Batteriologia e virologia 3

Esami di conferma

A meno che non cresca un patogeno con caratteristiche morfologiche della colonia che corrispondono senza dubbio a un determinato patogeno, l'esame colturale non ci dà un esito sicuro. È sempre meglio affiancare altri esami di conferma: sierologici, che vanno fatti su due campioni di siero. In genere:

• siero acuto, poco dopo la comparsa della sintomatologia
• siero convalescente, 2-3 settimane dal primo prelievo

Il sierologico mira ad andare a verificare la presenza di anticorpi specifici contro un determinato patogeno, quindi se venisse effettuato un singolo prelievo l'animale non avrebbe ancora avuto il tempo di produrre anticorpi perché ha appena contratto l'infezione.

Esame batterioscopico:

1. Osservazione al microscopio della batteri presenti nel campione.

Prove biochimiche:

1. Una volta ottenuto il microrganismo in purezza, è possibile testare quali vie metaboliche è in grado di svolgere e quali no.

immunologiche ³ si basano sulla reazione antigene-anticorpo. Tipizzazione fagica ⁴. Tecniche molecolari ⁵ sono molto vantaggiose perché più rapide e più precise dell'esame colturale, ma hanno uno svantaggio: se usassimo solamente metodiche molecolari non si saprebbe se l'acido nucleico rilevato appartiene ad un batterio vivo oppure morto. È sempre meglio affiancarle (vedremo PCR e sonde molecolari). MALDI-TOF-MS ⁶ si basa sulla ionizzazione dei composti chimici che compongono l'organismo. La formazione delle sostanze ionizzate fornisce una sorta di 'impronta digitale' dell'organismo, identificata da macchinari appositi. I limiti di questa tecnica sono il fatto che sia necessario lavorare su una coltura in purezza e la presenza dell'organismo nella banca dati (se non è stato classificato, non posso sapere cosa sia). 401. ESAME BATTERIOSCOPICO Può essere effettuato direttamente sul materiale.

patologico e si può fare a fresco o dopo la colorazione. Le fasi principali nell'allestimento del vetrino sono:

• Distensione del campione sul vetrino
• Essiccamento del campione
• Fissazione
• Osservare direttamente al microscopio oppure effettuare una colorazione

Esame a fresco

Consente di osservare:

• la forma cellule batteriche
• la disposizione reciproca delle cellule batteriche
• dimensioni batteri
• rifrangenza delle cellule batteriche
• mobilità (se dotati di strutture idonee)
• riproduzione in alcuni casi

L'osservazione a fresco viene sempre fatta in un mezzo liquido (il campione non viene essiccato) - Il campione va stemperato in una soluzione fisiologica o in brodo nutritizio. Si stende un campione sul vetrino porta oggetto e si copre con il vetrino copri oggetto, poi si osserva.

Esami su preparati colorati

Con un esame su un preparato colorato, si può differenziare un batterio in modo più specifico, in base all'areazione del

microorganismo alla specifica colorazione. Vedremo che alcuni batteri reagiscono in modo univoco ad una determinata colorazione e quindi permettono di fare diagnosi accurate e precise; tuttavia, non tutte le colorazioni sono adatte ad un'identificazione precisa.

Le fasi dell'allestimento del vetrino sono tipiche di tutte le colorazioni:

1. Distensione del campione sul vetrino - può essere fatta mediante striscio, stemperamento (un materiale solido viene diluito in una goccia di soluzione fisiologica o brodo nutritizio), oppure il campione può essere schiacciato tra due vetrini o si può effettuare un'impronta (si tocca direttamente con il vetrino la lesione o il materiale cresciuto, ad esempio, su una piastra e la parte che rimane adesa al vetrino verrà colorata).
2. Essicamento - può essere fatto all'aria o al calore moderato (passando molto velocemente e per un numero limitato di volte il vetrino su una fiamma, per asciugare il campione).

Fissazione - può avvenire o chimicamente (grazie ad alcol-etere) o fisicamente grazie al calore (si passa sulla fiamma con una temperatura più elevata di quella usata per l'essicamento).

Colorazione di interesse e lavaggio del colorante in eccesso.

Asciugamento del campione, con carta bibula o calore moderato.

Osservazione microscopica - può avvenire o per immersione = ponendo una goccia di olio di cedro sul vetrino e immergendo l'obiettivo 100x; o con vetrino copri oggetti.

Definizioni utili per la preparazione di campioni colorati:

Metacromasia = fenomeno che si rileva quando una sostanza colorante impartisce ad una struttura del colore diverso dal suo batterio un (del colorante). Ad esempio, se utilizzo un colorante azzurro e coloro una struttura che diventa verde, la reazione è detta metacromasia.

Mordenzanti = sono sostanza usate spesso nei protocolli di diluizione, favoriscono la colorazione del colorante ad una struttura o all'interno di

un batterio. Le colorazioni possono essere:

• semplici = viene utilizzato un solo tipo di colorante. Ad esempio, ci sono colorazioni semplici con blu dimetilene, cristal-violetto, fucsina o blu di Loffer.
• differenziali = utilizzano più di un colorante.
• positive = il colorante si lega a strutture del batterio.
• negative = il colorante non si lega al batterio, ma lo circonda.

Colorazione di Gram

Gram positivi e Gram negativi: questa definizione dipende dalla reazione del batterio alla colorazione di Gram.

Fasi della colorazione di Gram

Se su un vetrino abbiamo sia batteri Gram + che Gram -, dopo la fissazione questi appaiono tutti incolore.

Primo colorante: cristal-violetto → 20 secondi.

