Basi molecolari dell'attività di farmaci biotecnologici

MUTAGENESI IN VIVO

Inserzione o delezione di una o più basi→ se non è multipla di 3 determina uno scivolamento del modulo di

lettura (frame-shift).

Sostituzioni di singole basi:

la sostituzione non modifica l’aa codificato (es. TGC→

- Silente→ TCC, codificano per Ser)

la sostituzione modifica l’aa codificato (es. TCG→

- Missenso→ ACC, Ser→Thr)

- Nonsenso→ la sostituzione modifica un codone per un aa in codone stop (TCC→TAG, Ser→ stop)

PROTEINE INGEGNERIZZATE NELLA GLICOSILAZIONE

Agisco a livello post traduzionale, posso modificare sia il tipo di zucchero sia quanti residui glicosidici ho a

livello della mia proteina e in quali posizioni.

Modifica intenzionale del tipo di zucchero e grado di ramificazione delle catene glicosidiche→

potenziamento emivita, attività e stabilità.

Si usano linee cellulari di mammifero.

Es: - Ablazione gene fucosiltransferasi→ produzione di Ac monoclonali con ASP297 priva di fucosio,

aumenta l’affinità di legame per cellule effettrici e attività citotossica (elimino la modifica post

traduzionale spegnendo la sequenza codificante a livello della cellula)

- Produzione di vaccini umani glicoconiugati→ alcune proteine antigeniche devono essere coniugate

per avere un’efficace attivazione del sistema immunitario e garantire una risposta adeguata

soprattutto in determinate categorie di pz (modifico il pattern di glicosilazione, aumento)

EPO ricombinante con due addizionali siti di glicosilazione, aumenta l’emivita

- Darbepoietina alpha→

di 2-3 volte (farmaco usato in caso di anemia→ frequenza minore di somministrazione)

PROTEINE DI FUSIONE

Tramite manipolazione del DNA si creano proteine chimera (unione nello stesso vettore di espressione di 2

spaziate da un’apposita sequenza, linker).

o più geni codificanti per due o più proteine

Miglioro l’attività terapeutica (es. miglioro la selettività aggiungendo una porzione che mi assicura che la

mia proteina venga portata in situ dove c’è la cellula bersaglio) o il profilo farmacocinetico.

Es: - Proteine di fusione per targeted delivery→ Fv-citochina, Fv-tossina, ligando-tossina

- Proteine di fusione con dominio Fc→ sRec-Fc, ligando-Fc

PROTEINE AD USO TERAPEUTICO

1. Proteine ricombinanti con attività enzimatica→ sostituzione di una proteina mancante anomala (es.

insulina), potenziamento di un processo biologico già esistente che viene sottostimato (es. EPO),

induzione o predisposizione di una nuova funzione in un dato processo cellulare (es. tPA)

2. Proteine terapeutiche contenenti domini di legame→ regolazione delle attività fisiopatologiche (es.

modulazione in positivo o negativo del sistema immunitario), rilasciamento del principio attivo in un

distretto specifico (es. Ac coniugati a farmaci o radioisotopi, proteine di fusione)

3. Vaccini a proteina

4. Proteine per diagnostica 20

ANTICORPI (per l’attività)

Nella loro struttura ci sono le catene leggere e quelle pesanti ognuna con porzioni conservate

e quelle variabili (per il legame alla proteina→ interazione tra aa ed epitopi Ag).

Nei tratti variabili VL-VH si riconoscono le regioni determinanti la

complementarietà (CDR).

Nella porzione CH2 della catena pesante si trovano porzioni

responsabili delle funzioni effettrici.

Sito di legame per il fattore C1q del complemento→ attività citotossica

dipendente dal complemento CDC

Sito di legame per il recettore IgG espresso da cellule effettrici

dell’immunità (es. macrofagi)→ citotossicità mediata da cellule e

dipendente da Ac ADCC

Il legame Ag-Ac è monospecifico e la capacità di legare più di una molecola di Ag è detta avidità.

Risposte avverse che limitano l’impiego terapeutico degli Ac mediante ibridazione somatica:

- Inefficienza funzioni effettrici in un organismo umano (omologia umano-murino)

risposta immunitaria verso l’Ac stesso con riduzione della risposta biologica alla

- Immunogenicità→

terapia e formazione di immunocomplessi che stimolano reazioni immunologiche

- Breve emivita

Ac chimerico→ porzioni costanti L e H codificate da sequenze isolate dal genoma umano.

Ac umanizzato→ 5-10% della sequenza è di origine murina.

La derivazione dell’Ac la ritrovo nella nomenclatura→ mo murino, xi chimerico, zu umanizzato e u umano.

Se non li produco con l’ibridazione somatica posso usare la tecnica del Phage Display (→ libreria umana di

Ac umani per selezionare l’Ag di interesse).

Un virus attacca un batterio aderendoci, penetra all’interno e integra il proprio materiale genetico. Sfrutta il

macchinario di traduzione e trascrizione del batterio per produrre le proteine, dopo aver replicato

abbastanza proteine causa la morte del batterio per lisi.

