Batteriologia e virologia 3

Interazione microrganismo - ospite

L’uomo e gli animali sono colonizzati da microrganismi sulla cute e sulle mucose (ma non solo). La colonizzazione avviene al parto e permane per tutta la vita. Un tempo si pensava che solo le superfici a contatto con il mondo esterno fossero colonizzate da microrganismi e quindi si parlava di microbiota solo in relazione alla cute e mucose. In realtà anche molti organi, che si pensava fossero sterili, presentano un loro microbiota (perfino il sistema nervoso centrale).

Tipi di rapporti tra microrganismo e ospite

I tipi di rapporti che possono esserci tra microrganismo e ospite sono:

• Mutualismo → Sia il microrganismo che l'ospite traggono beneficio dall'interazione (es: mutualismo tra E. coli intestinali e uomo);
• Commensalismo → Il microrganismo vive nell'ospite traendone vantaggio ma senza provocare alcun danno;
• Parassitismo → Il microrganismo definito parassita, vive alla superficie o all'interno dell'ospite, a sue spese e danneggiando quest'ultimo.

In altri casi, i microrganismi sono indispensabili all’ospite, perché questi riescono a digerire delle molecole che l’ospite non è in grado di digerire e quindi possono fornire metaboliti che l’ospite può utilizzare. Ciò avviene ad esempio nel rumine: nel rumine sono presenti tutti i tipi di microrganismi, che digeriscono polimeri complessi come la cellulosa, consentendo ai ruminanti di utilizzarla per produrre energia metabolica.

Inoltre, alcuni microrganismi forniscono sostanze nutritizie essenziali per il loro ospite. Tuttavia, ci sono microrganismi che, anche se utili, in alcune condizioni possono causare malattie (ad esempio nei soggetti immunodepressi).

Colonizzazione e infezione

Le malattie infettive hanno sempre inizio con la colonizzazione delle superfici dell’ospite da parte dei microrganismi. La colonizzazione può essere:

• Transiente → Il microrganismo viene eliminato senza interferire con l’ospite;
• Permanente → Il microrganismo prolifera e invade la superficie dell’ospite causando un'infezione.

L’infezione non per forza ha effetti negativi sull’ospite. Quindi il soggetto può essere infetto ma non manifestare la malattia. La malattia si instaura solo se il microrganismo, o i suoi metaboliti, o la risposta stessa dell’ospite danneggia i tessuti dell’animale.

Patogenicità e virulenza

La patogenicità è la capacità di un microrganismo di causare malattia in condizioni naturali. La patogenicità può avere diversi gradi e in base a questi riconosciamo:

• Patogeni → Microrganismi che causano sempre malattia quando infettano un animale;
• Opportunisti → Microrganismi in genere commensali, solitamente con un abbassamento delle difese immunitarie dell'ospite causano malattia.

La virulenza indica il grado di patogenicità di un microrganismo. La virulenza dipende da:

• Infettività → Capacità di sopravvivere alle normali difese dell’ospite e quindi di stabilire infezione. La dose infettante indica la quantità di microrganismi necessari per instaurare l'infezione.
• Gravità delle lesioni

Differenze tra malattie infettive e contagiose

La malattia infettiva è una malattia causata da un microrganismo. La malattia contagiosa è una malattia che si trasmette da un soggetto all’altro. Non tutte le malattie infettive sono contagiose: ad esempio il tetano è una malattia infettiva che non si trasmette da un soggetto malato a un soggetto sano.

Il periodo di incubazione è l'intervallo tra l’esposizione al patogeno e la comparsa dei sintomi.

Il soggetto portatore è un soggetto con infezione inapparente che elimina il patogeno e può trasmettere la malattia. È molto pericoloso poiché non ha sintomatologia e non viene distinto come infetto.

La zoonosi è una malattia trasmessa dagli animali all’uomo (il contrario è antropozoonosi).

Fattori di patogenicità

I fattori di patogenicità sono fattori che consentono ad un microrganismo di causare malattia. La capacità di un microrganismo di causare malattia dipende da:

• Capacità di realizzare l’infezione = colonizzazione stabile dell'ospite e invasione
• Capacità di sopravvivere alle difese dell’ospite
• Capacità di danneggiare i tessuti dell’ospite

Fattori di colonizzazione

I fattori di colonizzazione sono fondamentali per stabilire un’infezione. Per stabilire un’infezione, molti microrganismi si fissano saldamente alla superficie dell’ospite grazie a strutture esterne capaci di aderire ai tessuti dell’ospite. In questo modo i microrganismi diventano resistenti ai flussi di liquidi, ai movimenti peristaltici, all’azione delle ciglia e del muco (della mucosa respiratoria).

