Batteriologia e virologia 2

Crescita batterica

La crescita batterica è influenzata da diversi fattori ↴

1. FATTORI NUTRITIZI

La maggior parte dei batteri utilizza i fattori nutritizi sia come fonte di energia, sia per il metabolismo

plastico (= per la produzione di macromolecole necessarie alla sua vita).

L’eccezione sono i batteri fotosintetici che trasformano l’energia radiante in energia chimica - non hanno

bisogno di utilizzare fattori nutritizi per produrre energia ma solamente per la produzione di macromolecole.

fonte di carbonio producono

I batteri possono essere classificati In base alla utilizzata e al modo con cui

energia:

Batteri autotrofi Batteri eterotrofi

Utilizzano CO come fonte di carbonio. Si dividono Utilizzano composti organici. Si dividono in:

2 Fotoeterotrofi,

in: • utilizzano l’energia radiante per

Fotoautotrofi,

• in grado di effettuare fotosintesi. degradare i composti organici.

Chemioautotrofi, Chemioeterotrofi,

• che necessitano di reazioni • utilizzano l’energia derivante dal

chimiche per generare energia. metabolismo di macromolecole. I batteri di

interesse medico appartengono tutti a questo

gruppo.

I microrganismi possono essere anche suddivisi in:

Batteri saprofiti:

- si riproducono su materiale morto; →

Batteri parassiti obbligati:

- si riproducono su cellule vive Rickettsiae, Chlamydiae e virus. Ai

parassiti obbligati mancano alcuni enzimi fondamentali per la loro replicazione e quindi devono utilizzare

quelli delle cellule.

Oltre al carbonio i microrganismi necessitano di altre molecole per il proprio metabolismo e riproduzione

come idrogeno, ossigeno, azoto, fosforo, zolfo e metalli. Se l’obiettivo è quello di coltivare in vitro dei batteri

è fondamentale assicurarsi di fornire tutti questi fattori nutritizi.

Terreni di coltura

I motivi per cui si fanno crescere dei batteri in laboratorio sono molteplici: osservare come inducono

malattia, capirne il meccanismo d’azione o la patogenicità. L’ingegneria genetica consente di produrre

proteine, farmaci e sostanze utili. Un motivo importante per la professione del veterinario è sicuramente

quella di isolare, identificare e contrastare l’agente patogeno di una determinata patologia.

Terreni base

Per far crescere i batteri in vitro è necessario fornire loro le materie nutritizie adeguate. Molti batteri

terreno minimo,

crescono sul cioè costituito da:

• Acqua: con terreni privi di acqua i batteri non sopravvivono;

• Glucosio: utilizzato come fonte di carbonio;

• Solfato di ammonio: utilizzato come fonte di azoto;

• Altri sali minerali.

I batteri di interesse medico necessitano di terreni più complessi, arricchiti con specifici fattori di crescita

come: basi azotate, aminoacidi e vitamine. Sono quei componenti che i batteri non riescono a sintetizzare

ex novo, ma devono trovare nell’ambiente in cui si trovano. I primi terreni sviluppati che contenevano tutti

questi elementi furono:

Brodo di carne

• - si metteva a bollire la carne e le cellule presenti nel muscolo, andando incontro a morte,

rilasciavano il proprio contenuto arricchendo il brodo;

Brodo nutritivo

• - costituito da acqua, cloruro di sodio, estratto di carne e peptone = è un derivato dalla

digestione parziale di proteine animali e vegetali. Il brodo doveva essere mantenuto ad un pH neutro uguale

a 7.

Questi due terreni erano liquidi, ma molto spesso è utile far crescere i microrganismi su terreni solidi per

poter osservare la formazione e la crescita di singole colonie, che può darci un idea di che tipo di

organismo si tratta. →

Uno dei terreni solidi più semplici è il brodo nutritivo a cui viene aggiunto agar in percentuale del 1,5-2%

agar nutritivo.

si ottiene quello che viene detto L’agar è un polimero che si trova sotto forma di polvere che

quando viene scaldato si scioglie, mentre quando la temperatura si abbassa nuovamente, solidifica

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consentendo quindi la solidificazione di un terreno. È molto importante dosare la concentrazione di agar,

perché se ne viene aggiunto troppo viene sequestrata troppa acqua e quindi i batteri non crescono dato

che non riescono ad utilizzarla. I terreni “agarizzati” non consentono il movimento dei batteri flagellati.

Alcuni batteri patogeni sono più esigenti e necessitano ulteriori fonti nutritizie: possono richiedere l’aggiunta

glucosio o estratto di lievito.

al brodo nutritivo o all’agar nutritivo di

Terreni speciali

Per le indagini batteriologiche sono disponibili differenti terreni che hanno finalità differenti.

Terreni di trasporto:

• il prelievo non viene fatto nello stesso luogo in cui vengono svolte le analisi, quindi il

campione deve essere trasportato e mantenuto in condizioni idonee dal momento in cui viene prelevato fino

all’arrivo in laboratorio. I terreni di trasporto hanno la finalità di mantenere vitali tutti i microrganismi presenti

nel campione senza alterare le percentuali delle varie popolazioni microbiche. Il rischio è che se un batterio

è poco rappresentato ma è quello responsabile della sintomatologia, le altre specie microbiche potrebbero

prendere il sopravvento e inibire proprio quel microrganismo impendendo così una diagnosi corretta. A tale

scopo, i terreni sono costituiti da soluzioni saline tamponate, che impediscono la variazione troppo marcata

del pH e non consentono la replicazione dei batteri. Se c’è il sospetto di presenza di batteri anaerobi

bisogna assicurare l’assenza di O2.

