossigeno attira fortemente gli elettroni del legame, spostando la loro carica negativa su di sé, mentre sugli atomi di idrogeno si accumula una parziale carica positiva). Resa importante dalla sua struttura asimmetrica ad angolo che fa sì che l'acqua abbia carattere di dipolo elettrico (atomi con diversa elettronegatività) --> le molecole di acqua possono legarsi tramite il legame idrogeno (molto debole) in cui ci sono 3 atomi allineati: 2 atomi elettronegativi a cui uno è legato covalentemente un atomo di H: si genera attrazione tra H e l'altro atomo elettronegativo. H è perfettamente allineato tra i 2 atomi elettronegativi cosicché il legame idrogeno abbia la sua massima stabilità. L'acqua liquida è un sistema dinamico, i legami si formano e distruggono continuamente. Calore latente di ebollizione è elevato (per trasformare in vapore, dove le molecole sono isolate). Il fatto che il ghiaccio galleggi sull'acqua impedisce che tutta l'acqua congeli perché funge da isolante ma anche l'evaporazione eccessiva dei nostri mari.

Acqua come solvente

L'acqua circonda gli ioni orientandosi secondo le cariche. Solvatazione delle cariche: come conseguenza si forma un guscio di molecole di acqua intorno agli ioni che non potranno più interagire tra di loro. La forza delle interazioni tra ioni determina la < o > solubilità. Il calcio è più piccolo del bario quindi si solvata di più. La sfera di prima solvatazione l'acqua è rigorosamente legata allo ione. La seconda sfera è debolmente legata, non così tanto da mantenere orientamento fisso. Il terzo strato non sente la presenza degli ioni, è acqua libera. Il sodio si solvata più del potassio perché la sua densità di carica è maggiore di quella del potassio? Nello stato solvato il sodio è più grande del potassio. Il passaggio in soluzione di queste specie comporta la rottura dei legami e la formazione di specie solvate. Il passaggio dalla struttura cristallina a questa corrisponde ad un aumento del disordine del sistema.

Acidi e basi

Dato il pH di una soluzione quali specie ioniche ci sono se in soluzione ho un acido o una base? È questa la domanda che devo farmi perché conosco il pH dei sistemi biologici. A pH 2.2, 7, 12 il rapporto tra le concentrazioni della specie protonata e non protonata vale esattamente 1. Se alzo il pH diminuisce il numero di protoni.

Acqua come agente strutturante

Influisce sull'organizzazione delle altre molecole (oltre che sulla disorganizzazione-solvatazione). Aumento dello stato di ordine del sistema. Ma le reazioni spontanee sono quelle dove lo stato di ordine diminuisce, quindi l'acqua spinge le superfici idrofobiche le une contro le altre, per massimizzare lo stato di disordine del sistema: se le avvicino ci sono meno molecole di acqua intorno alle sostanze idrofobiche, quindi più molecole di acqua disordinate, raggiungendo lo stato termodinamicamente più vantaggioso.

Proprietà delle proteine

3 valori di pK dell'acido fosforico. Su P insistono 4O. Su 3 O c'è un protone, ma non si staccano tutti con la stessa facilità. Questa diversità è espressa con i valori di pKa (valori in cui). La specie con pKa più alto è ricca di specie negativa, quindi attrae i protoni anche se sono pochi (concentrazione di 10 alla -12). Acido con 2- acido debole, i protoni non si vogliono staccare. La concentrazione da -2 a -1 ha bisogno di concentrazioni più alte. Protonare -1 per convertirla nella specie elettricamente neutra la concentrazione deve essere ancora più alta, ma il protone se ne va volentieri perché lascia una specie poco carica.

Descrizione delle proteine

pKa1: riferito al gruppo carbossilico pKa2: riferito al gruppo amminico pKa3: riferito alla catena laterale. Polimeri informazionali costituiti da unità elementari, gli amminoacidi, molecole anfoteriche. Li distinguiamo in base alla distinzione della catena laterale, il quarto sostituente dell'atomo di carbonio. Lo zolfo è molto meno elettronegativo dell'ossigeno, quindi la serina è più polare della cisteina.