Alcuni fattori di colonizzazione conferiscono adesività ai microrganismi. Tra i fattori di adesività si trovano le adesine, che includono strutture come la capsula, il glicocalice, le fimbrie o le strutture pilosimili.

In particolare, le fimbrie sono strutture tubulari che si dipartono dalla parete batterica, che aderiscono al corpo batterico tramite una struttura a forma di disco. Inoltre, le fimbrie presentano molecole di una proteina, la pilina, che si organizza in strutture elicoidali a formare una struttura cava che costituisce il pilo. L’estremità delle fimbrie (o pili) non è costituita da pilina, ma da adesine che hanno la capacità di legarsi ai recettori delle cellule dell’ospite (glicoproteine o glicolipidi): ad esempio, i batteri capaci di colonizzare l’apparato genitale (generalmente della specie di E. coli) riescono a legare i glicosfingolipidi dell’epitelio del tratto urinario degli ospiti. Questi glicosfingolipidi sono anche riconosciuti da altri batteri che hanno un ruolo commensale.

I batteri patogeni competono quindi con quelli commensali per il legame a queste strutture dell’epitelio del tratto urogenitale. Una volta che i batteri patogeni legano le cellule dell’epitelio urogenitale, si fissano, si moltiplicano ed esercitano la loro attività patogena.

In caso di infezioni virali in corso, i virus possono far comparire nuovi recettori (proteine) sulla superficie delle cellule infette, che ora vengono riconosciuti dai batteri. Questi recettori facilitano quindi le infezioni batteriche secondarie, durante un’infezione virale.

Fattori di diffusione

Molti batteri producono enzimi che ne facilitano la penetrazione e diffusione all’interno dell’organismo, dissolvendo alcune componenti tissutali e danneggiando le barriere fisiche. Tra gli enzimi che possono essere prodotti da batteri abbiamo:

• Ialuronidasi → hanno la capacità di dissolvere l’acido ialuronico della matrice dei tessuti connettivi. La ialuronidasi viene prodotta da batteri come S. aureus e S. pyogenes.
• Fibrinolisina → è in grado di sciogliere i coaguli di fibrina, che altrimenti imprigionerebbero e distruggerebbero i microrganismi.
• Collagenasi → è in grado di degradare il collagene e quindi può portare a colliquazione dei tessuti.
• Lecitinasi (α-tossina) → depolimerizza le membrane cellulari

Esistono altri enzimi che permettono la diffusione dei patogeni, ma in modo indiretto:

• Coagulasi → formano una barriera protettiva per i patogeni nei confronti delle difese dell’ospite. Fanno in modo che il sangue si coaguli e i batteri intrappolati nei coaguli vengono protetti dal riconoscimento da parte del sistema immunitario.
• Emolisine → sembra che contribuiscano alla lisi dei fagociti.

Fattori che inibiscono la fagocitosi

Alcune strutture esterne dei batteri e alcune sostanze da essi prodotte possono inibire la fagocitosi delle cellule del sistema immunitario dell’ospite, e rappresentano dunque dei fattori di patogenicità.

La capsula di alcuni ceppi maschera le strutture superficiali del batterio riconosciute dai fagociti (come Streptococcus pneumoniae), superando indisturbati la loro attività difensiva. I ceppi privi di parete hanno strutture esterne (pathogen-associated molecular patterns), che vengono riconosciute da dei recettori (pattern-recognition receptors) e in seguito fagocitate dai fagociti; nei batteri capsulati, invece, la capsula maschera queste strutture, che non vengono riconosciute dai recettori e quindi non vengono fagocitate.

Contro alcuni patogeni capsulati, l’ospite produce anticorpi in grado di legare la capsula e quindi rendere il batterio più facilmente disponibile per i fagociti. Questi anticorpi sono quindi in grado di opsonizzare (= rivestimento del patogeno da parte delle cellule del sistema immunitario, per renderlo più visibile) il batterio.

