Basi molecolari

Basi molecolari dell'attività dei farmaci biotecnologici

Introduzione

Possiamo distinguere 2 tipologie principali di farmaci. Per farmaci tradizionali s'intendono molecole ottenute mediante processi di sintesi chimica industriale, tramite reazioni chimiche note standardizzate dove i reagenti sono esposti a specifiche condizioni chimico-fisiche (temperatura, pressione, etc). Tali reazioni chimiche possono essere ripetute all'infinito in presenza dei reagenti e delle specifiche condizioni chimico-fisiche. Le reazioni chimiche utilizzate per la sintesi dei farmaci tradizionali non richiedono sistemi biologici (cellule, enzimi, etc).

I farmaci biologici sono sostanze che non è possibile sintetizzare tramite reazioni chimiche ma che vengono prodotti in laboratorio all'interno di sistemi viventi, ovvero le cellule. Possiamo ricordare gli anticorpi monoclonali, ormoni (es. insulina), i fattori di regolazione dell'immunità, i vaccini o le eparine. Possono essere ottenuti tramite processi di estrazione e purificazione da sistemi cellulari sottoposti a processi di ingegneria genetica o per modificazioni artificiali (es. fusione cellulare). Nella maggior parte dei casi, avremo l'introduzione di DNA esogeno che andrà a codificare per determinate proteine di interesse terapeutico.

Esempi di biotech

• Insulina (1982): il primo farmaco biotecnologico, prodotto attraverso la purificazione delle due catene A e B dell'insulina dopo trasduzione genica da parte dei batteri.
• Ormone della crescita (1983).
• Vaccino per l'epatite B (1986).

Oggi i farmaci biotecnologici costituiscono il 20% dei farmaci in commercio, il 50% di quelli in sviluppo e il 40% di quelli registrati. Vi sono varie differenze tra i farmaci tradizionali e biotecnologici:

1. Dimensione

I farmaci tradizionali sono piccoli, con PM che vanno dai 50-1000 Dalton. I farmaci biotech hanno un peso maggiore dell'ordine dei 5-200 kD e sono molto più complessi dal punto di vista chimico-strutturale. Se confrontiamo l'aspirina con l'interferone si nota subito la differenza di dimensione.

2. Sintesi

Per un prodotto farmaceutico tradizionale la sintesi, basandosi su reazioni chimiche note e standardizzate, è dipendente dall'esperienza dell'operatore; di conseguenza, la sintesi è altamente riproducibile. Inizia con substrati disponibili commercialmente. Per un prodotto biotecnologico la sintesi è dipendente da "tool" utilizzati, ovvero dalle cellule utilizzate (ceppi batterici, lieviti o linee cellulari di eucarioti superiori) che inoltre influenzano le modifiche post-traduzionali, per cui è altamente variabile da laboratorio a laboratorio.

3. Purificazione

Per un prodotto tradizionale si basa su pochi passaggi, in quanto il prodotto principale è il componente della reazione. Per i prodotti biotecnologici invece si basa su metodiche di estrazione da cellule procariote o eucariote, per cui risente di rese altamente variabili.

4. Stabilità

La stabilità dei prodotti farmaceutici va incontro a una degradazione con una cinetica di ordine I. La grandezza e la complessità delle molecole biotech rendono improbabile l'applicazione dello stesso principio degradativo, per cui non è facilmente prevedibile la farmacocinetica dei biotech.

5. Immunogenicità

In linea generale, possiamo affermare che i prodotti farmaceutici tradizionali possono scatenare dei fenomeni allergici, mentre i prodotti biotech non scatenano una reazione immunitaria visto che sono riconosciuti come self dal sistema immunitario. Tuttavia, a volte ci possono essere delle contaminazioni durante i processi produttivi, per cui comunque si può scatenare una risposta immunitaria. Oggi si sta cercando di produrre soprattutto anticorpi monoclonali, farmaci umanizzati, ma nonostante questo si sviluppano reazioni immunitarie. Quindi è vero che abbiamo l'assenza di immunogenicità, ma fino ad un certo punto.

Al di là delle complicazioni a livello della progettazione e dello sviluppo, i farmaci biotecnologici presentano diversi vantaggi rispetto a quelli tradizionali:

• Minore tossicità;
• Meccanismo d'azione noto;
• Azione più mirata e specifica (dunque maggiore sicurezza);
• Terapie personalizzate.