Glu unici che portano una funzione alcolica sono treonina e serina. Nelle proteine vegetali la glutammina è l'amminoacido preferito rispetto al glutammato. Queste proteine sono presenti nei semi in forma arida e compatta per fare crescere la pianta: la glutammina contiene, a parità di peso, 2 volte più azoto, di cui ha bisogno la pianta per crescere. Il secondo motivo è che nel glutammato l'OH diventa anione e interagisce con l'acqua legando molte molecole; la glutammina lega molta meno acqua, quindi posso mettere più proteine nello stesso volume perché non si trascinano l'acqua. Nell'istidina, sull'imidazolo si delocalizza la carica positiva che deriva dalla sua protonazione. Sull'arginina si protona NH con doppio legame. Il glutammato può esistere in 3 stati di carica.

Punto isoelettrico e proprietà degli amminoacidi

Punto isoelettrico del glutammato. È un amminoacido dove prevalgono le cariche negative (carbossile in alfa e gamma) e un gruppo solo in grado di possedere carica positiva (amminico). Il punto isoelettrico sarà a valore di pH dove i due gruppi insieme danno 1 carica negativa in grado di bilanciare la carica positiva, ciò è possibile a un valore di pH intermedio tra i loro valori di pK, media dei valori di pK (dei due gruppi carbossilici), ovvero 3,23 dove è carico positivamente.

Punto isoelettrico della lisina. Un gruppo che genera una carica negativa, e due che generano carica positiva. Stesso ragionamento di prima. Il punto isoelettrico sarà a un pH basico. I protoni sono attratti dalla carica negativa posseduta dal carbossile, quindi l'ammina più vicina avrà meno protoni (pK più basso?). Quando gli amminoacidi si combinano tra loro per formare peptidi non ci sono più le due funzioni sul carbonio alfa, perché di norma queste partecipano all'unione con altre molecole. Sporgono le catene laterali, che determinano le proprietà degli amminoacidi, che hanno conseguenze sulle proprietà chimico-fisiche dei polimeri:

• Punto isoelettrico. Tutte le catene polipeptidiche cominciano con la funzione amminica (blu) e terminano con il carbossile in alfa dell'ultimo amminoacido (rosso).

Esempi di proteine

Nella bradichinina l'unica funzione in grado di assumere carica negativa è il carbossile, quelle che assumono carica positiva sono le funzioni argininiche e quella amminica (3 gruppi, peptide basico) --> si può assumere che a pH inferiore a 9 questo ormone sia carico positivamente, quindi il punto isoelettrico sarà grossolanamente 10, molto elevato.

Aspartame-Glutatione: legame isopeptidico fatto dal carbonio in gamma e non in alfa. Questo legame comporta che questo peptide non viene fatto dalle normali vie che sintetizzano i peptidi nelle nostre cellule. Cisteina: Il legame disolfuro è di facile formazione e di facile rottura. Lo scopo del legame disolfuro è quello di unire più proteine tra di loro, quindi dare più consistenza al materiale alimentare.

Il glutatione si può ossidare in una reazione, ad esempio, con i perossidi, i quali si riducono, mentre il glutatione forma un legame disolfuro. I perossidi sono responsabili dell'invecchiamento. Il glutatione aiuta nella formazione e nella rottura di legami disolfuro all'interno di varie proteine. Lo stato ossido-riduttivo di una cellula è dato dal glutatione: se c'è tanto glutatione ridotto la cellula può affrontare qualunque situazione in cui è esposta al danno ossidativo. Istammina, dopamina… vengono dalla decarbossilazione di amminoacidi. Sono formati da microrganismi che portano alla maturazione degli alimenti.