Altri fattori che inibiscono la fagocitosi sono:

• Leucocidina → molecola prodotta da alcuni batteri che ha un'azione tossica sui leucociti in generale;
• Coagulasi;
• Antichemiotattici → inibiscono la migrazione dei leucociti;
• Alcuni batteri si fanno fagocitare ma resistono alla lisi intracellulare e quindi si diffondono trasportati dai leucociti (M. tuberculosis).

Fattori tossici

Alcuni batteri danneggiano l’ospite o ne riducono le difese mediante sostanze tossiche, suddivise in due grandi categorie:

Esotossine

Le esotossine sono proteine solubili prodotte nel citoplasma dei batteri e secrete all’esterno, mentre il batterio è ancora vivo. Vengono prodotte principalmente nei Gram-positivi come parte della loro crescita e metabolismo. Se un batterio infetta l’ospite localmente, le sue tossine possono diffondersi in tutto l’organismo (ad es. per via circolatoria) e causare danni sistemici o morte (C. tetani).

In molti casi le esotossine sono la causa di malattia e una volta neutralizzate il soggetto è immune (al secondo incontro con questa tossina il soggetto non va incontro alla malattia), in quanto le esotossine stimolano la produzione di anticorpi da parte del soggetto infetto. Essendo di natura proteica sono termolabili (si denaturano oltre i 60°C) e antigeniche, cioè stimolano la produzione di anticorpi da parte del soggetto infetto.

Una volta denaturate (con formalina) mantengono il loro potere immunogeno ma non più quello tossico. Queste tossine denaturate prendono il nome di anatossine o tossoidi e sono utilizzate per l’immunizzazione dei soggetti o in soggetti sieroproduttori.

Tipi di esotossine in base alla struttura:

• A-B → Sono costituite da due subunità, A e B. La porzione B lega il recettore sulla cellula ospite, mentre la porzione A media la tossicità. A seguito del legame con il recettore, le due subunità A e B vengono internalizzate nella cellula ospite e vengono racchiuse mediante endocitosi all’interno di un endosoma. All’interno dell’endosoma, il pH si abbassa notevolmente e le due subunità vengono separate. In questo modo, la porzione A viene liberata e può esercitare la sua attività tossica. Esempi di tossine A-B sono: tossina difterica, colerica, tetanica, shiga-toxin. Queste tossine hanno come bersaglio i ribosomi = alterano la sintesi proteica, vanno ad interferire con i meccanismi di trasporto o le vie di trasmissione del segnale.
• Citolitiche → Causano la lisi delle cellule andando a disorganizzare le membrane cellulari dell’ospite. Esempi di esotossine citolitiche sono: emolisine, fosfolipasi, streptolisina O.
• Superantigene → Questa tossina stimola le cellule T a produrre citochine. Esempi di esotossine superantigene sono: Toxic shock Toxin (di S. aureus).

Tipi di esotossine in base alla sintomatologia:

• Neurotossine → Hanno come bersaglio il sistema nervoso. Esempi di neurotossine sono:
  • Tossina botulinica (di C. botulinum) → Si lega alle sinapsi dei nervi bloccando la liberazione di acetilcolina. Questa tossina provoca paralisi flaccida della muscolatura.
  • Tossina tetanica (di C. tetani) → Interferisce con i nervi periferici del midollo spinale, dove altera la trasmissione nervosa alle cellule muscolari. Questa tossina provoca paralisi spastica (cioè una contrazione costante della muscolatura). Il tetano può essere ascendente o discendente.
• Enterotossine → Sono numerose e con diversi meccanismi d’azione, ma tutte provocano sintomatologia gastroenterica (vomito o diarrea). Esempi di enterotossine sono: enterotossina di V. cholerae, che blocca la conversione di AMP ciclico in ATP e porta a uno squilibrio ionico verso il lume intestinale (gli ioni vengono riversati nel lume intestinale) e conseguente richiamo di acqua e quindi disidratazione del soggetto. Ceppi particolari di E. coli, detti enterotossigeni, colpiscono generalmente i soggetti neonati provocandone la morte, mentre nell'adulto la sintomatologia è più lieve e controllabile.
• Citotossine → Causano morte della cellula (causano lisi cellulare o interferiscono con la lisi cellulare). Esempi di citotossine sono: tossina difterica di C. diphtheriae, prodotta da batteri lisogenizzati (cioè infettati da batteriofagi in grado di compiere un ciclo lisogeno). Un altro esempio di citotossina sono le emolisine, che causano la lisi dei globuli rossi.