Per lo sviluppo dei farmaci biotech occorrono in media 10/12 anni prima che siano immessi sul mercato: necessitano di una lunga serie di esami e dell'approvazione della EMA (European Medicines Agency) nell'UE e della FDA (Food and Drug Administration) negli USA. La probabilità per una nuova molecola in fase avanzata di studio preclinico di entrare in commercio è del 10%, invece per proteine terapeutiche è del 40%. Questo perché la molecola di sintesi sarà stata testata attraverso studi in vitro, ma magari in vivo non avrà lo stesso effetto e non riuscirà a entrare in commercio; con le proteine terapeutiche, invece, difficilmente si ha un effetto off-target.

Ricordiamo alcune classi di farmaci biotecnologici

I farmaci biotecnologici vengono inoltre classificati in I e II generazione.

I farmaci biotecnologici di I generazione

Sono, in genere, proteine native prodotte con la tecnica del DNA ricombinante, da utilizzare come tali per semplice terapia di sostituzione (es. insulina, ormone della crescita) o in particolari stati fisiologici (es. eritropoietina) o patologici.

I farmaci biotecnologici di II generazione

Sono proteine naturali modificate (mutazione di singoli o pochi aa, iperglicosilazione, peghilazione) che mantengono la stessa attività biologica ma hanno un migliorato profilo di efficacia/tollerabilità o un profilo farmacocinetico più idoneo. In questa generazione ritroviamo soprattutto gli anticorpi monoclonali: un esempio è l'infliximab, anticorpo monoclonale contro il TNF-α.

È necessario ricordare anche i biosimilari

Quando scade il brevetto per un farmaco tradizionale, si parla di generici perché tutte le compagnie farmaceutiche possono iniziare a produrlo. Per i biotech questo è un problema: si parlerà di biosimilari, perché non ci sarà mai un farmaco che sarà uguale al biotech di partenza. Quando si vende il biosimilare bisogna essere sicuri che abbia lo stesso effetto terapeutico e l'assenza di effetti tossici, quindi deve essere testato e deve soprattutto essere approvato dall'EMA: l'obiettivo sarà, quindi, non tanto ottenere un biosimilare identico strutturalmente al biotech originale ma ottenere due molecole che si comportino in maniera simile dal punto di vista biologico, farmacologico e terapeutico (rispettare criteri di biosimilarità).

Come abbiamo detto, il primo biotech prodotto fu l'insulina biotecnologica

È un ormone polipeptidico, prodotto dalle cellule β delle isole di Langerhans del pancreas. Viene usata dalle persone affette da diabete, di cui ne esistono due tipologie. Il diabete di tipo 1 o diabete insulino-dipendente è una malattia autoimmune: a un certo punto, gli anticorpi iniziano ad attaccare le cellule β del pancreas e non si produce più insulina. Compare soprattutto nei giovani, determinando chetosi. Viene trattato con insulina esogena.

Il diabete di tipo 2 o insulino-indipendente si sviluppa soprattutto negli adulti obesi. L'insulina viene prodotta ma abbiamo un'insensibilità recettoriale e di conseguenza non viene esposto il trasportatore GLUT negli organi insulino-dipendenti. Non si ha chetosi, ha una valenza ereditaria, può essere tenuto sotto controllo con dieta ed esercizio fisico e viene trattato con degli antidiabetici orali.

Prima degli anni '80, l'insulina era ottenuta per purificazione dal pancreas suino e bovino

L'insulina bovina e suina presentano delle differenze da quella umana: nella catena B dell'insulina bovina la treonina è sostituita da un'alanina, mentre in quella suina la treonina e l'isoleucina sono sostituite rispettivamente da un'alanina e una valina. Tali differenze amminoacidiche possono ovviamente provocare reazioni immunitarie. Inoltre, bisogna considerare il fatto che c'era il rischio di trasferimento di virus perché il pancreas di questi animali potrebbe essere contaminato con virus e batteri. Infine, ci sono degli alti costi di estrazione e purificazione.

Produzione di insulina biotecnologica

Si è cercato di risolvere questi problemi con la produzione di insulina biotecnologica, e questo fu possibile tramite la tecnica del DNA ricombinante.