Struttura delle proteine

• Struttura primaria: La sequenza amminoacidica si legge partendo dall'amminoacido N-terminale finendo sul carbossile in alfa dell'ultimo amminoacido: è questo il verso con cui le proteine vengono fabbricate nelle cellule. La singola piastrina ha 2 punti di snodo. La sequenza leader è ricca di residui idrofobici. Se non ci fosse la sequenza di connessione i legami si formerebbero a caso e la proteina formata non sarebbe attiva. Si sono rotti legami peptidici e formati ponti disolfuro.
• Struttura secondaria: Mezzo per aumentare la compattezza delle proteine. Struttura a elica o a foglietto ripiegato.
• Alfa elica: I legami a H sono disposti solo sulla superficie del cilindro delimitato dall'alfa elica, non all'interno, a distanza costante, e sono tutti orientati nello stesso verso. L'acqua compete con i legami a H, vuole formarli lei: le catene laterali che sporgono dall'alfa elica limitano l'accesso dell'acqua ai legami H che stabilizzano la struttura secondaria.
• Beta foglietto: Gli amminoacidi che si legano possono essere lontani nella catena. Restano liberi dei CO e degli N, quindi si possono aggiungere altre catene polipeptidiche, i filamenti si possono affiancare. Più se ne affiancano, più il sistema è stabile. Le catene antiparallele decorrono in versi opposti e hanno struttura più semplice (beta-turn). Fibroina
• Betalattoglobulina (BLG): Trasporta i nutrienti dalla vacca al vitello. Essi si trovano nel foro presente sulla proteina. Struttura alfa elica e foglietto pieghettato.
• Alfa elica: I residui non polari sono rivolti verso la proteina lontano dall'acqua, quelli polari sono rivolti verso la superficie della proteina, verso il solvente.
• Beta sheet: Filamenti antiparalleli. Residui polari e apolari (struttura anfifilica). La cavità è idrofobica apposta per trasportare molecole non polari.
• Prolina e glicina sono destabilizzanti dal punto di vista della struttura secondaria, si trovano nelle zone di piegamento, zone che non hanno una struttura secondaria e non nelle strutture secondarie vere e proprie.
• Struttura terziaria: Più acqua legano gli amminoacidi e più si attraggono tra di loro.
• Legami covalenti (disolfuro)
• Legami idrofobici
• Legami di coordinazione: Il ferro attira a sé le 4 cisteine e rende stabile la struttura. Se voglio distruggere l'alfa-lattoalbumina devo abbassare il pH cosicché non possa più legare il calcio. Emoeritrina serve per legare l'ossigeno
• Legami ionici: Le cariche negative spariscono se abbasso il pH e le cariche positive spariscono se alzo il pH.
• BLG: Azoto carico positivamente e anione carbossilato
• Domini strutturali e strutture supersecondarie: Scambiando i domini tra una proteina e l'altra si può avere una proteina che ha più di una funzione. Questo concetto di interscambiabilità si vede al lavoro in una serie di proteine che vengono dalla fusione di domini diversi. Fondere più domini in modo da poter adempiere a diverse funzioni (caso delle proteine di fusione). Questa situazione la si trova anche in proteine contenenti cofattori, strutture non proteiche destinate a svolgere una certa funzione, di solito catalitica o di trasporto: l'unione di due domini porta ad avere una funzione. Proteine in cui sono presenti domini ripetitivi rilevanti dal punto di vista alimentare (proteine di deposito).
• Struttura quaternaria: Distinti non significa diversi (possono anche essere tutti uguali). La BLG bovina è un omodimero stabilizzato da 2 interazioni di tipo chimico: le due unità sono molto vicine --> si formano legami H e interazioni idrofobiche e ioniche (queste ultime si esercitano a distanze molto più grandi).

Processo di folding

Come fanno a formarsi queste strutture se le proteine nascono tutte come dei fili? Bisogna conferire loro una struttura per andare da polipeptidi a proteina ripiegata, darle una struttura terziaria che le consenta di svolgere determinate funzioni.

