Appunti parziali di Genetica

Il sistema lattosio in E. coli

I batteri utilizzano come fonte di energia e di carbonio alcuni monosaccaridi, in particolare il glucosio. Una volta entrato nella cellula, il glucosio entra immediatamente in una via metabolica chiamata glicolisi, dalla quale si ottengono due molecole di acido piruvico a partire da una molecola di glucosio.

Oltre ai monosaccaridi, i batteri utilizzano anche i disaccaridi come fonte di energia e carbonio. Uno dei disaccaridi di interesse è il lattosio, formato dall'unione di una molecola di galattosio e una di glucosio. Da questo disaccaride si può ottenere il glucosio grazie all'azione dell'enzima β-galattosidasi.

Se delle cellule si trovano in presenza di glucosio e lattosio come fonti di energia, quale viene utilizzata prima? All'inizio viene utilizzato il glucosio e, una volta esaurito, c'è un periodo di latenza durante il quale la cellula si rende conto di aver esaurito il glucosio e inizia a cercare altre fonti di energia, come il lattosio.

altre fonti di energia. A questo punto viene usato il lattosio fino a quando questo non termina —> si raggiunge così un una soglia, plateau, dalla quale non si ha crescita cellulare. CRESCITA DIAUXICA.

Ma perché prima glucosio e poi lattosio?

Inizio anni ’60 —> ESPERIMENTO DI JACOB E MONOD: studiarono il metabolismo e il catabolismo dellattosio nel batterio di E.coli, tanto da ottenerne una spiegazione del modello ed inoltre portarono il primo esempio di regolazione dell’espressione genetica dei batteri, per i quali presero il premio Nobel.

Jacob e Monod iniziano a studiare il metabolismo del lattosio nel batterio di E.coli (attività sperimentale venivano utilizzate solo tecniche di genetica e biochimica). Sapevano che nel processo di degradazione dellattosio erano coinvolti 3 enzimi: la PERMEASI, proteina localizzata sulla membrana cellulare di E.coli e che quindi permette l’ingresso del lattosio, presente nell’ambiente.

esterno (non entra per diffusione passiva ma è necessario tale proteina).

TRANSACETILASI: trasferisce un gruppo acetilino dall'acetil-coA al lattosio.

• che ha 2 funzioni: trasforma il lattosio in allolattosio (legame tra il C1 e il β-GALATTOSIDASI: β-glicosidicoC6) e l'altra funzione invece è quella di scindere il lattosio in 2 molecole, ovvero il galattosio e il glucosio.

Quest'ultimo processo richiede molta energia poiché si tratta di un legame covalente.

DESCRIZIONE DELL'ESPERIMENTO - ANALISI BIOCHIMICA:

A quell'epoca era già possibile fare un saggio enzimatico che potesse affermare se fosse prendente o meno l'attività di all'interno di una coltura cellulare. Per fare un saggio enzimatico di una β-galattosidasi proteina/enzima: si prendono delle cellule, si lisano, in modo tale che gli enzimi all'interno della cellula risultano liberi, gli si fornisce un substrato e si va a valutare

se il substrato viene trasformato nel prodotto della reazione, che solitamente è una molecola cromogena. Quindi la concentrazione di β-galattosidasi corrisponde alla quantità di substrato che viene convertito in uno dei suoi prodotti. Uno dei primi esperimenti era quello di valutare l'attività della β-galattosidasi in diverse condizioni sperimentali, cioè facendo crescere le cellule di E.coli in terreni contenenti fonti di C diverse.

In questo primo esperimento si prende una beuta con terreno liquido minimo contenente una certa fonte di energia e vengono inoculate delle cellule di E.coli. La beuta viene incubata a 37°C per un certo numero di ore. A tempi diversi si preleva un'aliquota di questa e il resto continua ad essere incubata. Le cellule della coltura che viene prelevata viene lisata e si va a vedere se c'è un'attività della β-galattosidasi.

1. Prendono una beuta con un terreno minimo contenente SOLO

GLUCOSIO, prelevano delle aliquote a tempi diversi e saggiano l'attività dell'enzima. Vedono che l'attività della non è nulla, ma β-galattosidasi è molto bassa e costante se veniva ripetuto l'esperimento.

A questo punto centrifugano la coltura (buttano via il soprastante che è costituito dal terreno minimo contenente glucosio) e risospendano le cellule in un terreno minimo contenente SOLO LATTOSIO. Tale coltura viene incubata a 37°C e poi viene saggiata a tempi diversi l'attività della β-galattosidasi. Osservarono che con il passare del tempo l'attività dell'enzima aumenta nella coltura e dopo aver raggiunto un valore, valore massimo, rimane costante nel tempo.

A questo punto aggiungono all'interno della coltura del GLUCOSIO, in modo tale che la coltura sia simultaneamente in contatto con glucosio e lattosio. Osservarono che per un certo periodo di tempo l'attività

La concentrazione dell'enzima β-galattosidasi rimane costante per un certo periodo di tempo, ma dopo questo periodo l'attività dell'enzima diminuisce fino a tornare al livello iniziale. Questo esperimento evidenzia tre concetti fondamentali, sui quali è necessario chiedersi il perché e il come:

1. L'enzima β-galattosidasi è INDUCIBILE, ovvero la sua attività è indotta dalla presenza del lattosio come unica fonte di carbonio ed energia.
2. La PRESENZA DEL LATTOSIO è una condizione necessaria ma non sufficiente per l'induzione dell'enzima. È necessaria anche l'assenza di glucosio.
3. Una attività (seppur blanda) dell'enzima è presente anche in presenza di glucosio.