Terreni ricchi:

• agar sangue e agar-cioccolato (consentono la crescita di quasi tutti i patogeni).

sangue

Uno dei terreni molto utilizzati in diagnostica è l’agar - si aggiunge all’agar nutritivo il sangue

defibrinato. Il sangue contiene infatti tutti gli elementi necessari per la crescita di microrganismi che

infettano un animale ospite, risultando quindi un terreno ottimale.

Il sangue viene prelevato da un animale donatore (solitamente bovini o pecore) e si messo in una beuta

contenente una grande quantità di sferette di vetro che si tengono in agitazione per consentire la

defibrinazione (viene privato della fibrina). Il sangue rimane così scoagulato. Viene poi aggiunto dell’agar,

ottenendo così l’agar sangue.

Per crescere, alcuni patogeni (come il Neisseria sp.) necessitano la lisi dei globuli rossi, che viene effettuata

l’agar-cioccolato.

tramite il calore. Di conseguenza vengono liberate ulteriori sostanze nutritizie ottenendo

• Terreni di arricchimento: sono in genere terreni liquidi e consentono la crescita selettiva di un particolare

brodo di selenite

batterio. Tra questi c’è il per la crescita delle salmonelle e delle shighelle presenti in

campioni fecali. I campioni fecali sono ricchi di specie batteriche e alcune di queste riescono a replicarsi e

crescere più facilmente rispetto ad altre. Se non si mettessero questi campioni in terreni particolari, la flora

microbica normale potrebbe prevalere e impedire la crescita di altre specie fondamentali per una diagnosi

corretta.

Terreni selettivi:

• sono simili ai terreni di arricchimento, ma sono solidi. Inibiscono la crescita di alcuni

batteri ed essendo solidi permettono di isolare la specie batterica che riesce a crescere su quel tipo di

terreno. Tra questi vi è l’agar-MacConkey, arricchito di sali biliari che inibisce la crescita dei Gram-positivi. Il

terreno MSA (Mannitol Salt Agar) che consente solo la crescita degli stafilococchi.

Terreni differenziali:

• consentono di distinguere microrganismi differenti che crescono sullo stesso terreno,

perché contengono dei coloranti che durante la crescita batterica possono conferire un colore particolare

alle colonie batteriche. Tra questi si ha l’agar-MacConkey - consente di differenziare quei batteri che sono in

grado di fermentare il lattosio. I batteri che fermentano il lattosio acidificano il terreno e le colonie diventano

fucsia, mentre gli altri batteri restano incolori.

Anche l’agar-sangue è considerato un terreno differenziale, poiché se vengono seminati dei batteri emolitici

si potrà vedere un cambiamento del terreno al di sotto delle colonie. I batteri (streptococchi alpha o beta

emolitici per esempio) possono compiere diversi tipi di emolisi:

Alpha Beta Gamma

Lisi parziale dei globuli rossi - il Lisi completa - il terreno da Lemolisi non avviene - le

terreno diventerà più chiaro. rosso diventerà trasparente colonie crescono e il terreno

rimane inalterato.

terreno di Baiard e Parker,

Si ha poi il il quale consente di visualizzare le colonie di S. aureus perché

crescono nerastre con un alone chiaro per la presenza della lecitinasi.

19 Terreni liquidi

Agar sangue

Agar cioccolato

Agar MacConkey - le colonie fucsia sono quelle dei

batteri in grado di fermentare il lattosio.

2. FATTORI AMBIENTALI

Temperatura

Tutti i batteri crescono in uno specifico range di temperatura dove il loro optimum (temperatura ottimale) è

vicino alla soglia superiore. Questo perché gli enzimi, che sono di natura proteica, funzionano meglio a una

determinata temperatura. Le temperature più alte favoriscono generalmente l’attività enzimatica, oltre una

certa soglia però gli enzimi vengono inattivati e denaturati.

In base al range ottimale di crescita dei batteri possiamo classificarli in 3 categorie:

• Psicrofili (freddo): optimum a 15-20°C, (alcuni batteri riescono a crescere anche a temperature inferiori,

come -8°C, ossia batteri che vivono negli ambienti artici);

Mesofili:

• optimum a 20-40°C, sono tutti quei batteri patogeni per uomo e animali per la loro temperatura

corporea compresa nel range - di interesse medico;

Termofili:

• optimum sopra i 40°C, ritrovati in acque termali o geyser dove le temperature arrivano fino a

90/250°C). Hanno proteine termostabili, cioè che non si degradano ad elevate temperature. È proprio da

viene isolata una polimerasi e che viene utilizzata in PCR.

essi che

La refrigerazione o congelamento dei batteri ne arresta la crescita, ma non li uccide.

Ossigeno

L’O è fondamentale per i processi di respirazione, ma i batteri che non lo utilizzano come fonte di energia

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(fermentazione) possono farne a meno. Sulla base della necessità di ossigeno i batteri si possono

classificare in:

Aerobi