Endotossine

Le endotossine sono componenti della parete batterica che si liberano dopo la morte del batterio. In particolare, le endotossine sono costituite dal lipide A dei lipopolisaccaridi (LPS) dei Gram-negativi. Solo i Gram-negativi possiedono le endotossine. Le endotossine hanno attività meno specifiche rispetto alle esotossine. Anche i sintomi provocati dalle endotossine sono più generici. Infatti, le endotossine causano febbre e per questo motivo vengono chiamate pirogeni esogeni = sono alcune citochine prodotte dall’organismo. La febbre serve per rallentare il metabolismo del patogeno e concentrare la maggior parte delle energie sulla difesa immunitaria.

Inoltre, le endotossine possono causare: uno stato di debilitazione, diarrea, abbassamento della pressione e lesioni necroscopiche (emorragie, trombosi vascolari, essudati nelle cavità splancniche). Dal momento che le endotossine sono liberate dopo la morte cellulare dei Gram-negativi, è importante assicurarsi che tutte le soluzioni iniettabili a scopo terapeutico siano prive di endotossine. La loro natura lipopolisaccaridica giustifica la termoresistenza - quindi anche dopo sterilizzazione è possibile avere residui di LPS attivo in soluzioni iniettabili (al contrario delle esotossine).

Oggigiorno sono utilizzate a questo scopo tecniche che riducono notevolmente l'ultilizzo degli animali (la prova veniva precedentemente effettuata su conigli). È stato sviluppato il LAL test, che si basa sull’utilizzo di amebociti di Limulus polifemus (cellule presenti nel sangue di questi crostacei), che vengono prelevati e lisati. Successivamente vengono messi a contatto con la sostanza da testare. Se è presente LPS, nel lisato si scatena una reazione che porta alla formazione di un coagulo oppure la variazione di colore del substrato.

Un altro sistema che non utilizza animali per valutare la presenza di LPS è l'aggiunta del liquido da testare su colture cellulari di macrofagi, poiché hanno un’elevata capacità di rispondere alla presenza di LPS producendo citochine.

PAMPs e sistema immunitario

Nel rapporto microrganismo-ospite giocano un ruolo fondamentale i PAMPs. I microrganismi possiedono delle strutture che conferiscono patogenicità e alcune di queste possono essere riconosciute da cellule del sistema immunitario. Il sistema immunitario innato è in grado di riconoscere delle strutture comuni a più microrganismi. I microrganismi sono dotati di PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns), che sono riconosciuti da recettori cellulari dell’ospite, chiamati Pattern-Recognition-Receptors (PRRs). I PAMPs sono strutture comuni a più microrganismi (non sono specifici di un solo microrganismo).

Ci sono diversi tipi di PRRs, come i Toll-like receptors, che sono in grado di riconoscere alcune strutture comuni a più batteri - ad esempio il Toll-like receptor 5, che riconosce la flagellina del flagello.

Batteriologia diagnostica e clinica

Questa branca della microbiologia mira all’isolamento e identificazione degli agenti causali delle malattie infettive per effettuare diagnosi. È fondamentale che l’identificazione del patogeno sia rapida e precisa. Con le metodiche tradizionali, in circa 48 h si riesce a isolare il batterio e a identificarne la sensibilità antibiotica; con la biologia molecolare, invece, in circa 2-6 h si riesce a identificare il patogeno.

Le fasi fondamentali per l’isolamento e l’identificazione di un microrganismo sono:

• Prelievo → Deve essere fatto in modo corretto, al fine di evitare contaminazioni.
• Trasporto
• Coltivazione/isolamento → In laboratorio, il batterio deve essere isolato dagli altri batteri che possono essere presenti insieme a quello di interesse.
• Esame microscopico
• Prove biochimiche → Consentono di identificare il patogeno in modo preciso.
• Valutazione della sensibilità agli antibiotici → Per comprendere quale terapia sia la più efficace da impostare per il trattamento del soggetto malato.

In parallelo ci si può poi avvalere di ulteriori prove:

• Prove immunologiche, consentono una più precisa identificazione del patogeno
• Tecniche molecolari, consentono una più precisa identificazione del patogeno

Prelievo

In caso di sospetto di malattia infettiva bisogna effettuare un adeguato prelievo di campioni di materiale patologico, di tessuti (biopsie).