Questo virus viene sfruttato per inserirci le sequenze codificanti frammenti anticorpali. Combino in vitro le

catene pesanti e leggere. Faccio tanti frammenti anticorpali con le mutazioni (ScFv→ riguardano sempre le

porzioni variabili implicate con il legame con l’Ag). Sfrutto il fago come vettore→ sono comodi perché

DNA esogeno senza alterare l’efficienza di replicazione e di assemblaggio (largamente

possono inserire

usati per fare grandi numeri di sequenze). 21

Il DNA esogeno viene inserito nel vettore facendo un costrutto di fusione, le sequenze vengono messe in

modo da essere presentate all’estremità N-terminale della proteina fagica (a monte del gene che codifica

per una delle proteine del capside). Fasi:

1. Creazione di una library di frammenti anticorpali

2. Creazione del fago per il clonaggio (un gene che codifica per il frammento Ac introdotto a monte di

un gene che codifica per una delle proteine del capside)

3. Il fago esprime la proteina sulla superficie (ogni fago un frammento di ScFv differente)

cicli di selezione dei frammenti ad alta specificità e affinità verso l’Ag di interesse

4. Biopanning→

Sul fondo di una piastra ho, adese, delle proteine di interesse (es. per Sars-Cov-2 ho sul fondo

come proteina antigenica Spike), metto a incubare la libreria fagica per un certo periodo di tempo

così da avere il legame. Poi faccio dei cicli di lavaggio e vedo quali rimangono attaccati (ripeto più

volte il ciclo con condizioni sempre più stringenti di lavaggio, es. lavaggi più numerosi o detergenti

più forti…)

5. Selezione dei frammenti Ac di interesse, sequenziamento del DNA (→ per capire esattamente quale

frammento è quello che è rimasto legato)

6. Produzione di larghe quantità di frammenti Ac di interesse (utilizzando anche lo stesso fago) dopo

aver individuato il frammento corretto, sfruttando la tecnologia del DNA ricombinante

Modificazioni degli Ac monoclonali:

Varianti proteiche per aumentare l’affinità e l’attività diretta sull’Ag→

- agisco sulle regioni

determinanti la complementarietà (CRD). Trovo il mutante con maggiore affinità.

Es. Trastuzumab Ac contro l’Ag iperespresso dalle cellule tumorali soprattutto del seno, proteina Ag

recettore per il fattore di crescita (HER2)

- Ingegneria della glicosilazione→ riguarda un residuo della catena pesante, fondamentale per legare

l’Ag e innescare una risposta citotossica (asparagina 297). Se aggiungo un residuo di fucosio ho un

peggioramento, diminuisce l’affinità di legame e quindi la risposta citotossica. Uso linee cellulari

che vengono modificate per rimuovere l’enzima fucosiltransferasi così da produrre Ac

(CHO) che legano in maniera più affine l’Ag

monoclonali

INGEGNERIA Ac

Sfrutto il fatto che hanno diversi domini così da selezionare quello di interesse→ sfrutto la porzione

variabile per avere selettività verso l’Ag tumorale (ScFv), coniugandola a qualcosa che porti l’azione

antitumorale o utilizzo una porzione più piccola di Ac da coniugare ad un radioisotopo per fini diagnostici…

Ac BiTE (bispecific T-cell engagers) Utilizzo dei frammenti eterologhi uniti da ponti peptidici sintetici così

da avere una selettività di azione e attivare in maniera efficace una

risposta citotossica. È importante attivare la risposta citotossica

mediata dai linfociti T bypassando la necessità che si avrebbe di

altri recettori perché già metto dentro (nel frammento) qualcosa che

riesce a stimolare in maniera efficace il linfocita.

Riconosce due frammenti Ag e attiva i linfociti T ad azione

citotossica. Sono diretti contro:

- CD3 (proteina di membrana facente parte del complesso macromolecolare (multiproteico) del

recettore delle cellule T)→ innesco la risposta citotossica

- Ag tumorale (es. CD19 nei linfomi, EGFR nei carcinomi)

Va trovato ciò che differenzia la cellula sana da quella tumorale così da avere la migliore terapia. 22

Creo e attivo la sinapsi citolitica→ creo dei legami stretti tra il linfocita T e la cellula tumorale attivando il

linfocita a rilasciare sostanze tossiche che inducano apoptosi della cellula tumorale.

Ac CONIUGATI A PICCOLE MOLECOLE

Possono essere coniugati a:

- Radio isotopi (radioimmunoconiugat)i→ Ac coniugati a radionuclidi. Scintigrafia: isotopi a emissione

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gamma I, preferiti i frammenti Ac (Ac con emivita più bassa, non ci interessa che permanga

nell’organismo, è per scopo diagnostico).

In terapia si usano isotopi a maggior raggio d’azione e emivita più lunga (effetto bystander).

Coniugo a porzioni a più alto PM di Ac

- Farmaci→ legame a principi attivi molto tossici direzionati al bersaglio tumorale. Molecole linker per

(più sicuro, sono già all’interno della cellula

coniugare farmaci-Ac studiati per il rilascio intracellulare

tumorale).

Es. Gemtuzumab ozogamicina→ specificità verso le cellule leucemiche data dalla porzione di Ac

che lega l’antigene (CD33) + l’utilizzo di un linker idrazonico specifico (con ponti disolfuro sulle lisine

+ calicheamicina che induce taglio al dsDNA) che viene idrolizzato a pH lisosomiale (circa 5)

Riduco l’effetto bystander→ possibile effetto sulle cellule non tumorali.

Ac CONIUGATI A PROTEINE

Sono generati dall’unione in un unico gene ricombinante delle sequenze nucleotidiche codificanti i due

singoli peptidi, collegati tra loro da una sequenza che li lega detta linker.

- Immunotossine→ molecola di struttura ibrida costituita da un Ac (o meglio ScFv) al quale viene

legata in forma covalente una molecola di tossina (di origine vegetale o batterica) che verrà

veicolata sulla cellula bersaglio e avrà azione tossica (dopo il contatto penetra nel citoplasma e

inibisce la sintesi proteica). Non c’è una funzione effettri