• DNA ricombinante

Il DNA ricombinante è alla base delle moderne biotecnologie. Con il termine DNA ricombinante si indica una molecola di DNA modificata in cui sono inseriti altri frammenti provenienti da DNA di organismi diversi. Si ottengono così frammenti di DNA di piccole dimensioni da modificare e da analizzare, grandi quantità di questi frammenti, se ne può conoscere la sequenza e si possono produrre grandi quantità di proteine.

Tutto ciò si basa sul clonaggio che prevede diversi passaggi: l'estrazione del DNA, la costruzione della molecola di DNA ricombinante, la trasformazione, la selezione della colonia di interesse, l'espansione e la purificazione del DNA plasmidico.

Per trasferire un frammento di DNA da un organismo all'altro o per ottenere più copie del frammento d'interesse (clonazione) si utilizzano molecole di DNA vettore: potrà essere un plasmide, virus fagi, Agrobacterium tumefaciens.

I vettori devono soddisfare alcuni requisiti:

• Replicarsi in modo indipendente nella cellula ospite;
• Avere dimensioni tali da poter essere manipolati;
• Presentare marcatori generici per rilevarne la presenza (es. geni per la resistenza agli antibiotici): in questo modo, si è in grado di individuare i batteri in coltura che presentano il DNA ricombinante d'interesse. Per esempio, si può introdurre il gene resistente all'ampicillina e, quindi, se si aggiunge ampicillina nel terreno di coltura resisteranno soltanto i batteri/vettori che hanno nel plasmide quel marcatore;
• Presentare una o più sequenze di restrizione per il riconoscimento con enzimi di restrizione: sono gli enzimi che tagliano il DNA in maniera precisa e riproducibile e che quindi aprono il plasmide e, attraverso le DNA ligasi, posso legare il gene d'interesse.

I plasmidi sono piccole molecole di DNA circolare a doppio filamento con due o pochi geni, presenti nei batteri e che si duplicano in maniera autonoma, conferendo ai batteri vantaggi selettivi. Esistono diverse tipologie di plasmidi:

• Degradativi, per metabolizzare sostanze tossiche;
• Col, i quali codificano per le colicine che uccidono altri batteri;
• Della virulenza, che trasformano l'ospite in patogeno;
• F, che consentono lo scambio di materiale genetico;
• R, contenenti geni che conferiscono resistenza a determinati antibiotici, poiché codificano per enzimi che inattivano il farmaco/riducono gli effetti del farmaco.

Gli enzimi di restrizione tagliano entrambi i filamenti di DNA in corrispondenza di specifiche sequenze nucleotidiche, dette palindromiche, lunghe 4-8 basi, e dette siti di restrizione. Ne esistono diverse tipologie a seconda della sequenza palindroma nucleotidica riconosciuta. Ad esempio, l'EcoR1 riconosce la sequenza GAATTC/CTTAAG e taglierà il DNA tra la G e la A. Le estremità di taglio potranno essere piatte (blunts ends, come con l'HpaI) o coesive (sticky ends, come con l'EcoR1).

Tali enzimi permettono di isolare un frammento di DNA compreso tra due sequenze di taglio, per esempio un gene, dal resto della molecola di DNA, per inserirlo con l'aiuto della DNA ligasi in una molecola di DNA ricevente. Si creano così molecole di DNA ricombinante.

Quindi: si tagliano il vettore e il DNA del cromosoma con enzimi di restrizione, che riconoscono le sequenze e producono il taglio, frammentando così il DNA in molti frammenti con brevi regioni a filamento singolo chiamate estremità coesive. Tali estremità si uniscono tra loro tramite legami H grazie alle sequenze complementari: il frammento di DNA, contenente il gene da studiare, si è così inserito nel vettore. Con l'aggiunta di DNA ligasi si saldano le interazioni e il vettore possiede anche il DNA cromosomico.

Per produrre il DNA esogeno si può partire dal DNA, dal cDNA (complementare a un filamento di mRNA della proteina di interesse) o tramite la reazione a catena della polimerasi PCR. Rappresenta una tecnica adottata per copiare molte volte in vitro una specifica sequenza di DNA, partendo anche da quantitativi esigui come una sola molecola.

La PCR ricostruisce in vitro uno specifico passaggio della duplicazione cellulare: la ricostituzione (sintesi) di un "completo" segmento di DNA (a doppia elica) a partire da un filamento a singola elica. Il filamento mancante viene ricostruito a partire da una serie di nucleotidi che vengono disposti nella corretta sequenza, complementare a quella del DNA interessato. Questo processo viene svolto in natura da enzimi chiamati DNA-polimerasi.