1. Se applichiamo questo colorante sul campione fissato, vedremo che i batteri si colorano tutti di bluette-violetto (sia Gram positivi che negativi hanno una porosità della parete che consente l'ingresso del colorante).

Trattamento con mordenzante: soluzione

1. I gram positivi hanno una parete batterica molto più rigida e con una porosità più limitata rispetto ai Gram negativi, con uno strato di peptidoglicano molto più spesso, tra gli strati di peptidoglicano (circa 20) c'è la matrice. La soluzione di mordenzante causa una compattazione della matrice e quindi del peptidoglicano, con riduzione ulteriore della porosità della parete batterica. Ciò non avviene nei Gram negativi, che hanno uno strato di peptidoglicano molto più sottile. Elimino la soluzione di mordenzante in eccesso.

2. Decolorazione mediante alcol etilico e acetone.

3. I Gram negativi presentano una membrana esterna di natura lipidica. Grazie all'azione della soluzione di mordenzante, che ha compattato i peptidoglicani e ridotto i pori, il colorante non riesce ad uscire dai pori e quindi la decolorazione non è efficace sui Gram positivi. Nei Gram negativi, l'alcol e l'acetone sciolgono

La porzione lipidica più esterna ed essendoci delle maglie molto larghe (no strato di peptidoglicani compatto), il Gram negativo si decolora. Bisogna lasciare agire il decolorante fino a quando non viene più rilasciato il colorante.

Secondo colorante (colorante di contrasto): safranina → 15 secondi.

4. I Gram positivi rimangono colorati di violetto (non entra più niente dalla parete compattata), mentre i Gram negativi, che si erano decolorati, lasciano entrare il secondo colorante, che conferisce una colorazione tendente al rosso.

Osservazione al microscopio:

5. obiettivo a 100x ad immersione (con olio di cedro sul vetrino).

Il colorante non agisce sul peptidoglicano, è il mordenzante che compatta il peptidoglicano. Il colorante entra nel batterio grazie alla porosità, infatti inizialmente colora sia Gram positivi che negativi. [Chiarimento della prof in risposta ad una domanda]

Colorazione di Ziehl Neelsen. È efficace nei batteri detti

alcol-acido-resistenti e ci permette di identificare quelli che hanno una ricca componente di cere nella parete. Fasi della colorazione di Ziehl Neelsen Dopo aver fissato i batteri sul vetrino: Primo colorante: fuxina → circa 3 minuti. Tutti i batteri si colorano di una colorazione tendente al rosso. Risciacquo con acqua Decolorazione con una sostanza alcol-acida (HCl) che agisce sulla parete dei batteri NON acido-resistenti. In questo modo il decolorante fissa il colorante all'interno dei batteri acido resistenti, perché la loro parete non viene attaccata dal decolorante, mentre gli organismi NON acido resistenti si decolorano. Risciacquo con acqua Secondo colorante (colorante di contrasto): blu di metilene. Questo entra nelle cellule decolorate, ma non negli acido-resistenti. Osservazione al microscopio. Gli organismi acido-resistenti saranno colorati di rosso e i NON acido-resistenti saranno colorati di blu. Normalmente, gli acido-resistenti sono resistenti aSchaffer-Fulton: 1. Fissazione: immergere il campione in una soluzione di formalina al 10% per 30 minuti. 2. Lavaggio: sciacquare il campione con acqua distillata. 3. Colorazione primaria: coprire il campione con soluzione di malachite verde al 2% per 5 minuti. 4. Lavaggio: sciacquare il campione con acqua distillata. 5. Decolorazione: coprire il campione con soluzione di acido acetico al 3% per 1 minuto. 6. Lavaggio: sciacquare il campione con acqua distillata. 7. Colorazione secondaria: coprire il campione con soluzione di safranina al 1% per 1 minuto. 8. Lavaggio: sciacquare il campione con acqua distillata. 9. Montaggio: coprire il campione con un vetrino e fissarlo con un mezzo di montaggio. Colorazione di Gram: 1. Fissazione: immergere il campione in una soluzione di formalina al 10% per 30 minuti. 2. Lavaggio: sciacquare il campione con acqua distillata. 3. Colorazione primaria: coprire il campione con cristal violetto per 1 minuto. 4. Lavaggio: sciacquare il campione con acqua distillata. 5. Decolorazione: coprire il campione con soluzione di iodio al 2% per 1 minuto. 6. Lavaggio: sciacquare il campione con acqua distillata. 7. Colorazione secondaria: coprire il campione con soluzione di safranina per 1 minuto. 8. Lavaggio: sciacquare il campione con acqua distillata. 9. Montaggio: coprire il campione con un vetrino e fissarlo con un mezzo di montaggio.

Schaffer-Fulton

Dopo aver fissato il campione al vetrino

1. Primo colorante: verde di Malachite. Consente di colorare tutte le cellule presenti nel vetrino di verde.
2. Riscaldamento fino alla comparsa dei primi vapori.
3. Decolorazione (lavaggio) con acqua. La colorazione permane solamente nelle spore, mentre le forme vegetative si decolorano.
4. Secondo colorante (colorante di contrasto): safranina 20 secondi. Colora di rosso le forme vegetative.
5. Osservazione al microscopio. Le forme vegetative saranno rosse e le endospore (libere o all’interno del corpo batterico) saranno verdi.

Altre colorazioni che evidenziano strutture del corpo batterico sono:

• Colorazione dei flagelli (sono strutture molto sottili e fini, difficili da osservare al microscopio ottico). Si effettua utilizzando o acido tannico colloidale si appiccica al flagello e lo inspessisce, fino