Se viene ripetuto lo stesso esperimento saggiando anche la PERMEASI e la TRANSACETILASI, si ottiene la stessa curva. Ciò significa che tutti e tre gli enzimi sono INDUCIBILI e CO-REGOLATI.

(altrimenti ogniuno di loro avrebbe una cinetica diversa). Perché la è INDUCIBILE? Sintetizzare un enzima in grandi quantità quando non è necessario β-galattosidasi è uno spreco di energia. Quindi le cellule attivano la sintesi di certi enzimi solo se necessari. Perché la PRESENZA DEL LATTOSIO è una condizione necessaria ma non sufficiente affinché si abbia l'induzione della β-galattosidasi? Anche questa domanda è legata all'ottimizzazione dell'energia. Ovvero, il β-galattosidasi? Lattosio serve a produrre, tramite l'attività della galattosio e glucosio, utilizzato poi nella β-galattosidasi, glicolisi per ottenere energia. Questo processo però richiede un grande dispendio di energia e quindi se è già presente glucosio e lattosio all'interno della cultura non è necessario che il lattosio venga degradato in glucosio. Perché c'è un'attività

blanda della in presenza di glucosio? Si tratta di un significato β-galattosidasi biologico: perché sulla superficie cellulare ci sono delle permeasi che permettono l’entrata del lattosio, in assenza di queste il lattosio non può entrare. Quindi in condizioni di assenza di queste molecole superficiali, la cellula deve comunque possedere una piccola quantità di enzimi per la degradazione del lattosio. Perché i 3 enzimi sono tutti indicibili e co-regolati? Perché servono tutti e 3 nello stesso momento per per degradare il lattosio, quando quest’ultimo è l’unica fonte di carbonio e di energia. ANALISI GENETICA Avevano a disposizione 3 diversi ceppi di E.coli. Fenotipo Lac+ —> gli enzimi del metabolismo del lattosio in presenza di lattosio presentavano un alta attività, mentre era blanda o addirittura assente in presenza di glucosio o di entrambi. Fenotipo Lac- —> ceppi di E.coli che erano incapaci di usare il lattosio.lattosio. Se invece abbiamo una mutazione in LacO, ci sarà una mancata repressione dei geni e quindi un'espressione costitutiva dei 3 enzimi del metabolismo del lattosio. Il controllo negativo dell'espressione dei geni avviene grazie all'azione di un repressore e del gene che lo codifica. Il repressore si lega al sito operatore (LacO) presente nel promotore dei geni del metabolismo del lattosio, impedendo la trascrizione degli stessi. In presenza di lattosio, il lattosio si lega al repressore, causando un cambiamento conformazionale che lo rende incapace di legarsi al sito operatore. Di conseguenza, la trascrizione dei geni del metabolismo del lattosio può avvenire. Jacob e Monod hanno mappato le mutazioni che causano il fenotipo Lac© sul cromosoma batterico. Questo processo consiste nel determinare l'ordine relativo dei geni sul cromosoma. Le mutazioni che danno il fenotipo Lac© sono state mappate in due regioni diverse ma molto vicine del cromosoma, chiamate LacI e LacO. In conclusione, il controllo negativo dell'espressione dei geni del metabolismo del lattosio avviene grazie all'azione di un repressore e del gene che lo codifica. Le mutazioni in LacI e LacO possono causare un fenotipo Lac©, caratterizzato da un'espressione costitutiva dei geni del metabolismo del lattosio.

L'attività della β-galattosidasi è regolata dalla presenza di lattosio e lo stesso avviene nel caso in cui venga colpita la sequenza LacO —> fa sì che la cellula diventi costitutiva per gli enzimi.

Se il controllo negativo viene effettuato da un repressore che blocca la trascrizione dei geni che codificano i 3 enzimi, si ha come ipotesi che una delle due regioni codifica il repressore mentre l'altra è la sequenza alla quale si lega il repressore per bloccare la trascrizione. Abbiamo, a questo punto, due scenari:

1. È che Lac I codifica il repressore e questo, una volta sintetizzato, si muova liberamente nel citoplasma per poi legarsi a LacO e bloccare la trascrizione dei geni responsabili alla sintesi degli enzimi del metabolismo del lattosio.
2. È che Lac O codifica il repressore che dopo essere sintetizzato si lega a LacI.

Oltre al Lac©, studiano anche i mutanti Lac-. 8 Tipi di mutanti:

• Alcuni tipi di mutanti non hanno attività per la β-galattosidasi, ma hanno attività della

permeasi e dellatransacetilasi. Quindi questi mutanti erano nel solo gene che codifica la β-galattosidasi. Dunque tutti i mutanti Lac- con tale comportamento risultavano alterati nel gene codificante la β-galattosidasi. Loro allora mappano le mutazioni di tutti i mutanti Lac- in cui solo la β-galattosidasialterata. Trovano in tutti questi mutanti mappano per una regione detta Lac Z si trova vicino, alla destra,the Lac O.

Poi c'era altri mutanti in mancava unicamente l'attività della permeasi (quindi gli mancava il genecodificante essa). Mappando i mutanti mutati solo per la permeasi, trovarono che queste mutazioni eranovicino a LacZ, e conseguentemente chiamarono questo gene LacY.

Altri a cui mancava solo la transacetilasi, quindi mutati solo nei geni che codificanti quell'enzima. Mappando i mutanti solo per la transacetilasi, che la mutazione stava in gene vicino a LacY, chechiamarono LacA.

Dunque vicino a Lac si

trovavano i tre geni codificanti i tre enzimi. Quindi nonostante qualsiasi gene muti tra LacZ, LacY e LacA, otterremo sempre un mutante Lac-, che