È possibile quindi ricostruire le condizioni che portano alla formazione dei nuovi segmenti di DNA, ponendo in soluzione:

• Una quantità, anche minima, del segmento di DNA che si desidera riprodurre;
• Una quantità opportuna di nucleotidi liberi per costituire i nuovi filamenti;
• Oppurtni "inneschi", detti primer, costituiti da brevi sequenze di DNA (oligonucleotidi) complementari alle estremità 5' e 3' dei due filamenti del segmento da riprodurre;
• Una DNA polimerasi termo-resistente (non è necessario che provenga dallo stesso organismo di cui si deve replicare il DNA);
• Un tampone che serve a mantenere stabile il pH adatto alla reazione.

Per avviare la reazione della polimerasi (a partire dal primer 5') è prima necessario provvedere alla separazione dei filamenti del DNA (fase di denaturazione) e alla creazione del legame tra i primer e le regioni loro complementari dei filamenti di DNA denaturati. Questo processo risulta però incompatibile con la DNA polimerasi umana, che viene distrutta alle temperature necessarie alla denaturazione (96-99 °C).

Per ovviare a questo inconveniente, si fa ricorso alle polimerasi appartenenti a organismi termofili che non sono inattivate dalle alte temperature, ad esempio la Taq-polimerasi. Ciò consente di realizzare più cicli di PCR in sequenza, in ciascuno dei quali viene duplicato anche il DNA sintetizzato nelle fasi precedenti, ottenendo una reazione a catena che consente una moltiplicazione estremamente rapida del materiale genetico di interesse.

Dopo la PCR si effettua un'elettroforesi su gel di agarosio che permette di separare i filamenti di DNA di dimensioni diverse, sfruttando la carica negativa del DNA. Così si individua il DNA d'interesse.

Quindi un vettore di espressione comprende la sequenza necessaria per la trascrizione e traduzione da parte della cellula ospite; il gene estraneo viene inserito in corrispondenza di un sito di restrizione nel vettore. Le cellule batteriche vengono poi trasfettate con il vettore di espressione e il gene viene espresso.

I plasmidi che hanno incorporato il gene esogeno possono essere inseriti in cellule batteriche e duplicarsi insieme ad esse, producendo molte copie del gene clonato. Alcuni plasmidi possono anche permettere l'espressione del gene e quindi produrre la proteina in elevate quantità.

Prima di inserire il DNA nel plasmide, occorre sequenziare il DNA per essere sicuri che la molecola in questione sia quella che ci si aspetta. Sequenziare il DNA significa scoprire la successione delle basi azotate di uno specifico tratto di DNA. Il primo metodo di sequenziamento è chiamato Sanger, elaborato nel '75. Si basa su una reazione in cui vengono aggiunti i nucleotidi e si creano sequenze complementari, che verranno riconosciute tramite laser fluorescente con cui si otterranno dei picchi che identificano una specifica base.

Spesso si sfrutta la tecnica della mutagenesi sito-specifica del DNA, tramite cui è possibile mutare una o più basi del DNA. Tale tecnica permette di ottimizzare alcuni aspetti farmacocinetici di alcune proteine ricombinanti. Infatti, consente di cambiare o migliorare la funzione di un prodotto genico. La generazione e la caratterizzazione di mutanti è una componente essenziale nello studio della relazione tra funzione e struttura.

Trasferimento genico

Dopo aver prodotto il plasmide con il DNA ricombinante, occorre introdurlo nella cellula (batteri, lieviti o eucarioti superiori). Il trasferimento del DNA può avvenire tramite tre tecniche.

• Trasferimento diretto mediante mezzi fisici, ad esempio con microiniezioni su cellule in vitro o mediante bombardamento con microparticelle rivestite di DNA in vivo.
• Trasfezione tramite metodi sia chimici che fisici, ad esempio mediante sbalzi termici o campi elettrici (alterano la permeabilità) oppure utilizzando molecole lipidiche. Come molecole lipidiche si utilizzano i liposomi (vescicole fosfolipidiche sintetiche non cariche o cariche) che facilitano l'ingresso del DNA nella cellula, integrandosi con la membrana; è il metodo di trasfezione più efficiente e meno invasivo, ma molto costoso. Tale tecnica viene utilizzata anche per...