• Folding spontaneo: Esperimento di Anfinsen: ha distrutto la struttura terziaria di una proteina (ribonucleasi) stabilizzata da 4 legami disolfuro usando agenti denaturanti (nel suo caso l'urea). L'urea, a concentrazioni molto elevate, forma legami H con l'acqua, quindi distrugge la struttura dell'acqua (è un caotropo, genera caos), quindi vengono a mancare le interazioni idrofobiche, importanti per tenere insieme le proteine. I legami disolfuro li rompo usando un tiolo. Restano 8 residui di cisteina. Poi diluisco l'urea e il tiolo, li faccio andare via (siamo così in condizioni rinaturanti) e lascio che la proteina reagisca con l'ossigeno dell'aria (agente ossidante) ---> la proteina spontaneamente riforma la struttura nativa. Questo perché la struttura terziaria è quella che corrisponde alla minima energia possibile, è il punto di massima stabilità, quindi andare da proteina denaturata a proteina con struttura terziaria è un processo energicamente favorito.
• Folding assistito:
• Senza dispendio di energia: La proteina disolfuro isomerasi (PDI) entra in gioco in 2 eventi, ha 2 funzioni:
• Formazione di un ponte disolfuro su una proteina. La PDI contiene un legame disolfuro; vede un tiolo sulla proteina da ripiegare e fa uno scambio di disolfuri tra il suo e il tiolo (reazione di disulfide exchange). Si forma il disolfuro interproteina (tra la PDI e la proteina bersaglio) liberando un tiolo sulla PDI. Poi c'è un ulteriore disulfide exchange e la proteina è ripiegata e solida, legata da un legame disolfuro, mentre la PDI si ritrova con le cisteine in forma ridotta. Quest'ultima verrà poi ossidata e ricomincerà con un'altra proteina.
• Funzione di mending --> aggiusta le proteine in cui i legami disolfuro non sono nel posto giusto (struttura terziaria sbagliata, le proteine sono misfolded, hanno un ripiegamento sbagliato), sempre attraverso reazioni di disulfide exchange. La PDI arriva nella forma ridotta, si forma il disolfuro misto. Alla fine si arriva alla forma giusta della proteina.
• Con dispendio di energia: Chaperone molecolare: sorveglia sul processo di maturazione delle molecole, dà una forma alla proteina, è fatto per impartire alla proteine una struttura terziaria appropriata. Nella zona rossa c'è una cavità idrofobica dove si adagia la proteina. Alla porzione verde si attacca una molecola di ATP che fa ruotare la porzione in rosso, come se fosse una pressa. Ciò induce la proteina a associare le sue regioni idrofobiche. Una volta che queste ultime si sono impaccate e hanno formato il core idrofobico della proteina, il resto della struttura viene da sé. L'ATP fa fare un altro giro alla struttura e la proteina che ha ripiegato all'interno le sue regioni idrofobiche viene rilasciata poiché non può più interagire con la regione idrofobica, e il suo posto viene preso da un'altra proteina. L'energia chimica sotto forma di ATP altera le posizioni dei componenti nel chaperone formando delle associazioni permanenti nelle proteine.

Livelli di struttura proteica al lavoro

Proteine con funzione strutturale - Collageno

Struttura quaternaria in cui sono coinvolti 3 filamenti di tropocollageno che non formano legami H dentro la sequenza amminoacidica ma tra le 3 catene che costituiscono in fascio di polipeptidi allineati. Ma una struttura stabilizzata solo da questi legami H è fragile, in un ambiente acquoso o ad alte temperature è prona a rompersi ---> irrobustire la struttura in modo di resistere a sollecitazioni meccaniche formando legami covalenti trasversali (cross-links) sia all'interno della singola tripla elica del collageno sia tra le diverse triple eliche che formano la macrofibrilla di collagene presente nel tessuto connettivo. Sequenza x-Pro-Gly. Se x fosse la lisina converto l'amminogruppo terminale in una funzione aldeidica, ossido il carbonio che da amminico diventa aldeidico (si forma l'allisina) che reagisce con altro residuo di lisina e si forma una base di Schiff, stabilizzata in un passaggio di riduzione che elimina il doppio legame. Posso anche ossidare 2 molecole di lisina e fare condensazione aldolica tra 2 aldeidi.